多鱗四指馬鲅和四指馬鲅種群遺傳特征的研究

張 帥，李 敏，閆 帥，朱江峰，徐姍楠，陳作志

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業(yè)農村部外海漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東廣州 510300；2.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；3.南方海洋科學與工程廣東省實驗室（廣州），廣東廣州 511548）

多鱗四指馬鲅Eleutheronema rhadinum 和四指馬鲅E.tetradactylum 均隸屬于馬鲅科Polynemidae 四指馬鲅屬Eleutheronema。2002 年，MOTOMURA,et al[1]根據(jù)胸鰭鰭膜顏色、有孔側線鱗數(shù)和側線上下鱗數(shù)等形態(tài)特征，將多鱗四指馬鲅從四指馬鲅中分離出來，定為另一個有效種。多鱗四指馬鲅是東亞特有種，主要分布于中國的東海和南海，越南北部和日本南部偶有發(fā)現(xiàn)；四指馬鲅的分布范圍廣，涵蓋印度洋的波斯灣到西太平洋的巴布亞新幾內亞和澳大利亞北部[1-3]。

多鱗四指馬鲅和四指馬鲅均為近海中上層魚類，生長速度快，一齡魚叉長即可達30 cm[1,4]。兩者均因其肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，是十分名貴的經濟魚類。與其他馬鲅科魚類似，均為雌雄同體雄性先熟[2]。多鱗四指馬鲅為與四指馬鲅的生態(tài)學特征也基本相似，喜棲息于底質為沙底的近岸淺灘和渾濁水域，很少進入較深的海洋中[2,4]。多鱗四指馬鲅主要依賴于野外捕撈，而四指馬鲅已實現(xiàn)人工化養(yǎng)殖。

目前，關于多鱗四指馬鲅的研究主要集中于分類學[1-2]、生物學[5-6]、魚類浮游生物[7-8]和種群遺傳結構[9-12]等。然而關于其種群遺傳結構尚無定論且均為單一分子標記，如楊陽等[10]基于AFLP 技術發(fā)現(xiàn)多鱗四指馬鲅不同地理群體存在一定的遺傳分化，而鄧春興[11]基于COI 的研究發(fā)現(xiàn)多鱗四指馬鲅為單一種群結構。因此，本文結合常用的線粒體分子標記COI 和進化速率最快的線粒體分子標記D-loop，以東海和南海的多鱗四指馬鲅以及南海的四指馬鲅作為研究對象，探究兩者的種群遺傳多樣性和遺傳結構，驗證COI 和Dloop 用于區(qū)分這2 種魚的可行性，以期為這2 種漁業(yè)資源的保護和利用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本從當?shù)貪O民或市場購買，冷凍寄回實驗室（廣州），-20 ℃保存。采集時間為2019 年秋季（9 月至12月），共采集多鱗四指馬鲅85 尾。采樣點包括東海的福州（FZ）和泉州（QZ），以及南海的珠海（ZH），同時在徐聞（XW）采集未知來源的野生四指馬鲅30 尾，具體采樣信息如圖1 和表1。

表1 多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的采樣信息及遺傳多樣性指數(shù)Tab.1 Sampling information and genetic diversity parameters of E.rhadinum and E.tetradactylum

圖1 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅采樣點Fig.1 Sampling sites of E.rhadinum and E.tetradactylum in south China

1.2 線粒體標記的獲取

剪取魚體背部肌肉組織15～30 mg，采用海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（天根）提取總DNA，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考四指馬鲅線粒體基因全序列（GenBank 登錄號：NC＿021620.1），設計并篩選出擴增2 種目標魚類線粒體COI 和D-loop 基因序列的引物。線粒體COI 序列的擴增引物為ERCO1385-F：5′-GTTATCGTTACCGCACAT-3′和ERCO1385-R：5′-GTCAGCATTCGGATTTGG-3′。PCR 反應體系總體積為25 μL，依照KOD FX 酶（Toyobo，廣州）的使用說明確定各組分的濃度。PCR 擴增反應程序：94 ℃，預變性2 min；98 ℃，變性10 s，48 ℃，退火30 s，68 ℃，延伸84 s，35 個循環(huán)；68 ℃，延伸7 min。線粒體D-loop 序列的擴增引物為ERCR942-F：5′-TGTAAACCGGTTGTCGGAGG-3′和ERCR942-R：5′-GACCAAGCCTTTGTGCTTGC-3′。PCR 反應體系同線粒體COI 序列的反應體系。PCR 擴增反應程序：94 ℃，預變性2 min；98 ℃，變性10 s，55 ℃，退火30 s，68 ℃，延伸56 s，35 個循環(huán)；68 ℃，延伸7 min。

PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送華大基因進行雙向測序，測序引物同擴增引物。

1.3 數(shù)據(jù)分析

獲得2 種線粒體標記序列后，采用軟件SeqMan 拼接正反序列，根據(jù)峰圖進行人工校正。采用軟件BioEdit 3.3[13]編排序列，并進行格式轉換。采用軟件MEGA 6.0[14]對序列進行多重排列比對，參數(shù)設置為程序默認值，手動去除序列首尾使得序列長度均一。為分析徐聞采集的四指馬鲅的來源，從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載馬來西亞海域四指馬鲅COI 序列進行分析，序列登記號為MG81629-MG81638。

采用軟件MEGA 6.0 基于最大似然法篩選出最適模型和Gamma（G）值，線粒體COI 標記篩選結果為Kimura 2-parameter 模型（K2），線粒體D-loop 標記篩選結果為Tamura 3-parameter（TN92，G=0.33）；分別采用最佳模型，基于鄰接法構建單倍型系統(tǒng)進化樹，可靠性經500 次重復抽樣檢驗；基于相應模型計算物種間的平均遺傳距離。采用軟件DnaSP 5.10[15]對不同地理群體進行分組，并采用軟件Arlequin 3.5[16]計算不同地理群體的遺傳多樣性指數(shù)，包括單倍型數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等。采用軟件PopART 1.7[17]構建單倍型中間網絡連接圖[18]，并手動調整單倍型相對位置。

采用軟件Arlequin 3.5 進行分子方差分析（AMOVA），檢測群體變異水平與不同組間的差異顯著性；遺傳結構協(xié)方差的顯著性通過10 000 次重復抽樣來檢驗，并計算兩兩群體間的遺傳分化系數(shù)（FST）；采用Exact test分析種群分化程度，通過抽樣來檢驗顯著性（10 000 次重復和100 000 馬爾科夫鏈步驟）；采用TAJIMA′s[19]的D 檢驗和FU′s[20]的Fs 檢驗來檢測種群進化是否遵循中性理論；采用核苷酸錯配分布分析判斷群體是否存在時空擴張。

通過T=t*代時公式來估算群體擴張時間，代時參照四指馬鲅[2]，取2 年，t 為擴張以來所經歷的代數(shù)。代數(shù)通過公式t=τ/2u 計算，其中τ 為擴張時間參數(shù)，由軟件Arlequin 計算獲得，u 為序列的突變速率（u=2 μk，μ 表示每個核苷酸位點的突變速率，k 表示目的片段長度），COI 和D-loop 核苷酸突變速率分別取每百萬年1%～3%[21]和5%～20%[22]。

2 結果

2.1 序列特征

多鱗四指馬鲅線粒體COI 和D-loop 序列擴增長度分別為1 289 bp 和795 bp，樣本量分別為73 尾和85 尾。四指馬鲅線粒體COI 和D-loop 序列擴增長度分別為1 289 bp 和890 bp，樣本量均為30 尾。在多鱗四指馬鲅中，COI 序列共檢測到多態(tài)性位點32 個，轉換位點30 個，顛換位點2 個，D-loop 序列共檢測到多態(tài)性位點176 個，轉換位點159 個，顛換位點18 個以及20 個缺失突變。在四指馬鲅中，COI 序列共檢測到多態(tài)性位點16 個，轉換位點14 個，顛換位點2 個，D-loop 序列共檢測到多態(tài)性位點76 個，轉換位點61個，顛換位點3 個以及14 個缺失突變。

所得序列的平均堿基組成均呈反G 偏移，如多鱗四指馬鲅COI 和D-loop 序列的堿基G 含量分別為20.7%和14.8%，四指馬鲅COI 和D-loop 序列的堿基G 含量分別為20.0%和13.8%，該現(xiàn)象符合大多數(shù)脊椎動物線粒體DNA 的特征。

2.2 遺傳多樣性

由表1 可知，所有多鱗四指馬鲅COI 和D-loop 序列的單倍型數(shù)分別為28 個和73 個，個體特異單倍型數(shù)分別為20 個（占比71.4%）和65 個（占比89%）。四指馬鲅COI 和D-loop 序列的單倍型數(shù)分別為15 個和29 個，個體特異單倍型數(shù)分別為11 個（占比73.3%）和29 個（占比96.7%）。

由表1 可知，多鱗四指馬鲅2 個線粒體標記均呈現(xiàn)高的單倍型多樣性（COI：0.894;D-loop：0.994）和較低的核苷酸多樣性（COI：0.002;D-loop：0.041）。四指馬鲅2 個線粒體標記也均呈現(xiàn)高的單倍型多樣性（COI：0.901;D-loop：0.998）和較低的核苷酸多樣性（COI：0.002;D-loop：0.012）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關系和種群遺傳結構

由多鱗四指馬鲅COI 序列的單倍型網絡連接圖（圖2-A）和系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可知，多鱗四指馬鲅不同地理群體的單倍型交錯在一起，呈星狀發(fā)射結構，沒有明顯的譜系分化。基于D-loop 序列與COI 序列的研究結果基本一致（圖2-B 和圖3）。但D-loop 序列結果可能由于單倍型多樣性高，分布較為分散，星狀發(fā)射結構不明顯。以上結果說明中國東海和南海的多鱗四指馬鲅為單一種群遺傳結構。

圖2 基于多鱗四指馬鲅線粒體COI 和D-loop 序列的單倍型中間網絡連接圖Fig.2 Haplotype median-joining network for E.rhadinum based on mtDNA COI（A）and D-loop（B）gene sequences

通過種間遺傳距離可知，多鱗四指馬鲅和徐聞未知來源四指馬鲅具有較大的遺傳差異（COI,0.071;Dloop,0.501），其中D-loop 序列的遺傳差異明顯高于COI 序列。結合多鱗四指馬鲅和徐聞未知來源四指馬鲅的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可知，多鱗四指馬鲅與四指馬鲅可明顯分為2 支，且遺傳分化顯著（表2），說明本研究設計的2 種線粒體標記可用于區(qū)分這兩個近緣物種。

同時，結合馬來西亞四指馬鲅樣本COI 序列的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可以發(fā)現(xiàn)，徐聞未知來源的四指馬鲅樣本與馬來西亞樣本完全聚合在一支，說明該未知來源樣本與馬來西亞群體的親緣關系近。

圖3 基于鄰接法構建的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅線粒體D-loop（上）和COI（下）序列的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbour-joining tree for mtDNA COI and D-loop haplotypes of E.rhadinum and E.tetradactylum

由表2 可知，多鱗四指馬鲅COI 標記的3 個地理群體間均無顯著遺傳分化（P＞0.05），兩兩群體的遺傳分化系數(shù)在-0.027 51～-0.008 97 之間；D-loop 標記的3 個地理群體間也均無顯著遺傳差異（P＞0.05），兩兩群體的遺傳分化系數(shù)在-0.030 14～-0.017 06 之間。以上結果表明中國沿海的多鱗四指馬鲅為單一種群遺傳結構。

表2 多鱗四指馬鲅兩兩地理群體間及與四指馬鲅的遺傳分化系數(shù)（FST）Tab.2 Pairwise genetic distance（FST）among geographical populations of E.rhadinum and compared with E.tetradactylum

中國南海和東海多鱗四指馬鲅分子方差分析結果顯示（表3），該物種的遺傳變異（COI，102.83%；D-loop，103.1%）均來自種群內，且組間、組內和種群內遺傳分化均不顯著（P＞0.05）。表明中國南海和東海的群體為隨機交配群體。

表3 多鱗四指馬鲅不同地理群體遺傳變異的分子方差分析Tab.3 Analysis of molecular variance of geographical populations of E.rhadinum based on mtDNA COI and D-loop gene sequences

2.4 群體歷史動態(tài)

多鱗四指馬鲅COI 序列和D-loop 序列的核苷酸錯配分布和中性檢驗結果如表4 所示，可知中國沿海群體的核苷酸錯配分布符合快速擴張模型和空間擴散模型的假設（P＞0.05）。由中性檢驗結果可知，TAJIMA’s D值均為負值，僅福州具有顯著性（COI，P＜0.05），F(xiàn)U’s Fs 值均為負值，且都具有顯著性（P＜0.05）。

表4 多鱗四指馬鲅核苷酸錯配分布的參數(shù)估計值和中性檢驗的統(tǒng)計值Tab.4 Mismatch distribution parameter estimates and neutrality tests statistics for E.rhadinum based on mtDNA COI and D-loop gene sequences

由2 種序列的核苷酸錯配分布圖（圖4）可知，COI 序列的錯配分布圖在單個群體中以及所有群體中均為單峰型，但D-loop 序列的錯配分布圖均具一明顯的較高單峰，同時有2～3 個小峰。

圖4 基于線粒體COI（A～D）和D-loop（E～H）序列的多鱗四指馬鲅核苷酸錯配分布圖Fig.4 The observed pairwise differences and the expected mismatch distributions under the sudden expansion model and the spatial expansion model for the mtDNA COI（A-D）and D-loop（E-H）haplotypes

通過軟件Arlequin 計算獲得多鱗四指馬鲅COI 序列和D-loop 序列的擴張時間參數(shù)（τ）分別為1.852 和49.066，估算得出中國沿海多鱗四指馬鲅的群體擴張時間分別為（2.4～7.2）萬年前和（15.4～61.7）萬年前。

3 討論

3.1 群體擴張時間

通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，COI 和D-loop 標記都可以區(qū)分多鱗四指馬鲅和四指馬鲅這2 個形態(tài)近似魚種。研究發(fā)現(xiàn)多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的分化時間在4.778 百萬年前[23-24]至54.3 百萬年前[25]，分歧時間較為久遠。而本研究選取的2 種線粒體標記突變速率高，遺傳變異較大，適用于對這2 種魚進行分子區(qū)分。已開發(fā)用于鑒定這2 個物種的標記包括Cytb[12]、16S rRNA[12]、形態(tài)特征標記[26]、SNP 標記[26]和SCAR 標記[27]等。對未知來源四指馬鲅的鑒定和溯源也驗證了這2 種標記的有效性。因此，本研究拓展了鑒定多鱗四指馬鲅與四指馬鲅的分子標記位點，可應用于未知來源樣本的鑒定和溯源。

3.2 多鱗四指馬鲅的遺傳多樣性和歷史動態(tài)

遺傳多樣性是魚類適應環(huán)境和生存能力的重要基礎。多鱗四指馬鲅是我國近海的重要經濟魚類，關于其漁業(yè)資源狀況尚無文獻報道。對比以往對東海四指馬鲅的研究發(fā)現(xiàn)，本研究樣本的單倍型多樣性更高（0.89 vs.0.50～0.78）[28]，可能是由于本研究涵蓋了南海的樣本以及擴增的COI 序列長度更長（1 289 bp vs.627 bp）。多鱗四指馬鲅與其近緣物種的單倍型多樣性較為接近，如本研究采集的四指馬鲅為0.90，澳大利亞報道的四指馬鲅為0.87[29]。多鱗四指馬鲅的核苷酸多樣性也與本研究的四指馬鲅（0.02 vs.0.02）一致，但高于澳大利亞的四指馬鲅（0.007 2）。因此，本研究結果顯示多鱗四指馬鲅具有較高的遺傳多樣性。

多鱗四指馬鲅的遺傳多樣性指數(shù)呈現(xiàn)高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性特征，這是種群曾經歷快速擴張的典型特征[30]，普遍存在于中國近海魚類，如黑鯛Acanthopagrus schlegelii[31]、短尾大眼鯛Priacanthus macracanthus[32-33]和日本鯖Scomber japonicus[34]等。中性檢驗的FU's Fs 檢驗結果（P＜0.05）和COI 的核苷酸錯配分布圖（單峰模式）也支持這一結論。這可能是由于更新世冰期和間冰期的交替出現(xiàn)，冰期導致棲息地減少，海洋魚類區(qū)域性滅絕，而間冰期棲息地增加，海洋魚類又重新擴張。在快速擴張時期，單倍型多樣性快速增加，但是核苷酸多樣性由突變速率決定，短時間內難以積累足夠的核苷酸多樣性。然而，TAJIMA's D（P＞0.05）以及D-loop 的錯配分布圖（多峰模式）并不支持種群快速擴張模型，這可能需要進一步的研究。綜上，多鱗四指馬鲅群體可能偏離中性理論下的Wright-Fisher 模型，群體歷史在時空尺度上可能經歷過快速擴張。

基于不同標記的多鱗四指馬鲅群體擴張時間之間有較大差異，COI 標記估算的擴張時間為（2.4～7.2）萬年前，而D-loop 標記的估算結果則為（15.4～61.7）萬年前。鄧春興等[11]基于COI 標記估算的多鱗四指馬鲅群體擴張時間為6.1 萬年前，與本研究相同標記的結果基本吻合。對其他魚類的研究也存在這一現(xiàn)象，如對短尾大眼鯛Cytb 和D-loop 標記估算的群體擴張時間分別為11 萬年前[33]和（1.7～5.6）萬年前[32]，對棘頭梅童魚COI 和D-loop 標記估算的群體擴張時間分別為7 萬年前[35]和3.8～12.9 萬年前[36]。同時，由于中國沿海魚類受到更新世冰期和間冰期的影響，同域分布的不同種魚類群體擴張時間存在較大差異，如褐菖鲉Sebastiscus marmoratus 群體擴張時間為（26.8～44.8）萬年前[37]、中國鯧Pampus chinensis 群體擴張時間為（11.7～16.9）萬年前[38]以及花斑蛇鯔Saurida undosquamis 群體擴張時間為（4～10）萬年前[39]等。但是對于多鱗四指馬鲅不同分子標記對群體擴張時間估算的影響以及不同物種間擴張時間的差異，可能是由于物種分布范圍很小（僅分布于中國的東海和南海）或者可能是種群擴張的時間過短造成的。

3.3 多鱗四指馬鲅的種群遺傳結構

由于多鱗四指馬鲅游泳能力強且具有遷移洄游習性，東海和南海之間也缺乏明顯的地理屏障，即使在更新世冰期，南海也能通過巴士海峽與太平洋相連[40-41]。多鱗四指馬鲅的單倍型中間網絡連接圖、系統(tǒng)發(fā)育樹以及分子方差分析結果顯示，東海和南海群體基因交流頻繁，為單一種群結構。雖然基于AFLP 標記和魚體形態(tài)特征的研究發(fā)現(xiàn)，中國沿海的多鱗四指馬鲅已產生一定程度的分化[9-10]，但是分化程度并不顯著。因此，中國沿海的多鱗四指馬鲅可作為單一種群進行管理和開發(fā)。

4 總結

中國沿海的多鱗四指馬鲅具有較高的遺傳多樣性，為單一種群結構，且可能經歷過種群的快速擴張。本研究采樣時間和采樣批次過于集中，樣本數(shù)量也偏少，采樣群體可能無法代表整個種群狀況。這是由于多鱗四指馬鲅的捕撈量較為稀少，價格昂貴，且漁汛期十分集中，因此樣本十分珍貴。同時，鑒于不同分子標記的研究結果之間存在較大的差異，如遺傳多樣性和群體擴張時間，可能需要采用分辨率更高的分子標記（如單核苷酸多態(tài)性）以及擴大采樣的時空跨度，以期更加準確地闡明該物種的種群遺傳結構，為該漁業(yè)資源管理的開發(fā)和利用提供更加科學的基礎資料。