對照品及流動(dòng)相對海藻酸鈉分子量測定的影響

徐 蕾，王 瑾，陳 濤，張慶龍，楊 釗

(1.青島大學(xué) a.藥學(xué)院，b.附屬醫(yī)院,青島 266021；2.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，青島 266071)

海藻酸鈉作為一種海洋植物產(chǎn)物，是從褐色海藻植物中用稀堿提取的海藻酸的鈉鹽[1-2]，因其良好的生物相容性和生物可降解性，在食品、生物醫(yī)藥、藥物傳遞系統(tǒng)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[3-9]。海藻酸鈉作為高聚糖醛酸，具有分子大小不均一的特點(diǎn)，其分子量及分布是控制質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一。一種海藻酸鈉的分子量通常代表該組所有分子的平均值，表示方式有重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)。常用Mw/Mn表示分子量的分布，數(shù)值越大，表示分子量分布越寬；數(shù)值越小，表示分子量分布越窄。高效凝膠滲透色譜法是測定分子量及其分布最常用的方法，分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。當(dāng)藥物分子進(jìn)入色譜柱后，分子量較大的部分保留時(shí)間較短，而分子量相對較小的保留時(shí)間較長，按分子大小依次被洗脫，從而達(dá)到分離效果[10-14]。該方法適用范圍廣、便捷和重現(xiàn)性好，被常用于測定大分子物質(zhì)的分子量及其分布。本文擬采用高效凝膠滲透色譜法比較分析不同廠家生產(chǎn)的9批海藻酸鈉原料藥的分子量及其分布[15-17]，研究不同組分的對照品、不同組成的流動(dòng)相對海藻酸鈉分子量及其分布測定的影響，以期完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提升質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(配備G1362A示差折光檢測器，Agilent公司)；TSK gel G4000PWxl色譜柱(7.8×300 mm，TOSOH公司)；電子天平(BT125D型，Sartorius公司)；電子天平(BSA224S型，Sartorius公司)；Agilent GPC數(shù)據(jù)分析軟件(Agilent公司)。

1.2 試藥

右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)(套)對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào) 140637～646-201203；普魯蘭分子量標(biāo)準(zhǔn)(套)對照品，昭和電工株式會(huì)社，批號(hào) 190801。無水硫酸鈉(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，疊氮鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)超純水由Millipore超純水系統(tǒng)制備。

1.3 樣品

A廠家6批樣品批號(hào)分別為：391812002、391902001、391812004、391805006、391902002、391902003，編號(hào)1～6；B廠家3批樣品批號(hào)分別為：LFR5/60、CR8133、CR8223，編號(hào)7～9。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：TSK gel G4000PWxl；柱溫40 ℃；流速0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。檢測器：示差折光檢測器；檢測池溫度45 ℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 稱取海藻酸鈉樣品0.1 g，用流動(dòng)相溶解并定容至100 mL，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液1 取已知分子量的右旋糖酐對照品適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋至每1 mL中各約含1 mg的溶液，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 對照品溶液2 取已知分子量的普魯蘭對照品適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋至每1 mL中各約含1mg的溶液，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 流動(dòng)相 稱取無水硫酸鈉28.41 g，用水定容至2 000 mL，得0.1 mol·L-1的硫酸鈉溶液，配置流動(dòng)相A。流動(dòng)相B為超純水。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取對照品溶液1和2各20 μL注入液相色譜儀，記錄洗脫峰的保留時(shí)間。以對照品分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)、相應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，用GPC軟件進(jìn)行三階線性擬合，得到線性回歸方程。

2.4 對照品對分子量測定的影響

分別取對照品溶液1和2、供試品溶液，以流動(dòng)相A進(jìn)行測定，采用GPC軟件計(jì)算，比較選用不同對照品的測定結(jié)果。

2.5 流動(dòng)相對分子量測定的影響

取對照品溶液1和供試品溶液，分別以流動(dòng)相A、流動(dòng)相B進(jìn)行測定，采用GPC軟件計(jì)算，比較選用不同流動(dòng)相的測定結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 試驗(yàn)方法學(xué)結(jié)果

3.1.1 系統(tǒng)適用性 取空白溶劑(0.1 mol·L-1硫酸鈉溶液)與7號(hào)樣品分別注入液相色譜儀，圖1為7號(hào)樣品出峰的色譜圖，溶劑峰不干擾本品主峰。

圖1 7號(hào)樣品色譜圖

3.1.2 保留時(shí)間 右旋糖酐和普魯蘭多糖對照品各分子量的保留時(shí)間分別見表1、表2。測得供試品溶液主峰保留時(shí)間既在右旋糖酐對照品D1和D10主峰保留時(shí)間范圍內(nèi)，也在普魯蘭多糖對照品D1和D5主峰保留時(shí)間范圍內(nèi)。

表1 右旋糖酐對照品洗脫時(shí)間

表2 普魯蘭多糖對照品洗脫時(shí)間

3.2 不同流動(dòng)相對分子量測定結(jié)果的影響

實(shí)驗(yàn)選用多糖分子量測定常用的兩種流動(dòng)相純水和硫酸鈉溶液，分別考察兩者對測定海藻酸鈉分子量結(jié)果的影響。8號(hào)樣品在不同流動(dòng)相下的色譜圖如圖2所示，當(dāng)以純水為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖形狀異常；以硫酸鈉溶液為流動(dòng)相時(shí)，海藻酸鈉的色譜峰峰型對稱性較好，對保留時(shí)間影響較小。海藻酸鈉在不同流動(dòng)相下產(chǎn)生的色譜行為有如此大的差別，原因可能與海藻酸鈉的多聚物結(jié)構(gòu)有關(guān)，海藻酸鈉獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)使其分子在不一樣的溶液系統(tǒng)中會(huì)產(chǎn)生不同的聚集形態(tài)，藻酸鹽分子和洗脫液之間的互相作用也可能導(dǎo)致保留時(shí)間發(fā)生變化。以純水為流動(dòng)相時(shí)，褐藻膠在水中產(chǎn)生陰離子排斥作用，分子處于伸展?fàn)顟B(tài)，流體力學(xué)體積較大，分離效果不穩(wěn)定，出峰時(shí)間早。以強(qiáng)電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相時(shí)，褐藻膠分子伸展減弱，色譜行為較穩(wěn)定[18-19]。海藻酸鈉的重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)和分子量分布寬度(D)的測定結(jié)果如表3所示。可以看出，Mw差距最小的是4號(hào)樣品相差90 000；最大的是7號(hào)樣品相差達(dá)到1 200 000；Mn差距最小的是1號(hào)樣品相差50 000；最大的是7號(hào)樣品相差達(dá)到1 100 000。樣品的色譜峰會(huì)影響保留時(shí)間，表現(xiàn)為分布范圍變寬或變窄，從而導(dǎo)致相對分子量降低或升高。

圖2 8號(hào)樣品色譜圖

表3 不同流動(dòng)相測定分子量與分子量分布結(jié)果比較

3.3 不同對照品對分子量測定結(jié)果的影響

使用同一根TSK G4000PWxl色譜柱，分別使用兩種對照品進(jìn)行檢測，得右旋糖酐線性回歸方程：Y=0.0009673888X3-0.08130449X2+0.5020784X+5.998968；普魯蘭線性回歸方程：Y=-0.01530996X3+0.3353058X2-3.017180X+15.39076。采用GPC軟件對海藻酸鈉重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)和分子量分布寬度(D)的分析結(jié)果如表4所示?？梢钥闯觯谙嗤瑮l件下，分別使用右旋糖酐和普魯蘭對照品，得到的相對分子量結(jié)果差距比較大；Mw測定結(jié)果偏差最小的是7號(hào)樣品相差40 000；最大的是6號(hào)樣品達(dá)到1 000 000。使用普魯蘭對照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的樣品分子量結(jié)果相對偏小，分子量分布D值也較使用右旋糖酐對照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的結(jié)果低。隨著Mw的變大，兩種對照品測得的重均分子量差距也越來越大。HPGPC法在測定多糖分子量時(shí)需要適合的對照品，對照品的分子量分布情況越接近于樣品，分子量測定值與真實(shí)值越接近。右旋糖酐及普魯蘭是適用于各種水溶性校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣品[20]，也是目前廣泛使用的分子量對照品。由于分子排阻色譜中的分子篩作用是使溶質(zhì)分子按分子的大小順序而非直接以分子量大小順序洗脫，因此不同對照品的選擇會(huì)直接影響其測定結(jié)果。

表4 不同對照品測定分子量與分子量分布結(jié)果比較

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在海藻酸鈉分子量的測定中，對照品、流動(dòng)相等色譜條件的變化會(huì)對不同樣品的分子量及其分布趨勢產(chǎn)生一定影響。結(jié)果表明分子量級(jí)小的樣品可以選擇普魯蘭為對照品，分子量級(jí)大的樣品可以選擇右旋糖酐為對照品；而硫酸鈉溶液則是測定海藻酸鈉分子量時(shí)較為理想的流動(dòng)相選擇。目前海藻酸鈉的分子量測定沒有統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此建議在其測定過程中，應(yīng)充分注意不同色譜條件對測定結(jié)果的影響，選擇合適的對照品、流動(dòng)相，降低試驗(yàn)誤差對結(jié)果的影響。