周8425B衍生品種耐旱相關(guān)性狀的遺傳解析

于海飛，王麗娜，殷貴鴻，鄒少奎，李楠楠，張 倩，呂永軍，王雅美，韓玉林

(1.周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南周口 466000；2.中山大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州 510275)

水資源短缺已成為威脅中國(guó)糧食生產(chǎn)安全的重要因素之一[1]。全球擁有近15億hm2耕地，近60%的糧食產(chǎn)量需要在灌溉條件較差的旱地產(chǎn)出[2]。近年來，隨著全球氣候變化加劇，干旱程度愈發(fā)嚴(yán)重，干旱周期加速，對(duì)全球糧食生產(chǎn)的威脅增大。小麥?zhǔn)侵袊?guó)重要的糧食作物之一，是中國(guó)北方人民的主食作物，受干旱脅迫影響極大。小麥全生育期需水量較大且生長(zhǎng)季節(jié)降水量較少。近年來，由于氣候劇烈變化，中國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)地下水位大幅下降，嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)安全[3]。發(fā)掘耐旱相關(guān)基因，培育耐旱品種，是保證小麥生產(chǎn)安全最為經(jīng)濟(jì)、高效的途徑。

耐旱相關(guān)性狀是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，易受外界環(huán)境條件影響，遺傳機(jī)制復(fù)雜?；诨蛐秃捅硇偷倪B鎖分析和關(guān)聯(lián)分析是挖掘數(shù)量性狀基因位點(diǎn)的兩種主要方式[4-6]。傳統(tǒng)的連鎖分析一般以雙親遺傳群體為材料，結(jié)果較為可靠，但需大量的人力和物力資源，且所有遺傳變異來源于雙親，無法反映出自然界廣泛存在的遺傳變異。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association analysis，GWAS)則可有效彌補(bǔ)連鎖分析的缺陷，其基于自然群體，可反映自然界廣泛存在的遺傳變異，且無需構(gòu)建群體，有效降低人力和物力消耗，縮短研究時(shí)間。然而，GWAS一般需要密度較高且覆蓋度較廣的基因型數(shù)據(jù)。近年來，SNP芯片技術(shù)漸漸成為分子標(biāo)記檢測(cè)的主流技術(shù)，并在水稻(44K)、玉米(50K和55K)及小麥(9K、90K、660K、15K和50K)等重要作物中廣泛應(yīng)用[7-9]?；赟NP的GWAS已廣泛應(yīng)用于小麥加工品質(zhì)[10]、生理性狀[11]、抗病抗逆性[2,5-7]以及產(chǎn)量[5-6]等相關(guān)性狀基因的發(fā)掘研究。

黃淮麥區(qū)是中國(guó)重要的小麥產(chǎn)區(qū)，可提供全國(guó)近70%的小麥產(chǎn)量[12]。近年來，由于在育種工作中過于追求高產(chǎn)，黃淮麥區(qū)小麥品種多在高水肥條件下選育而成，生產(chǎn)上缺乏在干旱條件下耐旱性好、減產(chǎn)少且在水分充足條件下高產(chǎn)、不倒伏的水旱兼用型品種[3]。周8425B是黃淮麥區(qū)重要的骨干親本，具有優(yōu)異的農(nóng)藝性狀和較強(qiáng)的耐旱能力[13]，目前利用周8425B已育成100多個(gè)衍生品種(系)，且其后代具有較好的耐旱性。分析周8425B及其衍生品種的耐旱性，發(fā)掘其耐旱位點(diǎn)，開發(fā)相關(guān)的分子標(biāo)記，可為黃淮麥區(qū)水旱兼用型品種分子輔助育種提供指導(dǎo)。本研究將周8425B及其68個(gè)衍生系品種連續(xù)2年2點(diǎn)種植，利用小麥50K SNP芯片對(duì)耐旱相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS分析，以期發(fā)掘耐旱相關(guān)性狀的基因位點(diǎn)，為耐旱品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為周8425B及其68份衍生品種，詳細(xì)信息見表1。

表1 供試品種名稱及其系譜信息

1.2 田間試驗(yàn)和表型調(diào)查

周8425B及其衍生群體分別于2015-2016和2016-2017年度種植于周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地和鄭州滎陽試驗(yàn)基地。周口試驗(yàn)基地地下水埋深7 m以上，2015-2016和2016-2017年度份小麥生長(zhǎng)季有效降雨量分別為238.7和256.4 mm；鄭州試驗(yàn)基地下水埋深7 m以上，2015-2016和2016-2017年度小麥生長(zhǎng)季有效降雨量為204.6和216.3 mm。為開展耐旱表型測(cè)定，試驗(yàn)開展期間全生育期不人工灌水。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。單個(gè)小區(qū)面積6 m2，行距20 cm，小區(qū)間距40 cm。肥料施用及病蟲害防治等田間管理措施同大田生產(chǎn)。

性狀調(diào)查主要包括苗期胚芽鞘長(zhǎng)度、旗葉葉綠素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量和耐旱指數(shù)[14-15]。調(diào)查方式如下：(1)苗期胚芽鞘長(zhǎng)度：播種后第3 d開始，連續(xù)6 d于小區(qū)內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)均勻區(qū)域測(cè)定30株幼苗的胚芽鞘長(zhǎng)，取平均值作為該品種的胚芽鞘長(zhǎng)度；(2)旗葉葉綠素含量：于花后7 和14 d，用手持式SPAD儀在每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取10片旗葉測(cè)定旗葉葉綠素含量，取平均值作為該品種的葉綠素含量；(3)旗葉脯氨酸和可溶性含量：于花后7和14 d，于小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取3片旗葉，利用液氮冷凍磨碎后稱取0.5 g放入試管中，利用酸性茚三酮法測(cè)定葉片內(nèi)脯氨酸含量，利用蒽酮比色法測(cè)定葉片可溶性糖含量。(4)耐旱指數(shù)：耐旱指數(shù)=(旱地產(chǎn)量/正常灌溉產(chǎn)量)×(旱地產(chǎn)量/對(duì)照品種旱地產(chǎn)量的平均值)。

1.3 表型統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2019進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)量分析；利用SAS V9.4進(jìn)行性狀間表型相關(guān)分析、方差分析(Analysis of variance，ANOVA)和最佳線性無偏估計(jì)值(Best linear unbiased prediction，BLUP)值的計(jì)算。

1.4 SNP基因分型和群體結(jié)構(gòu)分析

每個(gè)樣品選取5個(gè)材料的幼嫩葉片，混合取樣，采用CTAB法提取植株基因組DNA。由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司進(jìn)行50K SNP芯片檢測(cè)，用GenomeStudio polyploid clustering v1.0軟件進(jìn)行基因型分型。SNP質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)>5%且缺失率<20%[16]。經(jīng)過濾后，共計(jì)36 686個(gè)SNP標(biāo)記用于構(gòu)建物理圖譜(未發(fā)表)。21條染色體平均標(biāo)記密度為0.38 Mb，A、B和D染色體組平均標(biāo)記密度分別為0.43、0.38和0.34 Mb。

選取2 000個(gè)在染色體上均勻分布的過濾后的SNP標(biāo)記。用Admixture 1.3.0(http://dalexander.github.io/admixture/download.html)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析；用Tassel v5.0構(gòu)建Neighbor-Jointing進(jìn)化樹和進(jìn)行主成分分析；用Tassel v5.0軟件中的Kinship模塊，采用Scaled_IBS方法計(jì)算親緣關(guān)系矩陣；用Tassel v5.0中的全矩陣(full matrix)和滑動(dòng)窗口(sliding window)進(jìn)行LD衰減分析，以第95百分位的r2值與LD衰減曲線的交叉點(diǎn)作為L(zhǎng)D衰減距離。基于全基因組LD衰減距離，以8 Mb間隔來區(qū)別不同位點(diǎn)。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

用Tassel v5.0軟件的混合線性模型(MLM，PCA+K)對(duì)耐旱相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS。以P≤0.001作為該標(biāo)記與性狀顯著關(guān)聯(lián)閾值，R2表示解釋表型效應(yīng)百分率。GWAS分析的QQ圖(quantile-quantile plot)和曼哈頓圖(manhattan plot)由R語言CMplot程序包(https://cran.r-project.org/web/packages/CMplot/)繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐旱相關(guān)性狀的表型

從表2可以看出，不同品種的胚芽鞘長(zhǎng)度、耐旱指數(shù)以及旗葉可溶性糖、脯氨酸和葉綠素含量(花后7和14 d)均不同，且各性狀變化范圍較大。方差分析結(jié)果(表3)表明，基因型、環(huán)境及基因型與環(huán)境互作對(duì)周8425B衍生品種的胚芽鞘長(zhǎng)度以及旗葉可溶性糖和脯氨酸含量(花后7 d和14 d)影響顯著，其中環(huán)境對(duì)胚芽鞘長(zhǎng)度的影響最大。

表2 耐旱相關(guān)性狀的最佳線性無偏估計(jì)值

表3 耐旱相關(guān)性狀的方差分析(F值)

2.2 耐旱相關(guān)性狀GWAS分析

利用Tassel v5.0的MLM模型對(duì)耐旱相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS分析，結(jié)果表明，共檢測(cè)到252個(gè)顯著性SNP標(biāo)記，分布于37個(gè)位點(diǎn)上(表4和圖1)。其中，檢測(cè)到29個(gè)與胚芽鞘長(zhǎng)度顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分布在3B、4B、5A、5D(2)和7D染色體上的6個(gè)位點(diǎn)內(nèi)，可解釋8.8%～14.1%的表型變異。檢測(cè)到7個(gè)與花后7d旗葉脯氨酸含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分布在1A、1B、5A和6D染色體的4個(gè)位點(diǎn)上，可解釋9.4%～15.8%的表型變異。檢測(cè)到5個(gè)與花后14 d脯氨酸含量旗葉顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分布在2A、6D和7A染色體的3個(gè)位點(diǎn)上，可解釋8.7%～10.8%的表型變異。另外，檢測(cè)到32個(gè)與花后7 d旗葉葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分布在2B、5A和7D染色體的3個(gè)位點(diǎn)上，可解釋11.7%～13.1%的表型變異。檢測(cè)到30個(gè)與花后14 d旗葉葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分布在3A、6A(2)、6D和7B染色體的5個(gè)位點(diǎn)上，可解釋10.5%～13.1%的表型變異。檢測(cè)到124個(gè)與花后7 d旗葉可溶性糖含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分布在1A、2D、3B、3D、4B、7A和7D(2)染色體的8個(gè)位點(diǎn)上，可解釋11.2%～18.8%的表型變異。檢測(cè)到20個(gè)與花后14 d旗葉可溶性糖含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分布在3A(2)、3D和7D染色體的4個(gè)位點(diǎn)上，可解釋11.8%～13.8%的表型變異。檢測(cè)到5個(gè)與耐旱指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，分布在2D、3A和4A染色體的3個(gè)位點(diǎn)上，可解釋10.3%～12.5%的表型變異。

表4 耐旱相關(guān)性狀顯著相關(guān)的位點(diǎn)

圖1 耐旱相關(guān)性狀GWAS分析的曼哈頓圖

3 討 論

胚芽鞘的長(zhǎng)度對(duì)幼苗耐旱性至關(guān)重要。Rebetzke等[17]研究報(bào)道，Rht1可調(diào)節(jié)胚芽鞘長(zhǎng)度，可解釋27%～45%的表型變異，并在4BL染色體上定位到1個(gè)主效QTL，可解釋15%～27%的表型變異，與本研究在4B染色體上檢測(cè)到的AX_109316633距離較近，可能為相同位點(diǎn)。Zhang等[18]分別在3B和5D染色體上檢測(cè)到與胚芽鞘長(zhǎng)度相關(guān)的位點(diǎn)，基于物理圖譜和多標(biāo)記公共圖譜比較，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位點(diǎn)與本研究在3B(AX_94421831)和5D(AX_110637256)染色體上檢測(cè)的位點(diǎn)位置接近，可能是同一個(gè)位點(diǎn)。Li等[19]在1BS、2DS、4BS和5BL上檢測(cè)到4個(gè)與胚芽鞘長(zhǎng)度相關(guān)的位點(diǎn)，但這些位點(diǎn)均與本研究檢測(cè)到的位點(diǎn)位置不同。推測(cè)本研究在5A(AX_95659260)、5D(AX_109714016)和7D(AX_109147840)染色體上檢測(cè)到的3個(gè)位點(diǎn)可能是新的胚芽鞘長(zhǎng)度相關(guān)位點(diǎn)。

植株可溶性糖含量是耐旱性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。Galiba等[20]利用中國(guó)春染色體代換系在5A染色體上發(fā)掘到一個(gè)控制可溶性糖含量的位點(diǎn)，與本研究檢測(cè)到的位點(diǎn)位置均不同。Rebetzke等[21]利用3個(gè)RIL群體對(duì)莖稈可溶性糖含量進(jìn)行QTL定位，在1A、1B、2B、2D、4B、7A和7B染色體上檢測(cè)到多個(gè)QTL，基于物理圖譜和多標(biāo)記公共圖譜比較，發(fā)現(xiàn)與本研究在1A(AX_111561001)、2D(AX_110089653)和7A(AX_110576624)染色體上檢測(cè)到的位點(diǎn)位置接近或一致。Salem等[22]利用含有114個(gè)株系的RIL群體對(duì)可溶性糖含量(花后14 d)進(jìn)行QTL定位，在2D、5D和7D染色體上定位到3個(gè)QTL，可解釋表型變異的21.0%～42.2%，其中7D染色體上的位點(diǎn)與本研究檢測(cè)到的AX_111496932位點(diǎn)位置接近。Yang等[23]利用一個(gè)含有150個(gè)株系的DH群體對(duì)莖稈可溶性糖含量進(jìn)行QTL定位，發(fā)現(xiàn)位于3A和3B染色體上的位點(diǎn)與本研究在3A(AX_110454039)和3B(AX_109294391)染色體上檢測(cè)到的位點(diǎn)位置接近。Zhang等[18]利用262個(gè)品種和209個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)小麥植株、葉片和莖稈可溶性糖含量及用于呼吸和運(yùn)轉(zhuǎn)的可溶性糖含量進(jìn)行GWAS，分別檢測(cè)到13、13、23和14個(gè)顯著位點(diǎn)，與本研究檢測(cè)到的位點(diǎn)位置均不同。Dong等[10]利用豆麥/石4185群體將莖稈可溶性糖含量基因TaSST-D1定位在7DS染色體上，可解釋8.8%～11.3%的表型變異，與本研究在7D染色體上檢測(cè)到的AX_110575353位點(diǎn)位置接近。此外，Dong等[10]還利用166份黃淮麥區(qū)小麥品種進(jìn)行90 K SNP檢測(cè)并開展莖稈可溶性糖含量關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)到52個(gè)顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記，位于23個(gè)位點(diǎn)上。其中，11個(gè)標(biāo)記在2個(gè)或以上環(huán)境中被檢測(cè)到，這些位點(diǎn)與本研究所檢測(cè)到的位點(diǎn)位置均不同。綜上，3D(AX_110123800)、4B(AX_108778380)、7D(AX_94958668)、3A(AX_111470358)和3D(AX_111922285)這5個(gè)位點(diǎn)均可能為新的可溶性糖含量相關(guān)位點(diǎn)。

迄今為止，脯氨酸含量依然是較為復(fù)雜的表型性狀，遺傳機(jī)制尚不明晰，對(duì)旗葉脯氨酸含量進(jìn)行QTL定位的報(bào)道較少。楊 凱等[24]利用中國(guó)春-Hope代換系和中國(guó)春-長(zhǎng)穗偃麥草代換系，認(rèn)為在4B、5A和5D染色體上可能有控制干旱脅迫下脯氨酸累積的基因存在，在6B和6D染色體上可能有抑制脯氨酸積累的基因存在。此外，Sayed等[25]利用大麥BC2DH群體進(jìn)行干旱脅迫處理，對(duì)脯氨酸含量進(jìn)行QTL定位，在3H、4H、5H和6H染色體上定位到4個(gè)QTL，可解釋4.0%～6.1%的表型變異。本研究檢測(cè)到的脯氨酸含量位點(diǎn)，除5A染色體上的AX_94530985位點(diǎn)與楊 凱等[24]等檢測(cè)到的位點(diǎn)位置接近外，其他位點(diǎn)均可能為新的位點(diǎn)。

葉綠素是葉片進(jìn)行光合作用最重要的色素，可直接反映品種在不同時(shí)期和干旱脅迫下的耐旱能力。對(duì)旗葉葉綠素含量進(jìn)行基因定位已有大量報(bào)道。Zhang等[26]利用小麥DH群體，共檢測(cè)到17個(gè)與旗葉葉綠素含量相關(guān)的QTL，其中10個(gè)位點(diǎn)在2個(gè)或以上環(huán)境中被檢測(cè)到，位于3A和7B染色體的位點(diǎn)分別與本研究檢測(cè)到的3A(AX_110483079)和7B(AX_109461447)位點(diǎn)位置接近。Sukumaran等[27]在兩種灌溉條件下進(jìn)行產(chǎn)量和生理性狀的關(guān)聯(lián)分析，在3B(Kukri_c48750_1372)和6A(wsnp_Ex_c11348_18326787)染色體上檢測(cè)到2個(gè)與灌漿期旗葉葉綠素含量顯著相關(guān)的位點(diǎn)，其中6A染色體上的位點(diǎn)與本研究在6A染色體上檢測(cè)到的AX_109981766位點(diǎn)位置接近。Gao等[28]利用90K SNP芯片對(duì)含有246個(gè)株系的RIL群體的產(chǎn)量及生理性狀進(jìn)行QTL定位，檢測(cè)到10個(gè)與開花期旗葉葉綠素含量相關(guān)的QTL，檢測(cè)到8個(gè)與花后10 d旗葉葉綠素含量相關(guān)的QTL，其中5AL染色體上的位點(diǎn)與本研究檢測(cè)到的AX_109860622位點(diǎn)位置接近，可能為同一位點(diǎn)。Shi等[29]、Xu等[30]和Bhusal等[31]分別檢測(cè)到28、2和17個(gè)與旗葉葉綠素含量相關(guān)的位點(diǎn)，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些位點(diǎn)與本研究檢測(cè)到的位點(diǎn)位置均不同。綜上，2B(AX_110906386)、7D(AX_109240909)、6A(AX_108754874)和6D(AX_110827708)這4個(gè)位點(diǎn)可能為新的葉綠色含量相關(guān)位點(diǎn)。

前人對(duì)耐旱指數(shù)遺傳機(jī)制也有研究。Kirigwi等[32]在不同灌溉條件下對(duì)耐旱指數(shù)進(jìn)行QTL定位，檢測(cè)到3個(gè)耐旱指數(shù)QTL，與本研究在4A染色體上檢測(cè)到的AX_110441266位點(diǎn)位置接近。Kadam等[33]在4BS染色體上定位到一個(gè)主效耐旱指數(shù)QTL。Shukla等[34]利用包含206個(gè)株系的RIL群體并結(jié)合173個(gè)SSR標(biāo)記，在3B(2)和4A染色體上檢測(cè)到3個(gè)耐旱指數(shù)QTL，可解釋12.7%～15.6%的表型變異。其中，4A染色體上的主效QTL在絕大多數(shù)環(huán)境下均可被檢測(cè)到，以上檢測(cè)位點(diǎn)與本研究所檢測(cè)到的耐旱指數(shù)相關(guān)位點(diǎn)位置均不同，推測(cè)本研究在2D和3A染色體上檢測(cè)到的3個(gè)位點(diǎn)均可能為新的耐旱指數(shù)相關(guān)位點(diǎn)。

小麥耐旱遺傳機(jī)制十分復(fù)雜。研究品種間耐旱特性差異，篩選耐旱品種，對(duì)培育新的優(yōu)良品種具有重要價(jià)值。本研究在68份周8425B衍生系品種中檢測(cè)到37個(gè)與耐旱顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。其中，16個(gè)位點(diǎn)與前人發(fā)現(xiàn)的耐旱相關(guān)位點(diǎn)位置部分重疊或一致，這些位點(diǎn)更為可靠，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為KASP或STARP標(biāo)記，用于分子輔助育種和QTL精細(xì)定位。21個(gè)新的遺傳位點(diǎn)可進(jìn)一步驗(yàn)證其可靠性，并開展后續(xù)遺傳研究。在周8425B衍生品種中，周麥16、矮抗58、鄭農(nóng)21、淮麥28、周麥21、鄭麥379、瀏虎98和偃展4110共8份品種具有較好的耐旱性，且含有較多優(yōu)異等位基因，可作為親本用以提升育種材料的耐旱性?；谝陨辖Y(jié)果，下一步研究工作將主要集中于關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的驗(yàn)證以及可用SNP標(biāo)記的開發(fā)，為提升小麥品種耐旱性提供參考。