不同甲基類誘食劑對羅氏沼蝦的誘食效果

王曉倩，王天明，徐秀文

（1.浙江海洋大學(xué)國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii 又名馬來西亞大蝦、淡水長臂大蝦和大頭蝦，隸屬于甲殼綱Crustacea、十足目Decapoda，是世界上個體最大的淡水蝦之一。羅氏沼蝦是高蛋白、低脂肪的名貴水產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量約為20%，脂肪含量僅1.97%左右。它具有個體大，食性廣，養(yǎng)殖周期短，出肉率高，肉嫩爽口等優(yōu)點，經(jīng)濟價值較高，有很好的國內(nèi)外市場前景。羅氏沼蝦的蚤狀幼體喜集群且需要生活在一定鹽度的半咸水中，仔蝦經(jīng)過淡水馴化后可進入淡水養(yǎng)殖[1]。我國于1976 年從日本引進羅氏沼蝦，次年突破其人工繁育[2]，進而擴大其養(yǎng)殖規(guī)模。同時，由于海水對蝦類的養(yǎng)殖受病害影響大，其產(chǎn)量下降快，且短期內(nèi)很難快速回升。因此，羅氏沼蝦有望作為補充或頂替海水蝦的候選蝦。目前，在國際市場上，淡水蝦這類潛在品種還沒有得到很好的利用，在未來，羅氏沼蝦的養(yǎng)殖將會是國家推動蝦類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展及出口創(chuàng)匯的一個良好商機[3-4]。

植物蛋白源和其他非常規(guī)飼料原料在水產(chǎn)配合飼料中使用量的增加，造成配合飼料適口性較差和殘留過多，導(dǎo)致食物資源浪費，養(yǎng)殖水體污染、水產(chǎn)動物死亡等問題的出現(xiàn)。而誘食劑（feeding attractant）因其能夠提高動物食欲、攝食量并促進消化，有助于解決當前配合飼料的適口性和轉(zhuǎn)化率問題，而在未來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有廣闊的發(fā)展前景[2]。不同誘食劑對同一種水產(chǎn)動物的誘食效果不同，目前水產(chǎn)動物中使用的較為廣泛的誘食劑有：甜菜堿、DMPT 和氯化膽堿[2,5]。甜菜堿又名甘氨酸三甲胺內(nèi)鹽，同蛋氨酸一樣，是一種高效活性甲基供應(yīng)體，不僅對水產(chǎn)動物有誘食作用，還具有緩和應(yīng)激反應(yīng)、提高動物成活率的功效[6]。膽堿是一種維生素類物質(zhì)，可調(diào)節(jié)脂肪代謝，防止脂肪在器官中的累積與病變，而氯化膽堿是膽堿的一類鹽酸鹽，是合成磷脂的原料，常用作水產(chǎn)動物飼料添加劑，用來提升動物的生產(chǎn)性能，降低飼料損耗[7]。DMPT即二甲基-β-丙酸噻啶，是一種廣泛存在于海洋生物中的活性物質(zhì)，不僅能促進甲殼類的攝食和脫殼行為，還能提高其運動和抗應(yīng)激能力。DMPT 的作用范圍廣且顯著，幾乎對所有的水產(chǎn)動物都起作用[8]。

同一誘食劑的不同濃度對同一水產(chǎn)動物的誘食效果也不同[9-12]，飼料添加0.2%的甜菜堿能顯著提高凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei 的攝食量[13]，飼料中添加0.21%氯化膽堿能降低異育銀鯽Carassiusauratus gibelio 肝臟中脂肪的含量，提高其生長性能，增強其抗氧化和應(yīng)激能力[14]，飼料中添加0.2%的DMPT能顯著提高極火蝦的攝食量[15]，所以有必要研究開發(fā)羅氏沼蝦誘食劑的適宜濃度。本研究配制了不同濃度（0.2%、0.5%、1%和1.5%）的甜菜堿、氯化膽堿和DMPT，分別研究它們對羅氏沼蝦的誘食效果，探討3 種誘食劑對羅氏沼蝦腸道內(nèi)脂肪酶、肝胰腺內(nèi)淀粉酶和胃組織中胃蛋白酶活性的影響，為篩選適宜的羅氏沼蝦誘食劑種類和飼料添加劑量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與養(yǎng)殖管理

實驗使用的羅氏沼蝦購自珠海輝騰水產(chǎn)養(yǎng)殖公司的淡水馴化苗種，蝦苗平均體長0.8±0.20 cm，放養(yǎng)于放置遮蔽物的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，養(yǎng)殖水溫控制在28 ℃左右，pH 控制在7.8～8.3，溶氧量保持在5 mg·L-1以上（使用海利牌V-30 超靜強力泵，排氣量30 L·min-1），氨氮小于0.15 mg·L-1，亞硝酸鹽小于0.01 mg·L-1。養(yǎng)殖周期為3 個月，其間采用飽食投喂法，每天在上午9 點和下午5 點各投喂1 次，在每次投喂結(jié)束1 h后進行吸污（每次控制污水量在總水量的20%，并立即補充等量的養(yǎng)殖用水）。隨機挑選健康活潑、附肢齊全、大小一致（平均體長3.52±0.20 cm，平均體重3.02±0.20 g）的羅氏沼蝦在饑餓24 h 后分別進行誘食實驗和酶活測定實驗。

1.2 實驗方法

誘食實驗：實驗裝置由1 個帶有出水龍頭的觀察缸（亞克力材質(zhì)，60 cm×30 cm×10 cm）與2 個蠕動泵（各帶有1 個泵管和1 個泵桶，LONGER BT100-2J）構(gòu)成。2 個泵管（一端固定在觀察缸上，一端放置于泵桶中，中間固定在蠕動泵上）分別充當左右進水口，1 個出水龍頭充當出水口，具體裝置見示意圖1A。將觀察缸中加入養(yǎng)殖用水13.86 L，在2 個蠕動泵的泵桶中分別添加紫色（泵管在左）和紅色（泵管在右）的無毒有色染料，設(shè)定蠕動泵的水流量為76 mL·min-1，開啟蠕動泵，觀察2 根泵管中的染料在觀察缸中的擴散路線，待2 種染料分別均勻充滿觀察缸（保證觀察缸與地面平行）后開展實驗（擴散路線見圖1B 和C）。將3 種誘食劑，甜菜堿（98%，華菱化學(xué)）、氯化膽堿（98%，華菱化學(xué)）、DMPT（98.5%，華菱化學(xué)）分別用蒸餾水配制成不同的濃度（甜菜堿：0.2%、0.5%、1%和1.5%；氯化膽堿和DMPT：0.1%、0.5%、1%和1.5%），安裝并調(diào)整好相機（索尼HDR-760EA）和三腳架（云騰668）的位置，清洗晾干原有泵桶與泵管中的溶液，將不同濃度的誘食劑分別加入泵桶中，啟動蠕動泵。隨機挑選1 只饑餓24 h 的羅氏沼蝦放入觀察缸中，錄制15 min。每種濃度的誘食劑重復(fù)6 次，左右泵桶各放3 次（為消除實驗對象對于方位的偏好性），每次實驗后將全套實驗裝置清洗干凈并用酒精徹底消毒（為消除誘食劑之間的干擾）。

酶活測定：準備10 個大小一致的玻璃缸（30 cm×20 cm×20 cm），隨機選取9 個缸分別加入18 L 誘食實驗中已配好的低、中、高濃度的誘食劑溶液（處理組：0.2%的甜菜堿、1%甜菜堿、1.5%甜菜堿、0.1%氯化膽堿、0.5%氯化膽堿和1.5%氯化膽堿、0.1% DMPT、1% DMPT、1.5% DMPT），其余1 個缸加入等量的養(yǎng)殖用水（對照組）。隨機挑選饑餓了24 h 的羅氏沼蝦，分別放在各個玻璃缸中，每個玻璃缸放6 只（n=6），等待4 h后，將蝦取出，迅速解剖分離蝦的胃、腸道和肝胰腺，將每6 只蝦的相同組織合并為1 個樣品，每個樣品設(shè)3 個重復(fù)。準確稱取冰水浴下機械勻漿，2 500 r·min-1，離心10 min，取上清分別測定胃中胃蛋白酶（pepsin，PP）、腸道中脂肪酶（lipase，LPS）和肝胰腺中淀粉酶（amylase，AMS）的活性，各消化酶酶活均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過ANY-maze 軟件分析實驗視頻得到羅氏沼蝦行為軌跡路線和熱圖等相關(guān)數(shù)據(jù)。采用SPSS 26.0軟件和Excel 2019 軟件對羅氏沼蝦的行為參數(shù)和酶活數(shù)據(jù)進行分析和作圖。數(shù)據(jù)分析時，應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan 多重比較，分析各組間平均值、標準差和顯著性水平，其中，P＞0.05 時差異不顯著；P＜0.05 時差異顯著，P＜0.01 時差異極顯著。結(jié)果用平均值±標準誤（Mean±SE）表示。停留時間的定義如下：羅氏沼蝦進入觀察缸中實驗區(qū)域（誘食劑區(qū)域和對照劑區(qū)域）的停留時間（單位·s-1）。

2 結(jié)果

2.1 1%濃度的誘食劑分別對羅氏沼蝦運動軌跡的影響

羅氏沼蝦代表性的運動軌跡圖和熱圖中，誘食劑（1%）在左方區(qū)域，普通養(yǎng)殖用水在右方區(qū)域作對照劑，羅氏沼蝦在誘食劑區(qū)域的軌跡路線均多于在對照劑區(qū)域的軌跡路線（圖2）。

圖2 羅氏沼蝦在誘食劑（1%）區(qū)域及其對照劑（水）區(qū)域中代表性的運動軌跡圖和熱圖（甜菜堿（A）、氯化膽堿（B）和DMPT（C））Fig.2 Representative motion track and heat map of M.rosenbergii in the attractant region and its control region（betaine（A）,choline chloride（B）and DMPT（C））

2.2 不同濃度的誘食劑分別對羅氏沼蝦停留時間的影響

羅氏沼蝦在各濃度的甜菜堿、氯化膽堿和DMPT 區(qū)域的停留時間均大于對照劑區(qū)域的停留時間（圖3A、B 和C）。其中，羅氏沼蝦在甜菜堿濃度為1%和1.5%時與對照劑相比有顯著差異（P＜0.05）；羅氏沼蝦在氯化膽堿濃度為0.5%和1%時，與對照劑差異顯著（P＜0.05）；羅氏沼蝦在DMPT 濃度為1%時，與對照劑差異顯著（P＜0.05）。

圖3 羅氏沼蝦在不同濃度誘食劑區(qū)域及其對照劑（水）區(qū)域中的停留時間（甜菜堿（A）、氯化膽堿（B）和DMPT（C））Fig.3 Residence time of M.rosenbergii in different concentrations of attractant region and its control region（betaine（A）,choline chloride（B）and DMPT（C））

2.3 甜菜堿、DMPT 和氯化膽堿對羅氏沼蝦脂肪酶活性的影響

在低、中、高3 種不同的誘食劑濃度中，羅氏沼蝦腸道內(nèi)脂肪酶的活性隨著甜菜堿濃度的增加而增加，隨著氯化膽堿濃度的增加表現(xiàn)為先增加后減少（圖4A 和B）。羅氏沼蝦脂肪酶活性在濃度分別為1%和1.5%的甜菜堿、0.1%的DMPT 和0.5%的氯化膽堿時與對照組的差異顯著（P＜0.05），且當甜菜堿的濃度為1.5%時，差異極顯著（P＜0.001），因中濃度（1%）和高濃度（1.5%）的DMPT 均對羅氏沼蝦有致死效應(yīng)，故無法判別（圖4C）。

圖4 不同濃度誘食劑對羅氏沼蝦脂肪酶活性的影響（甜菜堿（A）、氯化膽堿（B）和DMPT（C））Fig.4 Effects of different concentrations of attractant on lipase activity of M.rosenbergii（betaine（A）,choline chloride（B）and DMPT（C））

2.4 甜菜堿、DMPT 和氯化膽堿對羅氏沼蝦淀粉酶活性的影響

在低、中、高3 種不同的誘食劑濃度中，羅氏沼蝦肝胰腺內(nèi)淀粉酶的活性隨著甜菜堿濃度的增加而增加，隨著氯化膽堿濃度的增加表現(xiàn)為先增加后減少（圖5A 和B）。羅氏沼蝦肝胰腺內(nèi)淀粉酶的活性在濃度分別為1%和1.5%的甜菜堿和0.5%的氯化膽堿時與對照組的差異顯著（P＜0.05），因中濃度（1%）和高濃度（1.5%）的DMPT 均對羅氏沼蝦有致死效應(yīng)，故無法判別（圖5C）。

圖5 不同濃度誘食劑對羅氏沼蝦淀粉酶活性的影響（甜菜堿（A）、氯化膽堿（B）和DMPT（C））Fig.5 Effects of different concentrations of attractant on amylase activity of M.rosenbergii（betaine（A）,choline chloride（B）and DMPT（C））

2.5 甜菜堿、DMPT 和氯化膽堿對羅氏沼蝦胃蛋白酶活性的影響

在低、中、高3 種不同的誘食劑濃度中，羅氏沼蝦胃組織中胃蛋白酶的活性隨著甜菜堿濃度的增加而增加，隨著氯化膽堿濃度的增加表現(xiàn)為先增加后減少（圖6A 和B）。羅氏沼蝦胃組織中胃蛋白酶的活性在濃度分別為1%和1.5%的甜菜堿、0.1%的DMPT 與0.1%、1%和1.5%的氯化膽堿時與對照組的差異顯著（P＜0.05），因中濃度（1%）和高濃度（1.5%）的DMPT 均對羅氏沼蝦有致死效應(yīng)，故無法判別（圖6C）。

圖6 不同濃度誘食劑對羅氏沼蝦胃蛋白酶活性的影響（甜菜堿（A）、氯化膽堿（B）和DMPT（C））Fig.6 Effects of different concentrations of attractant on pepsin activity of M.rosenbergii（betaine（A）,choline chloride（B）,and DMPT（C））

3 討論

誘食作用在水產(chǎn)動物如凡納濱對蝦、異育銀鯽、奧尼羅非魚Oreochromis aureus×O.niloticus、鯽Carassius auratus 和鯉Cyprinus carpio 中均有發(fā)現(xiàn)[13,16-17]。本誘食實驗發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦的運動軌跡與停留時間在誘食劑區(qū)域均多于在對照劑區(qū)域（圖2 和圖3），說明甜菜堿、氯化膽堿和DMPT 這3 種誘食劑對羅氏沼蝦均有誘食作用，這些誘食劑溶于水產(chǎn)生的化學(xué)刺激均能引起羅氏沼蝦的感知并使其發(fā)生相應(yīng)的尋找、趨向行為。羅氏沼蝦的停留時間隨甜菜堿和DMPT 濃度的增加呈先上升后下降趨勢，隨氯化膽堿濃度的增加呈先上升后下降再上升趨勢，其中，在1%和1.5%的甜菜堿、0.5%和1%的氯化膽堿以及1%的DMPT 區(qū)域的停留時間顯著大于在對照劑區(qū)域的停留時間（圖3），說明誘食劑的濃度對羅氏沼蝦的誘食作用有影響，甜菜堿的濃度越高對羅氏沼蝦的誘食作用越強，而氯化膽堿和DMPT 則非如此，因此，在開發(fā)羅氏沼蝦專用誘食劑的濃度調(diào)配方面，甜菜堿比氯化膽堿和DMPT 更易把握。相關(guān)研究表明，水產(chǎn)動物在代謝過程中需要足夠的甲基，而動物本身不能合成甲基，必須由外界攝入供給[18]。飼料中添加甜菜堿能對凡納濱對蝦、長吻鮠Leiocassis longirostris、黃鱔Monopterus albus、異育銀鯽和斑點叉尾鮰Ietalurus punetaus 的生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率有幫助[17,19-22]，飼料中添加膽堿能顯著提高凡納濱對蝦、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis 幼蟹、異育銀鯽的飼料轉(zhuǎn)化率和增重率[14,23-24]，飼料中添加DMPT 能明顯提高凡納濱對蝦的增重率[25]。本實驗中甜菜堿、氯化膽堿和DMPT 這3 種誘食劑均對羅氏沼蝦腸道內(nèi)脂肪酶、肝胰腺內(nèi)淀粉酶和胃組織中胃蛋白酶的活性具有正向影響（圖4、5 和6），故甜菜堿、氯化膽堿和DMPT 這3 種誘食劑均可作為甲基供體，對水產(chǎn)動物甲基的攝入過程起到重要的補充作用。

在低、中、高3 種不同濃度中，羅氏沼蝦脂肪酶、淀粉酶和胃蛋白酶的活性均隨甜菜堿濃度的增加而增加，且在甜菜堿1%和1.5%的濃度時具有顯著性（圖4A、圖5A 和圖6A），表明甜菜堿對于羅氏沼蝦的消化與吸收也起著一定的促進作用，且這種作用在小范圍內(nèi)隨著甜菜堿濃度的增加而加強。在低、中、高3 種不同濃度中，羅氏沼蝦腸道內(nèi)脂肪酶、肝胰腺內(nèi)淀粉酶和胃組織中胃蛋白酶的活性均隨著氯化膽堿濃度的增加先增加后減少，且在0.5%的濃度時具有顯著性（圖4B、圖5B 和圖6B），表明氯化膽堿對于羅氏沼蝦的消化與吸收也起著一定的促進作用，且這種作用在小范圍內(nèi)隨著氯化膽堿濃度的增加而減弱。膽堿是維持魚類正常生長的重要維生素，能夠調(diào)節(jié)魚類的神經(jīng)發(fā)育、肝臟脂肪轉(zhuǎn)運以及機體合成代謝等過程，研究顯示，飼料中適量添加膽堿，能夠促進多種魚類生長，降低飼料系數(shù)，降低肝臟脂肪含量，增強免疫力、改善肉質(zhì)等。由于膽堿穩(wěn)定性較差，吸收率較低，目前在飼料中主要以氯化膽堿的形式添加[26]。膽堿和甜菜堿這2 種與代謝密切相關(guān)的物質(zhì)可以相互轉(zhuǎn)化：膽堿可以被氧化成為甜菜堿，從而提供代謝需要的甲基供體[21]。相關(guān)研究表明，甜菜堿不僅能刺激水產(chǎn)動物的嗅覺和味覺，提高對氨基酸的味覺反應(yīng)，還有利于魚蝦類水產(chǎn)動物的新陳代謝，促進其攝食率、提高其增重率、降低其死亡率[2,27]。綜合以上實驗結(jié)果，甜菜堿比氯化膽堿更適宜作為羅氏沼蝦的專用誘食劑。DMPT 能刺激水產(chǎn)動物的感覺系統(tǒng)，提高其攝食速度、采食量和消化酶的分泌，一定程度上也促進其生長和攝食抗逆性，同時改善其肉質(zhì)品質(zhì)，使淡水品種呈海產(chǎn)風(fēng)味[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度（0.1%）的DMPT 對羅氏沼蝦脂肪酶和胃蛋白酶的活性有顯著增強作用，中、高濃度的DMPT（1%和1.5%）對羅氏沼蝦有致死作用（圖4C、圖5C 和圖6C）。以往的實驗通常研究添加不同劑量DMPT 的飼料對實驗對象的誘食效果或蛋白酶活性的影響[16-17,25,29]，而本次實驗是研究不同劑量的DMPT 水溶液對羅氏沼蝦誘食效果或蛋白酶活性的影響，故其致死原因可能是DMPT 在水體中積累至一定濃度對羅氏沼蝦的呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生了不利影響，但具體原因還需進一步研究。