p-BRAF在心肌缺血再灌注損傷中的作用和機制研究

王 菲，李培峰，高巖巖

(青島大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院，青島 266021)

心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia reperfusion，MIR)可恢復心肌缺血造成的血流、供氧和營養(yǎng)不足，是恢復正常細胞穩(wěn)態(tài)和挽救心肌的必要手段[1-2]，但是缺血心肌在恢復血液再灌注后，可能進一步引起細胞死亡[3]形成不可逆的心肌損傷，即“心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)”[4-5]。目前原因尚不完全明了，但普遍認為線粒體作為細胞的能量代謝中心，可通過提供心臟收縮弛豫循環(huán)所需的能量以及活性氧(ROS)產(chǎn)生、代謝調(diào)控、鈣平衡等核心功能在維持心臟穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[6-7]。已有研究表明，線粒體Ca2+超載可致使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore，mPTP)不可逆性過度開放，是導致心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素之一[8]。BRAF作為 Raf 激酶家族成員，是下游絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途徑中最強激活劑，可影響細胞的增殖、分裂、分化等諸多過程，在控制細胞生長和調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用[9]。大量研究表明，MAPK通路中發(fā)生的BRAF突變會使下游的細胞信號持續(xù)激活，細胞不受控制地生長和增殖，發(fā)揮致癌驅(qū)動作用[10-12]。近年來，BRAF抑制劑已作為腫瘤靶向藥物得到廣泛應用，但一些患者會對治療產(chǎn)生獲得性耐藥。有研究表明，BRAF絲氨酸729磷酸化可能導致了異常剪接版本的BRAF V600E與MEK的結(jié)合力增加，在BRAF抑制劑耐藥中起重要作用[13-14]。另有研究表明BRAF在心臟相關(guān)疾病中也發(fā)揮一定作用，可通過調(diào)節(jié)線粒體Ca2+參與調(diào)控病理性心肌肥大[15-17]，但其在心臟中的更多功能以及p-BRAF(S729)作為其活化形式之一能否成為心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病治療的靶點仍有待深入研究。因此，本文基于心肌缺血再灌注的細胞與動物模型，研究MIR時p-BRAF的表達情況，以及干預p-BRAF對線粒體功能及細胞死亡的作用，為MIRI的臨床研究提供新的靶點與思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1～2日齡昆明小鼠乳鼠、C57BL/6小鼠(大任富城)，DMEM/F12(SparkJade)，胎牛血清(BI)，胰液素、Ⅱ型膠原酶、鈣離子熒光探針(Rhod-2/AM)(翊圣生物科技公司)，RIPA裂解液(索萊寶)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶)，ECL超敏顯影液(雅酶)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)檢測試劑盒(碧云天)，propidium iodide(PI，US Everbright Inc，China)，Cyclosporin A(MCE)，Ru360(MCE)，BRAF shRNA腺病毒、BRAF mOE腺病毒(漢恒生物)，冰臺，眼科剪，彎頭鑷，小燒杯，260目過濾網(wǎng)，生理鹽水，青鏈霉素(美侖生物)，GAPDH(CST，2118S)、p-BRAF(S729)(Abcam，ab124794)、BRAF(SANTA，sc-55522)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠原代心肌細胞的分離和培養(yǎng) 取雌雄不分的1～2日齡昆明小鼠乳鼠放至容器中，用75%的酒精清洗乳鼠1～2次。于超凈臺中用眼科剪取出乳鼠心臟，置于PBS中清洗心臟3次。在冰臺上剪碎心臟，加入消化液，轉(zhuǎn)移到滅菌的100 mL錐形瓶中。錫紙包裹瓶口后，37℃搖動水浴5 min，將上層液體移至含有5 mL血清的離心管(50 mL)中，再次加入消化液，反復10次以上直到消化完畢。收集消化產(chǎn)物，1000 r/min離心5 min，棄上清，用DMEM/F12懸起沉淀，再次離心。加入10 mL的含有5%血清的DMEM/F12重懸沉淀，通過260目過濾網(wǎng)過濾懸液，將其收集到10 cm培養(yǎng)皿中。置于恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，于37℃溫度下進行細胞培養(yǎng)。細胞差速貼壁 1～1.5 h后，收集細胞懸液,此時沒有貼壁的細胞即為小鼠原代心肌細胞。將細胞接種于適合的細胞培養(yǎng)皿中，即可進行后續(xù)實驗。

1.2.2 MIR模型的構(gòu)建 構(gòu)建缺氧復氧細胞模型(H/R)：按照1.2.1步驟分離小鼠原代心肌細胞，培養(yǎng)24 h后換液。實驗分為三組，常氧(Normoxia)組使用含有5%血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基于正常培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)，缺氧(Hypoxia)組和H/R組用DMEM/F12無糖無血清培養(yǎng)基預處理24 h后，轉(zhuǎn)移至缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，H/R組缺氧6 h后更換5%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～12 h，即可用于后續(xù)分析。

構(gòu)建心肌缺血再灌注小鼠模型(I/R)：將雄性C57BL/6小鼠分為三組，假手術(shù)組僅實施開胸手術(shù)；梗死組和I/R組在小鼠麻醉消毒后，連接心電圖，實施氣管插管，連接呼吸機，開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支45 min，缺血45 min后，I/R組松動結(jié)扎物，再灌注復流3～6 h，再觀察心電圖，上抬的ST段下降50%以上或恢復到缺血前水平，表明再灌注成功。在再灌注結(jié)束時，收集組織樣本用于后續(xù)分析。

1.2.3 Western blot檢測MIR時的蛋白表達 RIPA裂解液(混有1×PMSF, 1×Phosphatase inhibitor cocktail)裂解組織或細胞樣品，4℃離心機12 000 r/min離心15 min，收集上清。BCA法檢測蛋白濃度后，在上清中加入適量4×蛋白上樣緩沖液，98℃煮10 min。選擇適當濃度的SDS-PAGE膠分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 g/L的脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合位點1 h，膜和按比例稀釋的一抗在4℃的冷室中孵育過夜。次日使用適量的TBST清洗膜10 min，重復3次，用抗鼠或抗兔二抗孵育膜1.5 h，再次使用適量的TBST清洗膜3次，即可通過化學發(fā)光儀來檢測信號，以GAPDH為參照分析免疫印跡的條帶強度。

1.2.4 細胞病毒感染 當細胞密度70%～80%，即可進行腺病毒感染。將細胞分為Normoxia組和H/R組，每組將干擾或過表達腺病毒及其對照以multiplicity of infection(MOI)=300的病毒量感染細胞，空白對照不做任何處理，6 h后更換培養(yǎng)基。細胞感染24 h后，即可按照Normoxia組和H/R組分別預處理，細胞缺氧6 h并復氧3 h后可用于后續(xù)實驗。

1.2.5 細胞加藥處理 將細胞分為Normoxia組和H/R組，每組又分空白對照組、CsA組和Ru360組。在細胞按照Normoxia組和H/R組分別進行預處理的最后8 h，CsA組加入CsA(5 μmol/L)，作用8 h后換為加藥前相對應的培養(yǎng)基進行常氧/缺氧。此時，Ru360組加入Ru360(10 μmol/L)，作用1 h后換為相對應的培養(yǎng)基繼續(xù)常氧/缺氧5 h。換液后復氧3 h即可用于進行后續(xù)實驗。

1.2.6 心肌細胞線粒體Ca2+水平檢測 將原代心肌細胞接種于含有12 mm玻片的24孔板中，按實驗要求進行不同處理后，吸出培養(yǎng)液，HEPES(25 mmol/L)清洗細胞3遍。加入適量鈣離子熒光探針(Rhod-2/AM)工作液(4 μmol/L)，緩慢晃動孔板，使染料能夠均勻覆蓋所有細胞，37℃條件下避光孵育30 min。去除工作液后，HEPES清洗細胞3遍，37℃條件下繼續(xù)避光孵育30 min。吸除HEPES，加入適量4%多聚甲醛，常溫下固定15 min，HEPES清洗細胞2遍后，取出玻片，封片并固定在載玻片上，即可在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.7 心肌細胞mPTP檢測 將原代心肌細胞接種于35 mm的玻底培養(yǎng)皿中，按實驗要求進行不同處理后，吸出培養(yǎng)液，PBS清洗細胞2遍后，加入適當體積的熒光淬滅工作液：500 μL檢測緩沖液+0.5 μL鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein AM)+5 μL 促溶劑+ 7 μL CoCl2，緩慢晃動培養(yǎng)皿，使染料能夠均勻覆蓋所有細胞，37℃條件下避光孵育30 min。工作液更換為新鮮的37℃預熱的培養(yǎng)基(無血清)，再次于37℃條件下避光孵育30 min。吸出培養(yǎng)基， PBS清洗細胞2遍，培養(yǎng)皿加入檢測緩沖液，即可在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.8 PI染色檢測細胞死亡 將原代心肌細胞接種于24孔板中，按實驗要求進行不同處理后，吸出培養(yǎng)液，PBS清洗細胞2遍，加入適當體積的碘化丙啶(PI)稀釋染液(1∶10 000)，緩慢晃動孔板，使染料能夠均勻覆蓋所有細胞。冰上避光靜置5 min，鏡下觀察出現(xiàn)紅色即可吸出染液，PBS清洗細胞1遍。加入適量4%多聚甲醛，常溫下固定15 min，PBS清洗細胞2遍后，即可在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 MIR中線粒體Ca2+超載和mPTP開放導致心肌細胞死亡

為了驗證MIRI與線粒體功能密切相關(guān)，在小鼠原代心肌細胞中通過H/R模擬MIR，觀察發(fā)現(xiàn)H/R時心肌細胞Rhod-2熒光強度明顯增加(圖1(a))，Calcein熒光強度明顯降低(圖1(b))(P均<0.05)。分別在心肌細胞中加入線粒體鈣攝取抑制劑Ru360和mPTP開放抑制劑CsA，觀察H/R時心肌細胞死亡的變化。與Normoxia組相比，H/R后細胞死亡率明顯增加，但在Ru360和CsA的作用下，這種細胞死亡率的增加得到明顯恢復(P均<0.05)(圖1(c))。

圖1 MIR中線粒體Ca2+超載和mPTP開放導致心肌細胞死亡(a)Rhod-2/AM染色檢測相對熒光強度；(b)CalceinAM染色檢測相對熒光強度；(c)PI染色檢測細胞死亡率

2.2 p-BRAF在MIR中上調(diào)并促進心肌細胞死亡

在細胞和動物水平上構(gòu)建MIR模型，檢測p-BRAF和BRAF的蛋白表達情況如圖2(a)、(b)所示。BRAF蛋白表達量無明顯變化，而p-BRAF的蛋白表達量在再灌注過程中明顯升高(P<0.05)。構(gòu)建BRAF shRNA/BRAF mOE腺病毒(圖2(c)、(d))，發(fā)現(xiàn)BRAF敲低后，H/R造成的細胞死亡增加明顯降低(P<0.05)(圖2(e))；p-BRAF過表達后，Normoxia組細胞死亡數(shù)量明顯增加(P<0.05)，H/R造成的細胞死亡增加無明顯降低(圖2(f))。

圖2 p-BRAF在MIR中上調(diào)并促進心肌細胞死亡(a)Western blot檢測心肌細胞H/R過程中p-BRAF和BRAF的蛋白表達；(b)Western blot檢測小鼠MIR過程中p-BRAF和BRAF的蛋白表達；(c)Western blot檢測BRAF shRNA腺病毒的效率(MOI=300)；(d)Western blot檢測BRAF mOE腺病毒的效率(MOI=300)；(e)PI染色檢測敲低BRAF后細胞死亡率；(f)PI染色檢測過表達p-BRAF后細胞死亡率

2.3 p-BRAF導致心肌細胞線粒體Ca2+超載和mPTP開放

小鼠原代心肌細胞分別感染BRAF shRNA干擾腺病毒和BRAF mOE過表達腺病毒后，檢測線粒體Ca2+和mPTP的變化，發(fā)現(xiàn)BRAF干擾后，Normoxia組Rhod-2熒光強度無明顯變化，H/R造成的Rhod-2熒光強度增加得到明顯恢復(圖3(a))(P<0.05)。p-BRAF過表達后，Normoxia組Rhod-2熒光強度明顯增加，Calcein熒光強度明顯降低(P<0.05)，而H/R造成的Rhod-2熒光強度增加，Calcein熒光強度降低在p-BRAF過表達后無明顯變化(圖3(b)、(c))。

圖3 p-BRAF導致心肌細胞線粒體Ca2+超載和mPTP開放(a)Rhod-2/AM染色檢測BRAF干擾后相對熒光強度；(b)Rhod-2/AM染色檢測p-BRAF過表達后相對熒光強度；(c)Calcein AM染色檢測p-BRAF過表達后相對熒光強度

3 討論

心肌缺血再灌注作為恢復血流的重要手段，是治療缺血性心臟病尤其是急性心肌梗死最有效的方法。但它也是“雙刃劍”，因為再灌注本身會導致MIRI即原缺血的心肌反而受到更嚴重的損傷。越來越多的研究證據(jù)表明，線粒體介導的細胞死亡在MIRI的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，并涉及到線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的結(jié)構(gòu)和功能mPTP開放[18-21]。

線粒體Ca2+濃度可對線粒體ATP的生成、離子通道的通透性以及鈣信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[22-23]。有研究表明線粒體Ca2+超載可誘導線粒體內(nèi)膜mPTP開放，使線粒體膜(IMM)不選擇性地滲透小于1.5 kDa的分子，破壞線粒體膜電位，解偶聯(lián)氧化磷酸化，導致ATP耗竭和細胞死亡[24-26]。本研究基于此，分析了H/R過程中線粒體Ca2+和mPTP水平的變化，再次證明了MIR過程中線粒體Ca2+超載和mPTP的開放。另有大量研究表明Ru360作為一種選擇性的線粒體鈣攝取的抑制劑，可有效抑制Ca2+吸收到線粒體中，具有一定的心臟保護作用[27-28]，CsA靶向Cyp-D可抑制mPTP的開放，減輕MIRI[29]。本研究通過PI染色分析發(fā)現(xiàn)Ru360和CsA在H/R中可有效抑制心肌細胞死亡，提示線粒體Ca2+超載和mPTP開放造成的MIRI是通過細胞死亡實現(xiàn)的。因此，維持線粒體鈣穩(wěn)態(tài)、抑制mPTP開放對降低心肌細胞死亡率改善MIRI具有重要意義。RAF基因家族包含BRAF、ARAF和CRAF，其中BRAF自21世紀初已被確定為人類腫瘤中的一種常見突變基因[30]，其S729磷酸化位點已被證實在腫瘤治療中具有重要研究價值[31]。隨著相關(guān)研究的深入和多樣化，證明BRAF在心肌重塑中也發(fā)揮一定作用，為探究其在心肌重塑中可能的調(diào)控機制，本文構(gòu)建了MIR細胞和小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在MIR中BRAF表達水平無明顯變化，而p-BRAF(S729) 明顯上調(diào)，這說明在MIR過程中BRAF在S729位點發(fā)生了磷酸化，并可能通過磷酸化的形式發(fā)揮一定的作用。在干擾/過表達p-BRAF后，通過分析H/R過程中線粒體Ca2+濃度、mPTP水平和細胞死亡情況的變化，顯示p-BRAF在MIR過程中能夠通過介導線粒體Ca2+超載和mPTP的開放導致心肌細胞死亡。基于p-BRAF和線粒體功能的相關(guān)性分析，本文認為其調(diào)控機制可能與線粒體相關(guān)蛋白有關(guān)，可以從p-BRAF的分子層面入手展開MIRI發(fā)生機制研究，為心肌缺血再灌注損傷患者帶來希望。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果在證明MIR造成的心肌細胞死亡與線粒體Ca2+超載和mPTP開放密切相關(guān)的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建MIR細胞和小鼠動物模型，首次發(fā)現(xiàn)p-BRAF在MIR中明顯上調(diào)，并在干擾/過表達p-BRAF后，證明了其能夠通過介導線粒體鈣超載和mPTP開放導致心肌細胞死亡造成心肌缺血再灌注損傷。p-BRAF可能作為一個新的靶點，助力于心肌缺血再灌注損傷的預防和治療，對心臟保護由基礎(chǔ)研究走向臨床應用具有實際意義。今后工作將探究p-BRAF在MIR過程中的具體調(diào)控通路，為心血管疾病的臨床預后提供新思路。