萊茵衣藻對(duì)MeJA處理的初期響應(yīng)模式分析

賈彬，蘭成湘，李翔宇

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋藻類生物工程技術(shù)研究中心，廣東深圳 518071

光合微藻是單細(xì)胞真核生物，由于其生境廣泛［1］、光合效率高［2］、可適應(yīng)極端環(huán)境［3］，以及具有回收無(wú)機(jī)碳、氮的能力，在生產(chǎn)高價(jià)值化合物等方面廣受關(guān)注.微藻還是活性類異戊二烯的天然來(lái)源，如蝦青素［4］、β-胡蘿卜素［5］和巖藻黃質(zhì)［6］等.萊 茵 衣 藻（Chlamydomonas reinhardtii，C. reinhardtii）是目前分子研究最為深入的模式藻種之一［7］，在萊茵衣藻中，代謝工程手段已被用于生產(chǎn)高價(jià)值的異源類異戊二烯［8-11］，但由于內(nèi)源異戊二烯底物異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）與二甲基丙烯焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）的供應(yīng)不足導(dǎo)致異源萜產(chǎn)量低.因此，如何促進(jìn)異戊二烯底物供應(yīng)，以及研究異戊二烯的胞內(nèi)合成和積累機(jī)制成為萊茵衣藻異戊二烯工程亟待解決的問(wèn)題.

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）能夠激活茉莉酸信號(hào)通路，參與植物從種子萌發(fā)、根系生長(zhǎng)、幼苗發(fā)育、衰老等發(fā)育到防御反應(yīng)的許多生理過(guò)程，被廣泛用于植物次生代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)［12-14］，如酚類、類異戊二烯（青蒿素、紫杉醇和人參皂苷等）、黃酮類、生物堿（長(zhǎng)春花堿和尼古丁）和苯丙烷類等.研究發(fā)現(xiàn)，MeJA 能夠通過(guò)增強(qiáng)類異戊二烯的合成途徑基因表達(dá)，促進(jìn)產(chǎn)物的積累［15-17］.MeJA 處理能使萊茵衣藻中類異戊二烯化合物的合成基因表達(dá)改變［15］，導(dǎo)致三萜類化合物前體角鯊烯和（S）-2，3-環(huán)氧角鯊烯的積累［16］，誘導(dǎo)中央碳代謝和飽和脂肪酸代謝網(wǎng)絡(luò)改向，并選擇性改變氨基酸、黃酮類和生物堿的生物合成，雖然相關(guān)代謝物產(chǎn)量的變化在MeJA 處理1～2 d 后呈現(xiàn)，但植物體內(nèi)的分子應(yīng)答反應(yīng)卻非常迅速［17］.植物對(duì)內(nèi)源或者外源激素（特別是脅迫類激素）的刺激極為敏感，甚至在處理后的幾分鐘內(nèi)便在分子水平做出迅速的應(yīng)答反應(yīng).因此，研究萊茵衣藻在MeJA 處理后的初期響應(yīng)是發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)核心響應(yīng)基因的關(guān)鍵.萊茵衣藻的異戊二烯合成依賴于葉綠體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methnatureyl-D-rythritol-4-phosphate，MEP）合成途徑.本研究以h 為時(shí)間單位，探索萊茵衣藻在MeJA 處理初期的響應(yīng)特點(diǎn)，重點(diǎn)關(guān)注其生長(zhǎng)速度、光合效率、MEP途徑關(guān)鍵基因、類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因和甾醇類物質(zhì)合成途徑關(guān)鍵基因的變化規(guī)律，以期揭示MeJA 處理下萊茵衣藻的異戊二烯代謝的響應(yīng)，為研究微藻異戊二烯合成和代謝機(jī)制提供理論參考.

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)條件

萊茵衣藻UVM4 購(gòu)自美國(guó)衣藻資源中心（https：//www.chlamycollection.org）.培養(yǎng)條件為：tris-acetate-phosphate（TAP）培養(yǎng)基，溫度25 ℃，光照強(qiáng)度120 μmol/（m2·s），16 h/8 h光暗交替.

1.2 萊茵衣藻生長(zhǎng)狀態(tài)特征的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)［16］報(bào)道，當(dāng)MeJA 濃度達(dá)到1.0 mmol/L時(shí)會(huì)促進(jìn)異戊二烯途徑關(guān)鍵中間代謝物的積累，但也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生理產(chǎn)生負(fù)面影響，因此本研究使用3 種濃度（0.5、1.0 和1.5 mmol/L）處理萊茵衣藻.處理后，以h 為單位細(xì)胞計(jì)數(shù)反映MeJA 對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)特征的影響.同時(shí)，在處理后 0、24、48 和 72 h 后分別取 20 mL 藻液，離心收集細(xì)胞，置于烘箱烘干后測(cè)定細(xì)胞的質(zhì)量濃度.

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

使用Phytopam測(cè)試儀檢測(cè)萊茵衣藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù).取2 mL 處理后的藻液加入熒光比色杯，保持黑暗條件2 min 后進(jìn)行飽和脈沖光處理，測(cè)量PSII光化學(xué)還原的最大量子產(chǎn)率.使用飽和脈沖光處理120 s測(cè)量實(shí)際光合效率.

1.4 葉綠素與總類胡蘿卜素的測(cè)定

萊茵衣藻胞內(nèi)色素使用甲醇提取，并使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè).取2 mL經(jīng)MeJA處理后的藻液，離心后棄上清，收集藻細(xì)胞，加入2 mL 甲醇（體積分?jǐn)?shù)≥99%），混勻后于4 ℃放置24 h，離心取上清分別測(cè)定波長(zhǎng)為470、652 和665 nm 處的光密度值D（470）、D（652）和D（665），并通過(guò)式（1）—式（3）計(jì)算藻液中葉綠素a、葉綠素b與總類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度（ρ總，單位：μg/mL）.

1.5 MEP途徑與下游次生代謝產(chǎn)物合成途徑基因的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)

使用Trizol 法提取總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）.采用超微量分光光度計(jì)（Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific）測(cè)定RNA 樣品的質(zhì)量濃度和純度，每個(gè)樣品以1 μg 的總RNA 量使用Evo M-MLV（湖南艾克瑞）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)脫氧核糖 核 酸（complementary deoxyribo nucleic acid，cDNA）.將模板cDNA 稀釋10 倍后進(jìn)行使用SYBR?Green Premix Pro Taq HS 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒（湖南艾克瑞），以U4 核仁小分子核糖核酸（small nucleolar RNA，snoRNA）作為內(nèi)參，對(duì)MEP途徑關(guān)鍵基因（DXS、DXR、CMK、MDS和IDI）、類胡蘿卜素合成關(guān)鍵途徑基因（PSY、PDS、ZDS、CRTISO和CHYb）與甾醇合成關(guān)鍵途徑基因（FPPS、SQE、CAS、CYP51 和ERG4/24）進(jìn)行定量檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù).

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析與作圖，以非處理組為對(duì)照（control check，CK），并通過(guò)雙因素方差分析Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較.以P＜ 0.01 為差異顯著，以P＜ 0.001 為差異極顯著.本研究中數(shù)據(jù)均為用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差()表示(n= 3).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MeJA處理下的萊茵衣藻生長(zhǎng)與光合特征分析

不同濃度MeJA 處理時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)均受到程度抑制不同，結(jié)果見(jiàn)圖1（a）.隨著處理濃度的提高，藻細(xì)胞受到的抑制程度也越嚴(yán)重.當(dāng)MeJA 濃度達(dá)1.5 mmol/L 時(shí)，藻細(xì)胞死亡數(shù)量增加，處理72 h 后，存活細(xì)胞密度不足 5 × 105mL-1.MeJA 處理導(dǎo)致藻干質(zhì)量下降，且濃度越高，細(xì)胞干質(zhì)量下降越迅速，見(jiàn)圖1（b）.綜上所述，MeJA 對(duì)萊茵衣藻的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且抑制效果與其濃度成顯著正相關(guān).

圖1 不同濃度MeJA處理后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線與干質(zhì)量變化Fig.1 Growthcurveanddryweightof C.reinhardtii cells after treatment with different concentrations of MeJA

光合系統(tǒng)對(duì)微藻生長(zhǎng)和增殖有重要的生理意義.本研究檢測(cè)了MeJA 處理下萊茵衣藻的光合效率.結(jié)果顯示，在72 h 內(nèi)MeJA 處理組的最大光合效率和實(shí)際光合效率始終顯著低于CK 組，見(jiàn)圖2(b).其中，1.0 mmol/L 與 1.5 mmol/L MeJA 處理組的最大光合效率和實(shí)際光合效率在1 h 內(nèi)呈快速降低趨勢(shì)（圖2），且實(shí)際光合效率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)下降.該結(jié)果表明，高濃度MeJA 處理可快速降低萊茵衣藻的光合效率，對(duì)光系統(tǒng)造成不可逆的損傷，這可能是導(dǎo)致萊茵衣藻細(xì)胞增殖受到MeJA抑制的主要因素之一.

圖2 不同濃度MeJA處理后最大光合效率與實(shí)際光合效率的變化Fig.2 Changes of the maximum and actual photosynthetic efficiency after treatment with different concentrations of MeJA

2.2 MeJA處理可增強(qiáng)MEP途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)

MeJA 處理后，參與微藻MEP 途徑5 個(gè)基因（DXS、DXR、CMK、MDS和IDI）的表達(dá)模式如圖3.由圖3可見(jiàn)，MeJA處理增強(qiáng)了MEP途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的上調(diào)，且在不同濃度MeJA 處理下，MEP途徑基因具有不同的表達(dá)模式.其中，當(dāng)MeJA 濃度為1.0 mmol/L時(shí)，1 h與4 h上調(diào)幅度更高；而當(dāng)MeJA 濃度為1.5 mmol/L 時(shí)，則在24 h 時(shí)上調(diào)幅度更高.MeJA 濃度為1.0 mmol/L 的處理組在1 h 時(shí)，DXS與MDS基因表達(dá)上調(diào)最為顯著，分別上調(diào)至4.63倍與2.11倍；在4 h時(shí)，DXS基因表達(dá)上調(diào)至5.88倍.MeJA濃度為1.5 mmol/L的處理組在1 h與4 h 時(shí)，僅DXS基因表達(dá)顯著上調(diào)，分別上調(diào)至1.78 倍與 3.09 倍；在處理 24 h 時(shí)，DXS、DXR與CMK基因表達(dá)分別顯著上調(diào)至6.00、38.29 與5.85倍.

圖3 不同濃度MeJA處理后MEP途徑基因的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of MEP pathway genes after treatment with different concentrations of MeJA

2.3 MeJA 處理能降低胞內(nèi)光合色素和調(diào)節(jié)類胡蘿卜素合成基因表達(dá)

萊茵衣藻的光合色素、類胡蘿卜素和甾醇類等物質(zhì)的合成均依賴于MEP 途徑，而MeJA 處理能影響萊茵衣藻的MEP途徑，并抑制其光合系統(tǒng)活性.因此，本研究進(jìn)一步測(cè)定MeJA 處理下萊茵衣藻的光合色素質(zhì)量濃度變化以及類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)水平.

不同濃度MeJA 處理后，萊茵衣藻胞內(nèi)葉綠素a、葉綠素b 和總類胡蘿卜素質(zhì)量濃度變化如圖4.在處理24 h時(shí)，3種胞內(nèi)色素質(zhì)量濃度均升高，但MeJA 處理組（0.5、1.0 和1.5 mmol/L）的色素質(zhì)量濃度均顯著低于CK 組，且處理濃度越高，降低的幅度越明顯.在處理24 h后，處理組色素質(zhì)量濃度不再顯著上升.其中，1.0 mmol/L與1.5 mmol/L處理組在處理48 h 后，色素開(kāi)始降低；在處理72 h后，1.5 mmol/L 處理組3 種胞內(nèi)色素質(zhì)量濃度低于處理前，分別為處理前的86%、81% 和78%.qPCR分析發(fā)現(xiàn)，MeJA會(huì)影響類胡蘿卜素合成徑的關(guān)鍵基因表達(dá)（圖5）.與對(duì)照組相比，MeJA分別處理1 h與4 h時(shí)，類胡蘿卜素合成途徑的基因均受到顯著的抑制作用；處理24 h時(shí)，盡管PDS、ZDS與CRTISO基因的表達(dá)水平有所恢復(fù)甚至上調(diào)，但限速酶八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase，PSY）基因與下游的CHYb基因仍被顯著抑制.其中，1.0 mmol/L 與 1.5 mmol/L 處理組的PSY基因表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的20%與12%，CHYb基因表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的31%與7%.限速酶基因的低表達(dá)可能是造成胞內(nèi)色素降低的原因.

圖4 不同濃度MeJA處理后葉綠素a、葉綠素b、總類胡蘿卜素的變化Fig.4 Changes of chlorophyll a,chlorophyll b and total carotenoids after treatment with different concentrations of MeJA

圖5 不同濃度MeJA處理后類胡蘿卜素合成途徑基因的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of carotenoid synthesis pathway genes after treatment with different concentrations of MeJA

2.4 MeJA處理能增強(qiáng)甾醇類物質(zhì)合成途徑基因表達(dá)

萊茵衣藻的甾醇類物質(zhì)合成同樣依賴于MEP途徑，合成途徑的關(guān)鍵基因有FPPS、SQE、CAS、CYP51 和ERG4/24.它們?cè)贛eJA 處理下的表達(dá)模式如圖6.甾醇類物質(zhì)合成途徑基因在不同濃度MeJA 處理后均顯著上調(diào)，且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，上調(diào)幅度持續(xù)上升.在處理4 h 時(shí)，1.0 mmol/L 處理組上調(diào)幅度更高；而在處理24 h后，1.5 mmol/L處理組上調(diào)幅度更加顯著.其中，1.0 mmol/L處理組在處理4 h 時(shí)，ERG4/24 基因相對(duì)表達(dá)水平最高上調(diào)至14.47倍，其他基因分別上調(diào)至1.26～7.52倍.1.5 mmol/L 處理組在處理24 時(shí)，CYP51 與ERG4/24 基因相對(duì)表達(dá)水平分別上調(diào)至40.26 與23.01倍，其他基因分別上調(diào)至6.11～7.56倍.

圖6 不同濃度MeJA處理后甾醇類物質(zhì)合成途徑基因的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of sterol synthesis genes after treatment with different concentrations of MeJA

綜上所述，MeJA 處理誘導(dǎo)MEP 途徑與甾醇類物質(zhì)合成途徑基因上調(diào)表達(dá)，類胡蘿卜素合成途徑基因下調(diào)，說(shuō)明MeJA 處理下導(dǎo)致異戊二烯更多流向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)甾醇類物質(zhì)的合成.

3 討 論

3.1 MeJA處理誘發(fā)萊茵衣藻細(xì)胞作出快速響應(yīng)

萊茵衣藻是單細(xì)胞真核微藻，對(duì)于外源刺激響應(yīng)十分迅速，處理后樣品早期和晚期的轉(zhuǎn)錄水平組間差異大［18-19］.因此，對(duì)初期響應(yīng)模式分析能夠更加精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻在短時(shí)間內(nèi)做出的應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制.MeJA 作為外源刺激劑，會(huì)導(dǎo)致萊茵衣藻在生理生化、代謝與轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生巨大改變.在生理生化水平，MeJA 處理會(huì)損傷光系統(tǒng)，導(dǎo)致光合色素質(zhì)量濃度降低，致使光合效率，細(xì)胞活性下降［16］.在代謝水平，MeJA 處理后萊茵衣藻細(xì)胞中心碳代謝和飽和脂肪酸代謝發(fā)生廣泛的重組，氨基酸代謝發(fā)生選擇性改變［17］，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞生成新生未知的三萜化合物［15］.在轉(zhuǎn)錄水平，MeJA 處理導(dǎo)致MEP 通路基因表達(dá)發(fā)生改變，IPP 和DMAPP 流向發(fā)生改變，光合色素合成和甾醇類物質(zhì)合成受阻［17］.類胡蘿卜素是維護(hù)光系統(tǒng)活性的重要組成，對(duì)于清除光合作用產(chǎn)生的活性氧有重要的生理意義.因而，類胡蘿卜素合成受阻可能是MeJA 處理下萊茵衣藻光合活性與細(xì)胞活性降低的主要原因之一.本研究發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻細(xì)胞對(duì)MeJA響應(yīng)快速，且與處理劑量呈正相關(guān).加入MeJA 的同時(shí)，萊茵衣藻光系統(tǒng)活性即呈迅速下降，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降，降低速度與處理濃度呈現(xiàn)顯著的線性相關(guān).細(xì)胞濃度在處理后1 ～2 h后，處理組同對(duì)照組產(chǎn)生了顯著的差異，說(shuō)明萊茵衣藻對(duì)MeJA 極為敏感，響應(yīng)快速.

3.2 MeJA對(duì)MEP途徑與下游代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用

近年來(lái)，萊茵衣藻作為生產(chǎn)異源類異戊二烯的光合細(xì)胞工廠受到了一定的關(guān)注［11］，但MEP 通量有限，導(dǎo)致微藻產(chǎn)萜能力受到限制.1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS）與1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）是MEP 通路的關(guān)鍵和限速酶，提高它們的表達(dá)量能增加MEP 途徑通量，促進(jìn)下游產(chǎn)物的積累［20-22］.本研究發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻細(xì)胞經(jīng)1.0 mmol/L MeJA 處理 1 ～ 4 h 后，可誘導(dǎo)DXS基因表達(dá)迅速上調(diào)，但不影響DXR的表達(dá)，這可以增加IPP 和DMAPP 的通量.MeJA 減少萊茵衣藻細(xì)胞光合色素合成，盡管一些類胡蘿卜素合成途徑基因在24 h時(shí)，表達(dá)上調(diào)，但類胡蘿卜素合成的起始酶基因PSY受到顯著抑制，同時(shí)，胞內(nèi)色素質(zhì)量濃度較低也說(shuō)明IPP 與DMAPP 可能從合成光合色素流向細(xì)胞質(zhì)中三萜化合物的合成.

雖然本研究中發(fā)現(xiàn)甾醇類物質(zhì)合成途徑的基因上調(diào)表達(dá)，但也有研究表明，MeJA 處理后萊茵衣藻胞內(nèi)主要甾醇（麥角固醇與7-脫氫多孔甾醇）降低，卻同時(shí)檢測(cè)到了尚未表征的未知三萜類產(chǎn)物［15］，該化合物與甾醇使用共同前體底物（S）-2，3-oxidosqualene 進(jìn)行生物合成［23］.因而推斷 MeJA 可能激活未知基因（如細(xì)胞色素P450）的表達(dá)，導(dǎo)致胞內(nèi)產(chǎn)生新的三萜類化合物，而甾醇的減少不利于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這可能也是生物量減少的原因之一.

結(jié) 語(yǔ)

MeJA 處理對(duì)微藻的生物量積累和光合系統(tǒng)活性有負(fù)面影響，造成萊茵衣藻生長(zhǎng)速率降低，但可以激活葉綠體內(nèi)MEP 上游合成途徑基因與胞質(zhì)內(nèi)三萜類化合物合成途徑基因的上調(diào)，下調(diào)類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因.在轉(zhuǎn)錄與生理層面，萊茵衣藻對(duì)于MeJA 處理的初期響應(yīng)具有快速與劑量依賴性的特點(diǎn).萊茵衣藻在MeJA 處理早期的響應(yīng)模式研究為微藻異戊二烯工程設(shè)計(jì)改造提供新的思路和工具，也為在萊茵衣藻中進(jìn)行合成生物學(xué)與代謝工程研究奠定一定的基礎(chǔ).

致謝：衷心感謝胡章立教授的悉心指導(dǎo)！感謝深圳大學(xué)測(cè)試中心、生命與海洋科學(xué)學(xué)院公共儀器服務(wù)平臺(tái)的設(shè)備支持！