代謝流分析技術(shù)及其在腫瘤代謝中的應(yīng)用進(jìn)展

牛宇佳，徐同冉，林樹(shù)海

(廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102)

在20世紀(jì)20—60年代，生物化學(xué)領(lǐng)域呈現(xiàn)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，科學(xué)家們鑒定了人類(lèi)和其他物種的絕大多數(shù)代謝網(wǎng)絡(luò)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用和能量產(chǎn)生的過(guò)程[1].進(jìn)入21世紀(jì)后，又迎來(lái)代謝復(fù)興的新時(shí)期.研究人員借助各類(lèi)新技術(shù)、新儀器，如色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了高通量代謝物的定性、定量分析，可表征細(xì)胞、組織和體液在某一特定條件下的病理與生理變化，因此代謝組的變化可以看成是生化反應(yīng)的指示劑；然而，這只解決了問(wèn)題的一半，代謝組學(xué)反映的是靜態(tài)代謝物的豐度，而單獨(dú)某一種代謝物增加的原因既可能是合成途徑的活躍，也可能是消耗途徑的抑制，因此了解代謝物相關(guān)途徑活性的變化同樣重要[2].為了更好地定性與定量研究代謝物的代謝命運(yùn)，代謝流分析技術(shù)伴隨穩(wěn)定同位素示蹤和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生.研究人員引入穩(wěn)定同位素來(lái)示蹤代謝物，依據(jù)代謝物分子的同位素分布模式推斷出相關(guān)代謝反應(yīng)的通量[3]，以實(shí)現(xiàn)從靜態(tài)與動(dòng)態(tài)角度均能剖析細(xì)胞代謝的變化.機(jī)體代謝處于動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，代謝物的產(chǎn)生量與消耗量應(yīng)相等[2]；一旦打破這種穩(wěn)態(tài)(即代謝異常)，則常會(huì)導(dǎo)致代謝疾病的發(fā)生[3].為了精準(zhǔn)地研究疾病特別是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的代謝物動(dòng)態(tài)變化，代謝流技術(shù)得以廣泛應(yīng)用.依據(jù)已有報(bào)道，代謝流分析技術(shù)在識(shí)別新的代謝途徑、鑒定代謝物的代謝命運(yùn)、發(fā)現(xiàn)新的代謝物，以及鑒定疾病診斷的生物標(biāo)志物等方面取得了重要進(jìn)展[4].

1 穩(wěn)定同位素示蹤劑的選擇

為量化細(xì)胞內(nèi)的代謝流通量，最重要且有效的方法之一是使用穩(wěn)定同位素示蹤劑[5].穩(wěn)定同位素示蹤劑是將某些特定原子替換成穩(wěn)定同位素標(biāo)記的代謝物，常用的穩(wěn)定同位素標(biāo)記有13C、2H、15N等.細(xì)胞的生命活動(dòng)基本單元是碳骨架，細(xì)胞中最重要的碳源是葡萄糖，其他的代謝物如谷氨酰胺、棕櫚酸、乙酸、乳酸等也可作為細(xì)胞的碳源[6]，它們也參與重要的代謝反應(yīng)如糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑等.本文從細(xì)胞代謝中若干重要代謝通路的角度闡述代謝流分析技術(shù)的流程及其在腫瘤代謝中的應(yīng)用價(jià)值.

1.1 以[U-13C6]-葡萄糖為示蹤劑區(qū)分進(jìn)入三羧酸循環(huán)的代謝途徑

經(jīng)典生物化學(xué)中，葡萄糖通過(guò)糖酵解通路轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸有兩種方式進(jìn)入三羧酸循環(huán)[7-8]：一種途徑是通過(guò)丙酮酸脫氫酶(PDH)，即丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A結(jié)合草酰乙酸生成檸檬酸；另一種途徑是通過(guò)丙酮酸羧化酶(PC)產(chǎn)生草酰乙酸[9](圖1).為了區(qū)分這兩條代謝途徑，可以使用[U-13C6]-葡萄糖作為示蹤劑.為了簡(jiǎn)化研究策略，僅考慮一輪三羧酸循環(huán)歷程：對(duì)于第一種途徑，來(lái)自葡萄糖的丙酮酸經(jīng)PDH產(chǎn)生的檸檬酸標(biāo)記應(yīng)為[M+2]，即含有2個(gè)13C 標(biāo)記；對(duì)于第二種途徑，來(lái)自葡萄糖的丙酮酸經(jīng)PC產(chǎn)生的草酸乙酸標(biāo)記應(yīng)為[M+3]，進(jìn)而檸檬酸標(biāo)記也含有3個(gè)13C標(biāo)記.由此可以計(jì)算出檸檬酸同位素異型體[M+2]/[M+3]的比例，即為通過(guò)PDH與通過(guò)PC的通量分流比例，三羧酸循環(huán)中其他代謝物也可反映相同信息.因此，比較丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)的兩種不同方式的代謝通量，使用13C標(biāo)記的葡萄糖或其他糖酵解過(guò)程中的代謝物(如丙酮酸)均可以實(shí)現(xiàn)研究目的.值得一提的是，若只為考察PC活性，可使用[1-13C]-丙酮酸作為示蹤劑，即通過(guò)PC轉(zhuǎn)化得到的檸檬酸含有1個(gè)13C，而通過(guò)PDH轉(zhuǎn)化得到的檸檬酸不含13C.

圖1 [U-13C6]-葡萄糖作為示蹤劑短時(shí)間內(nèi)通過(guò)PDH和PC進(jìn)入三羧酸循環(huán)

1.2 以[1,2-13C2]-葡萄糖為示蹤劑鑒別氧化型和非氧化型磷酸戊糖途徑

磷酸戊糖途徑含有氧化型和非氧化型兩條支路.在氧化型磷酸戊糖途徑中[10-11]，葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸后，經(jīng)歷氧化和脫羧成為5-磷酸核酮糖，再經(jīng)非氧化型磷酸戊糖途徑回到糖酵解過(guò)程中的果糖-6-磷酸.由于葡萄糖-6-磷酸經(jīng)歷氧化脫羧過(guò)程，其碳骨架上第一個(gè)被標(biāo)記的13C原子被脫去成為CO2釋放，所以重新進(jìn)入糖酵解的果糖-6-磷酸只有1個(gè)標(biāo)記的13C 原子；而未進(jìn)入磷酸戊糖途徑的葡萄糖-6-磷酸有2個(gè)標(biāo)記的13C原子，下游代謝物也是如此標(biāo)記模式.可以使用糖酵解下游代謝產(chǎn)物(如丙酮酸或乳酸等)計(jì)算其同位素異型體[M+1]與[M+2]的標(biāo)記比例，該比值即為葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑和僅經(jīng)糖酵解而不經(jīng)磷酸戊糖途徑的代謝通量分流比例(圖2).

圖2 [1,2-13C2]-葡萄糖為示蹤劑鑒別氧化型和非氧化型磷酸戊糖途徑

1.3 以[2,3,3-2H]-絲氨酸為示蹤劑鑒別線粒體和胞漿中的一碳代謝

由葉酸輔酶介導(dǎo)的一碳代謝支持多種生理活動(dòng)的正常進(jìn)行，包括核苷酸合成、氨基酸代謝、表觀遺傳調(diào)節(jié)和氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持[12].近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道了線粒體中一碳代謝的生物學(xué)重要性，于是引入L-[2,3,3-2H]-絲氨酸作為穩(wěn)定同位素示蹤劑，以闡明一碳單元在細(xì)胞中的代謝模式.

首先，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)利用四氫葉酸(THF)轉(zhuǎn)化絲氨酸為甘氨酸，并產(chǎn)生5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-meTHF)，且該反應(yīng)可逆.SHMT1和SHMT2分別在胞漿和線粒體中分解絲氨酸，其流動(dòng)方向取決于每個(gè)區(qū)室中一碳單元的供需情況[13].在這兩個(gè)區(qū)室中都編碼可以實(shí)現(xiàn)5,10-meTHF到甲酸的轉(zhuǎn)化代謝酶且該反應(yīng)可逆，在胞漿中為亞甲基四氫葉酸脫氫酶1(MTHFD1)，在線粒體中為雙功能脫氫酶/環(huán)化水解酶(MTHFD2/2L)[14].另外，以5,10-meTHF為底物，胸苷合成酶(TYMS)可將一個(gè)甲基單位轉(zhuǎn)移至單磷酸脫氧尿苷(dUMP)上，以合成三磷酸脫氧胸苷(dTMP)，該過(guò)程發(fā)生在胞漿中.

通過(guò)追蹤[2,3,3-2H3]-絲氨酸中的2H插入一碳代謝的終產(chǎn)物(如胸苷)，可以確定絲氨酸的區(qū)室化代謝[15].絲氨酸若在線粒體中代謝會(huì)造成3位碳的1個(gè)質(zhì)子在氧化成甲酸鹽的過(guò)程中丟失(如圖3中藍(lán)色點(diǎn)所示).此外，[2,2-2H2]-甘氨酸在線粒體中代謝時(shí)2位碳的1個(gè)質(zhì)子氧化成甲酸鹽丟失(如圖3中綠色點(diǎn)所示).此時(shí)丟失的甲酸鹽在胞漿葉酸代謝池中發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)生同位素異型體[M+1]的dTMP；而在胞漿中，被SHMT1分解的絲氨酸則把2個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)移至5,10-meTHF上，產(chǎn)生[M+2]的dTMP.通過(guò)分析dTMP的同位素異型體[M+1]/[M+2]即可知絲氨酸在線粒體與胞漿中的代謝分流比例.

NAD(P)+.氧化型輔酶Ⅱ(或Ⅰ)；NAD(P)H.還原型輔酶Ⅱ(或Ⅰ)；GLDC.甘氨酸脫羧酶.

1.4 2H標(biāo)記示蹤NADH或NADPH

NADH和NADPH是細(xì)胞中重要的能量和還原物質(zhì).傳統(tǒng)的NADH和NADPH檢測(cè)使用試劑盒，僅能觀察細(xì)胞中NADH或NADPH的變化趨勢(shì).盡管遺傳熒光標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞定位，但依然無(wú)法知曉NADH或NADPH的具體生化反應(yīng)歷程.為此，有必要使用2H標(biāo)記的穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)來(lái)準(zhǔn)確地追蹤NADH或NADPH的產(chǎn)生.這些代謝物的降解速度比其他碳水化合物要快得多，特別是NADPH極易被氧化，故代謝物提取與檢測(cè)需要特別注意方法的選擇及優(yōu)化[16].磷酸戊糖途徑中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGD)，其他酶如異檸檬酸脫氫酶(IDH)、蘋(píng)果酸激酶、乙醛脫氫酶和MTHFD也可催化產(chǎn)生NADPH[17-18]，故可引入[3-2H]-葡萄糖或[1-2H]-葡萄糖來(lái)標(biāo)記NADP2H[19]；另外，葡萄糖的4位碳上標(biāo)記2H，則可以通過(guò) 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的作用來(lái)標(biāo)記NAD2H(圖4).由此可見(jiàn)，同一代謝物同一元素不同的標(biāo)記位置所能示蹤的代謝通路不同，故需根據(jù)所要回答的科學(xué)問(wèn)題和生物化學(xué)反應(yīng)原理選擇合適的穩(wěn)定同位素標(biāo)記示蹤劑.

LDH.乳酸脫氫酶.

2 代謝途徑通量實(shí)現(xiàn)的基本流程

2.1 天然同位素的校正

當(dāng)引入穩(wěn)定同位素后，依據(jù)機(jī)體的生物化學(xué)反應(yīng)，代謝物也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的同位素分布模式.同位素的產(chǎn)生有兩個(gè)來(lái)源：一方面是摻入帶有同位素標(biāo)記的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；另一方面也可能是由天然的同位素豐度所致.生物分子中最常見(jiàn)的天然同位素是13C，天然豐度為1.07%[20].其他同位素原子比較少見(jiàn)，但還是會(huì)有重大影響.15N天然豐度為0.368%，2H天然豐度為0.011 5%，17O天然豐度為0.038%，18O天然豐度為0.205%，29Si天然豐度為4.683%，30Si天然豐度為3.087%[21-23].以細(xì)胞中主要的能量載體三磷酸腺苷(ATP，C10H16N5O13P3)為例，13C的天然豐度占[M+1]峰值的大部分，而18O是[M+2]峰的最大干擾因素.由于天然同位素的存在，依據(jù)二項(xiàng)式分布定理，原本標(biāo)記水平較低的組分在數(shù)據(jù)上顯示水平較高，所以此時(shí)應(yīng)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)到的同位素標(biāo)記分布質(zhì)量分?jǐn)?shù)解卷積，以求取準(zhǔn)確的同位素標(biāo)記分?jǐn)?shù)，這一過(guò)程稱作同位素豐度校正.

目前已經(jīng)出現(xiàn)一系列校正軟件，以IsoCor軟件[24]為典型代表，其主要優(yōu)勢(shì)在于可校正各種元素種類(lèi)，原理如下：

ICcor=CM-1·ICmeas，

(1)

其中，ICcor表示校正后的實(shí)際同位素分布信息，CM-1表示校正矩陣，ICmeas表示經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)得到的原始同位素分布信息.

相比于IsoCor軟件，AccuCor軟件[25]所得結(jié)果則更加準(zhǔn)確.考慮到質(zhì)譜的分辨率(即區(qū)分兩個(gè)質(zhì)量相近離子的能力)，如對(duì)于絲氨酸(C3H7NO3)中的13C或15N均是[M+1]，若是低分辨率則無(wú)法區(qū)分，若是高分辨率則兩個(gè)峰得以分開(kāi).

Δm≥1.66×fwhm,

(2)

其中，Δm表示峰質(zhì)心的質(zhì)荷比差值，fwhm表示半峰全寬.式(2)考慮了質(zhì)譜分辨率，使IsoCor軟件在校正高分辨率質(zhì)譜所得數(shù)據(jù)誤差較大的問(wèn)題得到明顯改善.

關(guān)于同時(shí)校正雙同位素(如C和N)標(biāo)記的軟件也逐漸出現(xiàn)[26].校正天然同位素豐度的軟件日趨理想化將有助于獲取真實(shí)標(biāo)記信息.

2.2 代謝通量分析(MFA)的相關(guān)算法

當(dāng)引入穩(wěn)定同位素示蹤后，分析目的是準(zhǔn)確映射出示蹤劑參與代謝通路的活性變化[23,27].MFA已是一項(xiàng)發(fā)展成熟的定量研究代謝的重要技術(shù)[28]，使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的示蹤信息可計(jì)算出通量，即細(xì)胞的代謝反應(yīng)速率.

如圖5(a)所示，當(dāng)引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記A后，B的生成通量是fin，消耗通量是fout，若此時(shí)達(dá)到代謝物穩(wěn)態(tài)，則滿足

fin=fout=fB.

(3)

若處于代謝物穩(wěn)態(tài)而同位素標(biāo)記非穩(wěn)態(tài)時(shí)，如圖5(b)所示，當(dāng)B的未標(biāo)記形式逐漸被標(biāo)記形式所取代，可得B的未標(biāo)記形式隨時(shí)間變化的函數(shù)

FC表示代謝物的同位素分布模式濃度占代謝物總濃度的百分比.

(4)

其中，cB,U表示未標(biāo)記的B的濃度，cB,T表示代謝物B的總濃度，其解析解為

(5)

此時(shí)即可求得穩(wěn)定狀態(tài)下B的代謝通量fB.

然而在非穩(wěn)定狀態(tài)下求解代謝通量較為復(fù)雜，對(duì)于B的標(biāo)記變化情況可列出

(6)

其中,ΔmB表示經(jīng)過(guò)t時(shí)間后B的標(biāo)記模式(同位素標(biāo)記分布比例)凈改變，mA和mB分別表示代謝物A和B的標(biāo)記模式，V表示細(xì)胞的體積.

已知非穩(wěn)態(tài)代謝模式下，代謝物的標(biāo)記模式受代謝物的生成通量和濃度大小影響，

(7)

當(dāng)明確cB,T以及mA、mB后，即可求得此時(shí)fin的值.

有關(guān)MFA中常用的穩(wěn)定同位素標(biāo)記及其所示蹤的關(guān)鍵代謝通路見(jiàn)表1.

表1 常用穩(wěn)定同位素示蹤劑及其在代謝通路示蹤中的應(yīng)用

3 代謝流分析技術(shù)應(yīng)用以及腫瘤代謝的解析

3.1 葡萄糖的代謝命運(yùn)——新生化途徑的發(fā)現(xiàn)

代謝性疾病發(fā)生的一個(gè)重要原因是過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)攝取導(dǎo)致溢流代謝(overflow metabolism)的發(fā)生，主要表現(xiàn)為代謝底物的不完全氧化及代謝副產(chǎn)物的產(chǎn)生.如Warburg效應(yīng)指出：在腫瘤細(xì)胞中，不論氧氣是否充足，葡萄糖代謝都更傾向于向乳酸的轉(zhuǎn)化[52-53].乙酰輔酶A是一個(gè)中心碳代謝的中間代謝物，被廣泛用于生物大分子合成和能量產(chǎn)生，以支持細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，在人體中其主要來(lái)自葡萄糖或其他常規(guī)碳源，如谷氨酰胺和脂肪酸等[54-55].已有研究報(bào)道在一些壓力應(yīng)激條件下(如缺氧)，腫瘤細(xì)胞會(huì)利用乙酸作為其主要的碳源以支持細(xì)胞存活和增殖.乙酸鹽的代謝為乙酰輔酶A的產(chǎn)生提供了一個(gè)并行途徑，因此乙酸鹽可以支持蛋白乙酰化及脂肪酸合成，而與檸檬酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A無(wú)關(guān)[56].鑒于可替代的碳源通常來(lái)自溢流代謝，Locasale課題組[39,57-58]開(kāi)展了對(duì)細(xì)胞內(nèi)乙酸合成路徑的研究：通過(guò)引入18O標(biāo)記的氧氣，運(yùn)用液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中新生成的被18O標(biāo)記的乙酸，證明活性氧(ROS)可以作為親核試劑；隨后結(jié)合[13C3]-丙酮酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記，證實(shí)丙酮酸經(jīng)非酶促反應(yīng)生成乙酸鹽.上述結(jié)果提示葡萄糖代謝在清除ROS中發(fā)揮一定作用[59].如何結(jié)合葡萄糖代謝與氧化應(yīng)激并將其作為抗癌的合成致死策略，可能是腫瘤治療未來(lái)研究的一個(gè)新方向.

3.2 谷氨酰胺的代謝命運(yùn)——碳與氮的協(xié)同代謝

增殖的腫瘤細(xì)胞會(huì)進(jìn)行細(xì)胞代謝重編程，以適應(yīng)不利的生長(zhǎng)環(huán)境(如缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等).Warburg效應(yīng)提及腫瘤細(xì)胞會(huì)增加葡萄糖的代謝通量用以分泌乳酸，這提示腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)缺失了重要的碳源葡萄糖[60].然而細(xì)胞中另一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)谷氨酰胺，是血液中含量最豐富的氨基酸，也可作為一種重要的碳源以支持能量產(chǎn)生及物質(zhì)積累.一個(gè)谷氨酰胺分子包含5個(gè)C原子和2個(gè)N原子.當(dāng)谷氨酰胺中的C被過(guò)度利用時(shí)，已有研究報(bào)道谷氨酰胺可通過(guò)谷氨酰胺酶(GLS)和谷氨酸脫氫酶(GLUD)的脫氨作用為細(xì)胞提供α-酮戊二酸[61]，伴隨此過(guò)程產(chǎn)生大量的溢流氨會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，這對(duì)于增殖的腫瘤細(xì)胞非常不利.

近期，李兵輝團(tuán)隊(duì)[62]揭示了谷氨酰胺中C和N的協(xié)同代謝機(jī)制.目前谷氨酰胺中的C用于合成脂類(lèi)已得到廣泛認(rèn)可，已有研究報(bào)道谷氨酰胺的N在腫瘤細(xì)胞中代謝成氨，具有潛在毒性[63].在缺氧條件下，核苷酸的前體在腫瘤細(xì)胞中積累，主要包括氨甲酰天冬氨酸、二氫乳清酸和乳清酸等；進(jìn)一步使用多種穩(wěn)定同位素標(biāo)記的示蹤分析，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺的N在缺氧條件下主要富集在二氫乳清酸和乳清酸中，并被排出體外[63-65].該研究揭示了谷氨酰胺中C和N的協(xié)同代謝命運(yùn)，為臨床上腫瘤的靶向治療提供了重要參考.

實(shí)際上，異常改變的、高活性的代謝過(guò)程中生成的氨可以作為“代謝廢物”回收，被重新利用合成氨基酸為腫瘤細(xì)胞提供氮源[66]；而且氨的過(guò)度累積可以被鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的蛋白翻譯過(guò)程所“感知”，具有調(diào)控多胺合成從而影響腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能[67].

3.3 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間的代謝互作——線粒體與細(xì)胞質(zhì)

代謝活動(dòng)的亞細(xì)胞區(qū)室定位是定義真核細(xì)胞的重要標(biāo)志之一.不同代謝底物和酶的混合池提供了細(xì)胞代謝的靈活性，以適應(yīng)細(xì)胞的內(nèi)部需求并響應(yīng)外部干擾.已有報(bào)道指出在細(xì)胞器之間的代謝互作可支持腫瘤細(xì)胞的存活與生長(zhǎng)[68-70].如胞質(zhì)中的一碳通量可以彌補(bǔ)線粒體中葉酸代謝途徑的缺失，線粒體與胞質(zhì)間的蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭機(jī)制在電子傳遞鏈?zhǔn)軗p時(shí)可以支持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)等，然而細(xì)胞器之間的代謝交互目前尚不清晰[71].Lee等[68]建立了基于亞細(xì)胞器區(qū)室分離的空間代謝組學(xué)方法，描述了在腫瘤細(xì)胞中谷氨酰胺代謝的全景.已有研究報(bào)道了多種快速分離細(xì)胞器的方法及豐富的腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝物信息；為了進(jìn)一步明確定量線粒體與胞質(zhì)之間的代謝通量，以宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)合穩(wěn)定同位素標(biāo)記([U-13C6]-葡萄糖和[U-13C5]-谷氨酰胺)、線粒體快速分離技術(shù)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及數(shù)學(xué)模型建立的空間代謝流組學(xué)方法，定量谷氨酰胺在線粒體及胞質(zhì)之間的代謝通量，揭示了在標(biāo)準(zhǔn)常氧條件下，還原型IDH1調(diào)控的谷氨酰胺可以作為細(xì)胞中脂肪酸生物合成的碳源凈貢獻(xiàn)者[68].該工作將代謝流的研究進(jìn)一步拓展到亞細(xì)胞器層次，具有重要的參考意義.從這一角度來(lái)講，關(guān)于細(xì)胞內(nèi)其他細(xì)胞器(如溶酶體、過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)中所包含的代謝生化反應(yīng)及代謝互作仍有待于研究，且此方法是否可應(yīng)用于臨床診斷或?qū)で笊飿?biāo)志物仍需深入探索.

3.4 能量代謝中被忽視的碳源

哺乳動(dòng)物組織通過(guò)血液循環(huán)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括糖、脂肪、蛋白等的供應(yīng)[72].在有氧條件下，通常認(rèn)為葡萄糖被組織經(jīng)三羧酸循環(huán)方式完全“燃燒”產(chǎn)生CO2.然而Warburg效應(yīng)提示組織和腫瘤細(xì)胞會(huì)更傾向于將大部分葡萄糖進(jìn)行糖酵解，經(jīng)分解代謝成為乳酸.長(zhǎng)久以來(lái)，基于劇烈運(yùn)動(dòng)下的肌肉或缺氧組織中積累的特性，乳酸都被視作無(wú)氧條件下細(xì)胞呼吸代謝產(chǎn)生的廢物.盡管被認(rèn)知為代謝廢物，但機(jī)體并不能直接排泄乳酸，關(guān)于血液中乳酸代謝的生理意義及潛在代謝機(jī)制也尚不明確.

Joshua Rabinowitz團(tuán)隊(duì)[73]提出了顛覆性觀點(diǎn)：乳酸不僅是無(wú)氧條件下的代謝產(chǎn)物，更可能是人體最重要的能量載體，同時(shí)它還是癌細(xì)胞最重要的直接營(yíng)養(yǎng)來(lái)源.通過(guò)13C標(biāo)記追蹤血液循環(huán)中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺等30種含碳代謝物的流通量，他們得出循環(huán)通量最大的是乳酸，這表明乳酸不僅是缺氧條件下的一種代謝產(chǎn)物(即所熟知的代謝廢物)，而且是與葡萄糖、氨基酸和酮體一樣關(guān)鍵的能量載體，甚至比這些以往認(rèn)為的供能物質(zhì)更重要[73].這一發(fā)現(xiàn)為今后糖尿病和其他有關(guān)能量代謝疾病的研究提供了新思路，對(duì)于癌癥的研究也有重要意義.實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的研究均基于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，而不能使細(xì)胞完全模擬體內(nèi)環(huán)境，因此真正在體內(nèi)水平了解癌癥的代謝特性才更有助于發(fā)現(xiàn)癌癥的代謝弱點(diǎn)并給予治療.

類(lèi)似地，丙氨酸可以逆轉(zhuǎn)為丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，特別是在自噬條件下，腫瘤細(xì)胞可利用丙氨酸作為能量來(lái)源的替代碳源[74].此外，肌苷通過(guò)嘌呤核苷磷酸化酶產(chǎn)生1-磷酸核糖，轉(zhuǎn)化成5-磷酸核糖，進(jìn)而通過(guò)磷酸戊糖途徑和糖酵解通路進(jìn)入三羧酸循環(huán)以提供能量[75].絲氨酸消旋酶(serine racemase)不僅可以把L-絲氨酸轉(zhuǎn)化為D-絲氨酸，還可以水解產(chǎn)生丙酮酸，為腫瘤細(xì)胞提供能量[76].通?？梢圆捎梅€(wěn)定同位素標(biāo)記的示蹤分析檢測(cè)三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的標(biāo)記情況，從而獲悉感興趣的代謝物能否在某些特定病理、生理?xiàng)l件下作為替代碳源參與能量代謝.

3.5 果糖——真實(shí)的代謝命運(yùn)

由于人們對(duì)甜味的滿足感，在過(guò)去的兩個(gè)世紀(jì)里，果糖的人均消費(fèi)量增大約100倍[77].高果糖的攝入也逐漸被認(rèn)為是代謝疾病的罪魁禍?zhǔn)?流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示果糖攝取與肥胖、非酒精性脂肪肝、Ⅱ型糖尿病、腎功能紊亂和心血管疾病之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性[38]，然而這種聯(lián)系的生物學(xué)機(jī)制仍存在爭(zhēng)論.已有研究報(bào)道，果糖轉(zhuǎn)變?yōu)楣?1-磷酸主要是由己酮糖(磷酸)激酶(KHK)調(diào)控的，且KHK主要在肝臟中表達(dá)，因此一般認(rèn)為飲食中攝入的果糖代謝主要在肝臟中完成[78].Joshua Rabinowitz團(tuán)隊(duì)[73]在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：正常飲食攝入的果糖約90%主要在小腸中代謝，而并非過(guò)去認(rèn)為的肝臟；如果攝入果糖量過(guò)高，那么多余的部分會(huì)被轉(zhuǎn)移至肝臟中進(jìn)行分解代謝.上述研究通過(guò)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的代謝流分析證實(shí)小腸是果糖代謝的主要場(chǎng)所，這提示體內(nèi)代謝流分析技術(shù)對(duì)于鑒定重要小分子的代謝命運(yùn)具有重要意義.

4 代謝流分析技術(shù)在腫瘤動(dòng)態(tài)變化中的應(yīng)用

腫瘤細(xì)胞代謝重編程是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征.根據(jù)具體的科學(xué)問(wèn)題，選擇合適的穩(wěn)定同位素示蹤劑開(kāi)展代謝流分析，有助于解析代謝通路活性隨腫瘤發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化，從而鑒定腫瘤的代謝弱點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療[79].以受體酪氨酸為例，不同受體酪氨酸可能驅(qū)動(dòng)不同的代謝模式.為此，本課題組[80]采用多種穩(wěn)定同位素標(biāo)記的示蹤劑，發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)驅(qū)動(dòng)的腫瘤細(xì)胞多依賴于絲氨酸合成通路，而成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)驅(qū)動(dòng)的腫瘤細(xì)胞則依賴于乳酸代謝；因此，使用絲氨酸合成通路的限速酶3-磷酸甘油酸脫氫酶抑制劑或LDH抑制劑，可分別有效抑制EGFR或FGFR驅(qū)動(dòng)的腫瘤生長(zhǎng).對(duì)于小鼠體內(nèi)的代謝流分析，則可通過(guò)頸靜脈插管灌流穩(wěn)定同位素標(biāo)記的示蹤劑，同樣可以定量分析癌組織與癌旁組織的代謝通路活性差異[81].當(dāng)使用[1,2-13C2]-葡萄糖作為示蹤劑時(shí)，鑒定了非氧化型戊糖磷酸途徑的轉(zhuǎn)酮醇酶促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制，即促進(jìn)氧化型戊糖磷酸途徑回流至糖酵解通路而產(chǎn)生過(guò)量乳酸；而當(dāng)敲除轉(zhuǎn)酮醇酶基因時(shí)，5-磷酸核糖出現(xiàn)累積并促進(jìn)核苷酸合成，從而穩(wěn)定基因組，減緩肝臟損傷和腫瘤的生長(zhǎng)[82].在肺癌研究中，以13C標(biāo)記的谷氨酰胺或谷氨酸示蹤還原型谷胱甘肽的合成，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)肺癌組織比癌旁組織中的谷胱甘肽合成更快[83].

代謝流分析技術(shù)還可以揭示體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)代謝物的周轉(zhuǎn)通量，以及組織中糖酵解中間代謝物的來(lái)源，這將有助于鑒定器官代謝交流[84].最近一項(xiàng)研究將體內(nèi)代謝流分析技術(shù)應(yīng)用于黑色素瘤的斑馬魚(yú)(Daniorerio)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝臟與黑色素瘤之間存在丙氨酸循環(huán)[85].穩(wěn)定同位素標(biāo)記的示蹤分析還可以解析腫瘤微環(huán)境中的代謝物競(jìng)爭(zhēng)與交換.近期的一項(xiàng)研究中，用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的代謝流分析技術(shù)證實(shí)了腫瘤微環(huán)境中的B細(xì)胞可以分泌出γ-氨基丁酸，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)作用[86].綜上所述，開(kāi)發(fā)和運(yùn)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的代謝流分析技術(shù)，有助于解析代謝通路活性、代謝重編程規(guī)律與代謝物交換等生物化學(xué)機(jī)制.

5 總結(jié)與展望

本文所提及的體外研究均最大程度地利用了代謝流分析的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，著眼于某一關(guān)鍵代謝底物或中間代謝產(chǎn)物，通過(guò)監(jiān)測(cè)代謝物在特定代謝途徑和局部代謝網(wǎng)絡(luò)上的流通發(fā)現(xiàn)新機(jī)制.不僅如此，在體內(nèi)研究中，甚至發(fā)現(xiàn)了新的顛覆性代謝通路的可能性，即腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源.由于體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，細(xì)胞間、器官間的信號(hào)傳遞十分頻繁，所以研究人員將整個(gè)研究置于更復(fù)雜的層次上，以組織、器官整體以及血液循環(huán)作為研究對(duì)象，再通過(guò)代謝流分析技術(shù)監(jiān)測(cè)和定量代謝物的分布與通量變化.體內(nèi)與體外的代謝流分析分別從宏觀與微觀的角度研究代謝，兩者互補(bǔ)且充分結(jié)合了定性與定量的思想，從而精準(zhǔn)地追蹤代謝物的代謝命運(yùn).可以預(yù)見(jiàn)，代謝流技術(shù)方法的進(jìn)步與完善將為人們揭開(kāi)更多生物代謝的謎團(tuán).

目前代謝流分析技術(shù)尚存一些未解決的問(wèn)題，如在亞細(xì)胞層次上的研究進(jìn)展有限，所需成本較高，且如何保持代謝物的狀態(tài)也是關(guān)鍵.針對(duì)這些問(wèn)題，有必要發(fā)展快速分離細(xì)胞器以及同時(shí)分離多種細(xì)胞器的方法，提高檢測(cè)更多代謝物的能力，更新代謝模型和分析軟件，并兼顧降低成本的問(wèn)題.