玉蜀黍尾孢菌VelB 基因敲除及生物信息學分析

路媛媛，孫承龍，譚玉琴，魏文杰，史咸春，宋艷波，李麗，劉振宇

（1.山西農業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801；2.山西農業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801；3.山西農業(yè)大學 信息科學與工程學院，山西 太谷 030801）

玉米灰斑病是世界玉米種植區(qū)重要真菌性病害之一，其病原菌為玉蜀黍尾孢菌（Cecrospora ze?ae?maydisTehon & Daniels），屬子囊菌門球腔菌屬真菌［1］。自1991年首次在我國遼寧丹東地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病害以來，玉米灰斑病菌在我國多次爆發(fā)流行，近些年在東北地區(qū)大面積發(fā)生，危害程度達3～5 級，嚴重地塊達7 級，給玉米生產(chǎn)造成了慘重損失［2］。隨后在山東、吉林、云南等地區(qū)相繼發(fā)生，成為我國東北和西南玉米產(chǎn)區(qū)一種重要病害［3］。

病原菌致病性分化與變異是引起病害流行的主導因素之一。對病原菌進行致病性研究發(fā)現(xiàn)，病原菌侵染后顯癥速度不同，且出現(xiàn)的病斑類型也存在明顯差異。通過血清學和蛋白質組學研究證明了病原菌存在分化現(xiàn)象［4］。對玉蜀黍尾孢菌致病性的研究主要集中在尾孢毒素方面。長期以來，致病學家和化學家研究內容主要集中在尾孢毒素的分離、純化［5］和化學結構鑒定［6］等方面。目前對尾孢毒素的提取仍采用濃縮浸提法［7］，研究發(fā)現(xiàn)該毒素對寄主保護酶及玉米胚根的生長有抑制作用，對玉米胚根細胞膜具有傷害，且能夠引起葉片的電滲值發(fā)生變化［8-10］。但目前對該毒素的主要成分仍有爭議［11-12］。由上可知，對玉蜀黍尾孢菌致病分子機理的研究較少。因此，盡快尋找發(fā)掘相關致病基因對于摸清玉米灰斑病菌致病性分子機理，以及玉米灰斑病的防治具有重要意義。

Velvet 蛋白家族最早發(fā)現(xiàn)在模式真菌Asper?gillus nidulans中［13］，是一類真菌特異的具有Velvet 結構域的蛋白。該家族含有VeA（Velvet），VelB（Velvet like B），VosA（Viability of spores A）和VelC（Velvet like C），具有調控真菌次生代謝及生長和發(fā)育的作用。其中Vel B 是Velvet 家族中唯一包含2個Velvet 結構域的成員［14］。近些年研究結果表明，VelB可通過調控Cochliobolus sati?vus、Fusarium oxysporum、Curvularia lunata等 子囊菌的次生代謝產(chǎn)物、孢子產(chǎn)生及子實體的形成，最終調控致病性［15-17］。本課題組前期研究利用農桿菌介導遺傳轉化技術，獲得玉米灰斑病菌PH6WC（強致病類型）突變體庫，通過形態(tài)學和致病性分析，從突變體庫中獲得一個產(chǎn)孢量下降，致病力明顯減弱的菌株，通過Tail-PCR 分析，獲得T-DNA 插入位點為VelB基因的啟動子區(qū)域［18］。

因此，本文克隆玉蜀黍尾孢菌的CzVelB基因序列，并進行生物信息學分析，研究CzVelB基因與玉蜀黍尾孢菌致病性之間的關系。構建ATMT敲除載體，獲得敲除轉化子，為研究CzVelB對玉蜀黍尾孢菌致病性的分子機制奠定基礎，同時也為加快該重大植物病害的防控理論研究提供新的思路和策略。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株、載體及試劑

本試驗所用的玉米灰斑病菌菌株Cz-1，大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌為EHA105 由山西農業(yè)大學生命科學學院保存，載體構建所需的pPZP100和pCT74 購買于武漢淼靈生物科技有限公司。

本文中所使用2×Es Taq Master Mix，所用試劑盒及抗生素等試劑購于沈陽森宇生物科技有限公司。

限制性內切酶、T4 連接酶、PMD19-T Vector購于Takara 生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析

根據(jù)NCBI 基因組數(shù)據(jù)庫中Colletotrichum graminicola中 的VelB 保 守 區(qū) 序 列，從JGI 數(shù) 據(jù) 庫中Cecrospora zeae-maydis 基因組中查詢到相似度較高的基因，采用DNAMAN 軟件對C. zeae-maydis 基因組中的VelB 蛋白序列進行同源性比對分析，最終確定其基因序列和拷貝數(shù)。根據(jù)所得到的基因序列，利用多種生物信息學軟件對CzVelB基因的性質、結構及功能進行預測。

生物信息學分析軟件如表1所示，分別對Cz-VelB 蛋白的氨基酸組成、理化性質、疏水性、跨膜結構、磷酸化位點、亞細胞定位、保守結構域以及信號肽進行分析。在NCBI 數(shù)據(jù)庫中Blast 搜索其他病原真菌VelB 基因序列，使用MEGA 5.0 軟件，利用NJ 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 分析重復數(shù)為1000。

表1 生物信息學分析工具及網(wǎng)址Table 1 Bioinformatics analysis tools and websites

1.2.2 CzVelB 側翼序列的獲得

首先采用CTAB 法［19］對玉米灰斑病菌進行基因組DNA 的提取。其次根據(jù)CzVelB 序列，利用DNAMAN 和BioXM 軟件設計特異性引物，并結合PCT74 載體上標記基因序列和pPZP100 骨架載體序列，在特異性引物的5'端加入酶切位點，最后利用高保真PCR 技術獲得側翼序列。

引物如下，其中gcc為保護堿基，小寫字母并帶有下劃線為酶切位點堿基。

CzVelB-5F-F1： gccgtcgacTGTGTACCCGACCTCAGTG

CzVelB-5F-F2：gcctctagaTTCCATAAATCGACCGTGAG

HphGFP-F： gcctctagaCAATTAACCCTCACTAAAGG

HphGFP-R： gccggtaccTAATACGACTCACTATAGGG

CzVelB-3R-R1： gccggtaccTCAACCTCGTCCGTCATTCG

CzVelB-3R-R2： gccgagctcAGGTGACAAATTAGGCGCTT

高保真PCR 反應體系：DNA 1.0 μL，5×Phusion HF 10.0 μL，dNTP mixture（10 mM）1.0 μL，primer（10 μM）2.5 μL，最 終ddH2O 定 容 至50.0 μL。

PCR 反應程序：98 ℃，30 s；98 ℃，10 s；Tm，30 s；72 ℃，30 s 共30個 循 環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。

1.2.3 CzVelB 敲除載體構建及驗證

以野生菌Cz-1為模板，分別采用CzVelB-5FF1/CzVelB-5F-F2、CzVelB-3R-R1/CzVelB-3RR2 和HphGFP-F/HphGFP-R 擴 增 上 游、下 游 和標記基因片段，擴增產(chǎn)物連入pMD19-T 載體，大腸桿菌轉化后，用質粒試劑盒提取質粒，酶切驗證。上游片段和pPZP100 經(jīng)SalⅠ和XbaⅠ酶切后連入，構成重組質粒pPZP100CzVelB-5F。隨后用KpnⅠ和SacⅠ酶切下游片段和重組質粒pPZP100CzVelB-5F，構成重組質粒pPZP100Cz-VelB-5F3R，最后分別采用HindIIⅠ和KpnⅠ酶切重組質粒pPZP100CzVelB-5F3R 和標記基因片段，形成敲除載體質粒pPZP100HphGFP-Cz-VelB（圖1）。

圖1 敲除載體pPZP100HphGFP-CzVelBFig.1 Delection vector pPZP100HphGFP-CzVelB

1.2.4 CzVelB 敲除突變體獲得及驗證

將上述構建好的敲除載體質粒pPZP100Hph-GFP-CzVelB，利用凍融法轉化到農桿菌感受態(tài)EHA105 細胞中［18］。將疑似含有敲除載體質粒pPZP100HphGFP-CzVelB 的農桿菌，置于28 ℃培養(yǎng)至菌液渾濁，隨后進行PCR 驗證。

通過農桿菌介導的方法，將含有敲除載體的農桿菌轉化到玉蜀黍尾孢菌基因組中，獲得敲除突變體［19］。將轉化所得擬敲除突變株進行單胞分離，繼代培養(yǎng)后，取長勢較好的疑似轉化子接種在250 μg·mL-1頭孢霉素、200 μg·mL-1潮霉素的PDA培養(yǎng)基中進行驗證。隨后提取疑似轉化子DNA，最終利用PCR 的方法進行驗證。

2 結果與分析

2.1 CzVelB 基因序列的獲得

根據(jù)NCBI 中Colletotrichum graminicola中的VelB 保守區(qū)序列（XM_008095148.1），利用JGI 數(shù)據(jù)庫中Cecrospora zeae-maydis 基因組序列，分析獲得1個相似度高達95%的VelB 基因，將該基因定為CzVelB。該基因全長為1184 bp。

2.2 CzVelB 生物信息學分析

2.2.1 CzVelB 的蛋白質組成及理化性質

利用DNAMAN 對CzVelB 編碼的氨基酸組成進行分析，結果表明該基因編碼氨基酸為385個，含有一個開放閱讀框。蛋白序列如圖2所示。

圖2 CzVelB 基因堿基序列及氨基酸序列Fig.2 Gene and amino acid sequence of CzVelB gene

利用ProtParam 對CzVelB 編碼的氨基酸進行理化性質分析，結果表明該蛋白42.136 45 kDa，等電點（PI）為9.05，正（Asp+Glu）/負（Arg+Lys）的電荷殘基數(shù)分別為31 和26，分子式為C1884H2887N519O561S11，總原子數(shù)為5862，不穩(wěn)定性指數(shù)值為58.27（＜40 穩(wěn)定；＞40 不穩(wěn)定［20］），因此該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為67.90，總平均親水性是-0.434，為親水性蛋白。

2.2.2 CzVelB 蛋白的親水性/疏水性分析

利用ProtScale 對CzVelB 蛋白親/疏水性進行預測分析，結果如圖3所示。CzVelB 蛋白在第268位氨基酸上得分為1.15，有最強疏水性；而在第12位上親水性最強，最低值為-2.10。玉米灰斑病CzVelB 蛋白的親水性總平均值為-0.434，表明該蛋白為親水性蛋白。

圖3 CzVelB 蛋白的疏水性和親水性分析Fig.3 Hydrophobic and hydrophilic analysis of CzVelB

2.2.3 CzVelB 蛋白跨膜結構域分析

利用TMPRED 對CzVelB 蛋白的跨膜結構域進行預測分析（圖4）。得分越高，則說明該蛋白質位于某一部位的概率就越大。根據(jù)預測結果可知該蛋白處于膜外，沒有跨膜結構區(qū)。

圖4 CzVelB 蛋白質跨膜結構域分析Fig.4 Transmembrane analysis of CzVelB

2.2.4 CzVelB 蛋白磷酸化位點分析

磷酸化多數(shù)情況下是發(fā)生在絲氨酸（Serine，Ser）、蘇氨酸（Threoine，Thr）、酪氨酸（Tyrosine.Tyr）等氨基酸的殘基上。利用NetPhos 3.1 在線軟件在線分析CzVelB 蛋白的磷酸化位點，結果如圖5所示。發(fā)現(xiàn)在該蛋白上存在有17個絲氨酸激酶磷酸化位點（第21、44、146、149、157、158、169、200、274、285、298、307、323、346、356、365、372 位氨基酸）、5個蘇氨酸激酶磷酸化位點（第97、111、122、137、280 位氨基酸）以及7個酪氨酸激酶磷酸化位點（第82、172、202、206、221、283 和360 位氨基酸）。該結果說明，CzVelB 能夠被激酶磷酸化，從而實現(xiàn)其功能的調控。

圖5 CzVelB 蛋白磷酸化位點分析Fig.5 Phosphorylation sites analysis of CzVelB

2.2.5 CzVelB 蛋白的亞細胞定位

采用PSORT 對玉米灰斑病CzVelB 的亞細胞定位進行預測，結果顯示：CzVelB 在細胞核（nuclear）、細胞質（cytoplasmic）、線粒體（mitochondrial）、過氧化物酶（peroxisome）、高爾基體（Golgi apparatus）的分布比例分別為15.5%、7.5%、2%、1%、1%，說明CzVelB 蛋白定位在細胞核中。

2.2.6 CzVelB 蛋白功能結構域

利用NCBI 對CzVelB 蛋白進行蛋白質結構域分析（圖6）。其氨基酸序列含有2個Velvet 結構域，具有Velvet 蛋白的典型特征。

圖6 CzVelB 蛋白結構域分析Fig.6 Conserved domain analysis of CzVelB

2.2.7 CzVelB 蛋白信號肽分析

利用軟件SignalP-4.1 預測玉米灰斑病Cz-VelB 編碼蛋白信號肽。C-score、S-score、Y-score分別代表著剪切位點的得分、信號肽的得分和綜合酶切位點的得分。信號肽預測結果計算方式為以上3個值均為最大值的位點才是可信度最高的信號肽剪切位點，由圖7可知得出該蛋白不存在信號肽位點，目前可以推測該蛋白為非分泌蛋白。

圖7 CzVelB 蛋白的信號肽分析Fig.7 The signal Peptide graph analysis of CzVelB

2.2.8 CzVelB 系統(tǒng)進化分析

結合GenBank 和JGI 數(shù)據(jù)庫中Curvularia lu?nata等多種植物病原菌的VelB保守區(qū)序列，利用MEGA5 對CzVelB進行系統(tǒng)進化分析（圖8）。A.flavus、A. niger、Cecrospora zeae-maydis、Emeri?cella nidulans聚為一類，Curvularia lunata、Collet?otrichum graminicola和Cochliobolus heterostro?phus聚為一類，其中Cecrospora zeae-maydis 與A.flavus、A. niger親 緣 關 系 較 近。CzVelB的 同 源 性分析進一步驗證了該基因具有保守性。即推測出的CzVelB功能與A. flavus、A. niger的VelB基因功能相似，參與調控玉蜀黍尾孢菌致病性。

圖8 CzVelB 與其他病原菌的系統(tǒng)進化分析Fig.8 Evolutionary analysis of CzVelB amino acid system

2.3 CzVelB 敲除載體構建及驗證

根據(jù)CzVelB 基因序列設計特異性引物，分別擴增上游片段315 bp 和下游片段281 bp（圖9-A，B）。利用HphGFP-F/HphGFP-R 擴增出帶有HPH 和GFP 的標記基因片段2600 bp（圖9-C）。

圖9 CzVelB 側翼序列和標記基因獲得Fig.9 Flanking sequence of CzVelB and HphGFP sequence

利用HindIIⅠ和KpnⅠ驗證標，2 條片段大小分別為2915 bp 和6917 bp，說明載體構建成功（圖10）。

圖10 pPZP100HphGFP-CzVelB 載體驗證Fig.10 Confirmation pPZP100HphGFP-CzVelB by digested

2.4 農桿菌轉化驗證

將疑似含有敲除載體質粒pPZP100HphGFPCzVelB 的農桿菌進行PCR 驗證，分別利用Cz-VelB-5F-F1/CzVelB-5F-F2、 CzVelB-3R-R1/CzVelB-3R-R2 和H phGFP-F/HphGFP-R 對 農桿菌進行菌落PCR，最終分別獲得315、281 和2600 bp 大小的目標片段（圖11）。以上結果表明pPZP100HphGFP-CzVelB 敲除載體已成功轉入農桿菌菌株中。

圖11 PCR 驗證敲除載體pPZP100HphGFP-CzVelB 轉入農桿菌Fig.11 PCR verification of transformation of pPZP100HphGFPCzVelB into Agrobacterium

2.5 CzVelB 敲除突變體獲得及驗證

經(jīng)含有250 μg·mL-1頭孢霉素、200 μg·mL-1潮霉素的PDA 抗性培養(yǎng)基篩選獲得敲除突變體（圖12）。并根據(jù)玉蜀黍尾孢菌VelB基因載體構建過程中設計的特異性引物，對ΔCzVelB進行PCR 驗證。利用CzVelB-5F-F1/CzVelB-3R-R2 引物，以野生型菌株Cz-1 基因組為模板，擴增出的全長片段大小為616 bp，突變體擴增出片段大小為3196 bp；利 用CzVelB-5F-F1/HphGFP-R 引 物，以野生型菌株Cz-1 基因組為模板為擴增出條帶，但突變體擴增出2915 bp 大小的片段，與預期大小一致（圖13），證明獲得了CzVelB的敲除突變體。

圖13 PCR 驗證敲除突變體Fig.13 PCR identification of ΔCzVelB

3 討論與結論

本文采用生物信息學手段分析CzVelB 蛋白保守結構域表明，其氨基酸序列含有2個VelB 蛋白的保守結構域-Velvet 結構域，具有Velvet 蛋白的典型特征。已有研究表明，Aspergillus nidu?lans、Fusarium oxysporum、Aspergillus flavus等 真菌的VelB 蛋白均存在Velvet 結構域，且結構域保守［16，21］。通過結合系統(tǒng)發(fā)育樹進一步分析，C. ze?ae-maydis 與A. flavus、A. niger親 緣 關 系 較 近。因此，玉蜀黍尾孢菌具有典型的VelB 蛋白功能。

另外，針對CzVelB 蛋白理化性質、親水性、疏水性等分析，結果表明該蛋白為親水性蛋白，無跨膜結構區(qū)，這與Ustilago maydis和Cochliobolus heterostrophus的分析結果相一致［22-23］。

亞細胞定位結果表明，在分析玉米大斑病菌VelB 蛋白時發(fā)現(xiàn)，該蛋白位于細胞質中，因此可能需要從細胞質中轉運至細胞核中，進而發(fā)揮作用［24］。但本文分析CzVelB 蛋白位于細胞核中，且不存在信號肽，這與楊崢的研究結果不一致。針對蛋白磷酸化結果分析，均發(fā)現(xiàn)CzVelB 蛋白存在大量的磷酸化位點，能被激酶磷酸化，從而實現(xiàn)其功能的調控。因此推測CzVelB 蛋白參與調控玉蜀黍尾孢菌刺激代謝途徑。

國內外研究表明，ATMT 技術是目前絲狀真菌遺傳轉化最常用的手段，因此獲得目標基因的敲除突變體為后續(xù)研究該基因的功能奠定基礎。本文根據(jù)玉蜀黍尾孢菌的VelB基因序列，設計特異性引物，擴增出側翼片段和標記基因片段，并成功連入骨架載體中，構建CzVelB基因的敲除載體pPZP100HphGFP-CzVelB，最終利用ATMT 技術獲得ΔCzVelB，為進一步研究該基因的功能分析提供基礎材料。