基于UPLC同時測定三種小麥赤霉病毒素方法的構建與應用

陳 璨，彭 逸，余寧靜，盧 杰，司紅起，馬傳喜

(安徽農業(yè)大學農學院/農業(yè)部黃淮南部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，安徽合肥 230036)

小麥是全世界廣泛種植的糧食作物，我國以小麥為主食的人口約40%，小麥及其制品的質量安全對國民經濟和人民生活保障具有重要意義。小麥赤霉病是由禾谷鐮孢()、串珠鐮孢()和黃色鐮孢()等多種鐮刀菌引起的真菌性病害；近五年來，我國年均發(fā)病面積超7 800萬畝，占小麥種植總面積的1/5；在長江中下游、江淮流域、黃淮南部等地經常流行為害，并逐步北移。小麥揚花期如遇連陰雨極易爆發(fā)赤霉病，通常導致小麥減產10%～20%，嚴重發(fā)生時小麥減產80%～90%甚至絕收。籽粒受致病菌侵染會累積鐮刀菌毒素(mycotoxins)，影響其商品性。因其危害的嚴重性和防控的艱巨性，2020年被國家農業(yè)農村部列入《一類農作物病蟲害名錄》。

與其他麥類病害相比，小麥赤霉病毒素在籽粒中的積累嚴重威脅食品安全和人畜健康，當毒素累積量達到一定程度時，其商品性喪失。真菌毒素可以在糧食的生產、加工、儲存等環(huán)節(jié)產生，將真菌殺死可以阻止毒素的產生，但不能消除已經存在的毒素，其進入食物鏈，富集到一定量就會威脅人畜健康。據世界糧農組織(FAO)估算，全球每年約有1/4的農產品受到真菌毒素的污染，我國小麥及其制品中的毒素污染問題十分嚴峻。小麥赤霉病產生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol, NIV)、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)三種鐮孢菌毒素廣泛污染小麥及相關制品。DON毒素又稱嘔吐毒素，是小麥中污染率最高的一種倍半萜烯類化合物，人食用后產生厭食、嘔吐、腹瀉、免疫力低下和反應遲鈍等急性中毒癥狀，可引發(fā)食道癌、IgA腎病等。我國《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》(GB2761-2017)標準中規(guī)定了小麥谷物及其制品DON的允許限量≤1 000 μg·kg。NIV毒素是B型單端孢霉烯族化合物類真菌毒素，其毒性是DON的十倍，急性毒性強，人類臨床癥狀主要表現(xiàn)為神經狀況異常、吞咽困難、嘔吐等；其慢性毒性導致動物生長障礙。我國尚未出臺食品中NIV的限量標準，F(xiàn)AO提出的NIV每日限量小于0.70 μg·kg。ZEN毒素是2，4-二羥基苯甲酸內酯類化合物，對人畜造成急慢性毒性、生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、細胞毒性等多種毒害作用。我國食品真菌毒素限量標準(GB 13078.2-2006)中規(guī)定，谷物及其制品ZEN毒素限量為60 μg·kg，飼料中ZEN允許量低于500 μg·kg。

糧食中真菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫(ELISEA)、氣相色譜及氣質聯(lián)用法(GC/GC-MS)、液相色譜-質譜法(LC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)等。ELISEA和HPLC法均便于操作、經濟高效，但是無法同時測定多種毒素。小麥中鐮刀菌毒素往往多種同時存在，由于DON和NIV均屬于單端孢霉烯族類，常常被同時測定，吳振興等采用免疫親和柱-HPLC同時檢測DON和NIV，兩種毒素檢出限(LOD)皆為100 μg·kg；隋 凱等利用多功能凈化柱MFC-HPLC同時檢測小麥中DON和NIV，LOD分別為120 μg·kg和160 μg·kg；梁 坤采用MFC-HPLC-二極管陣列檢測器(DAD)同時檢測DON和NIV，LOD皆為20 μg·kg。而同時檢測DON、NIV和ZEN三種毒素的方法未見報道。GC/GC-MS法需要待測物具有易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性等特點，操作較復雜，逐漸被液相色譜法所取代。液相色譜法中，超高效液相色譜(UPLC)的速度、靈敏度和分離度優(yōu)于高效液相色譜(HPLC)；在同時測定多種毒素方面，液相色譜-質譜兼具高分離效率和高靈敏度，但儀器昂貴，使用成本較高。本研究擬建立MFC-UPLC-DAD法同時測定小麥面粉中DON、NIV和ZEN，并與MFC-HPLC-DAD法的測定結果進行比較，為小麥真菌毒素的檢測和抗赤霉病品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料收集自赤霉病多發(fā)的長江中下游麥區(qū)、黃淮冬麥區(qū)南片和赤霉病新發(fā)的北方冬麥區(qū)、西南麥區(qū)，具有赤霉病抗性差異的品種129份，包括安農8455、安農1589、揚麥158、蘇麥3號、生選3號、揚麥14、內麥836、小偃6號、望水白9個不同抗性代表小麥品種。于2019年10月播種于安徽省合肥市廬江安徽農業(yè)大學皖中試驗站小麥赤霉病自然發(fā)病鑒定區(qū)。隨機區(qū)組設計，每個品種種植3行，行長2 m，行距20 cm，田間管理同大田，不防病。材料于2020年5月進行收獲并脫粒，脫粒后的小麥籽粒烘干暴曬后干燥密封室溫貯藏，用于毒素測定。

1.2 MFC-UPLC-DAD(以下簡稱UPLC法)法測定毒素

1.2.1 標準溶液的配制

標準儲備液：分別取1 mg DON標準品、1 mg NIV標準品，分別用甲醇溶解并配置成100 μg·mL儲備液，再將其分別配置成50 μg·mL標準儲備液；取5 mg ZEN標準品，用甲醇溶解并配置成50 μg·mL母液，取10 mL母液配置成5 μg·mL標準儲備液。標準儲備液放入-20 ℃冰箱備用。

標準曲線溶液：通過計算，移取相應量的3種毒素標準儲備液至3 mL離心管中，用水：乙腈(50:50，v/v)溶液混合并稀釋，將稀釋后混合溶液過0.22 μm濾膜，得到標準曲線溶液，其中DON、NIV含量分別為10.00、8.00、5.00、2.00、1.00和0.50 μg·mL；ZEN含量為5.00、2.00、1.00、0.50、0.10和0.05 μg·mL。三次重復。

1.2.2 樣品前處理

將待測的小麥籽粒樣品磨碎混勻，準確稱取25.0 g置于250 mL三角瓶中，加入100 mL乙腈:水(84:16, v/v)混合溶劑混勻，35 ℃超聲萃取 30 min；用定量濾紙過濾，吸取8 mL濾液于試管中，并加入80 μL乙酸；過Mycosep#226多功能凈化柱，取4 mL凈化液，于55 ℃氮吹干；加入1 mL流動相(水∶乙腈=50∶50，v/v)復溶，過0.22 μm有機濾膜后上機檢測。三次重復。

1.2.3 色譜條件

采用Agilent 1290高效液相色譜儀；C18柱，2.1 mm×100 mm，1.8 μm；DON和NIV檢測波長240 nm，ZEN毒素檢測波長274 nm；流動相A為水(含0.1%乙酸)，B為乙腈。梯度洗脫：流動相0～3 min 5% B；3～9 min 10% B；9～16 min 92% B；16～18 min 50% B；18～20 min 10% B；流速為0～9 min 0.1 mL·min；9～20 min 0.15 mL·min。柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

1.2.4 精密度及回收率計算

通過計算，分別移取相應量的3種毒素標準儲備液至3 mL離心管中，用水∶乙腈(50∶50，v/v)溶液稀釋，過0.22 μm有機濾膜，得到混合標準溶液?；旌蠘藴嗜芤褐蠨ON及NIV毒素含量分別為5、8和10 μg·mL，ZEN毒素含量分別為1、2和5 μg·mL。用UPLC法測混合標準溶液中毒素含量，連續(xù)測定5 d，每天重復3次，以測定日間、日內精密度。

精密度=重復結果的標準差/重復結果平均值×100%

以100 mL 84%乙腈-水溶液為空白樣品，在空白樣品中分別加入2.5 μg、25.0 μg、50.0 μg三種毒素標準品，配制成100 μg·kg、1 000 μg·kg、2 000 μg·kg三個標準樣品，用UPLC法測定其含量并計算回收率。

回收率=(標準樣品測定結果-空白樣品測定結果)/標準水平值×100%

1.3 MFC-HPLC-DAD(以下簡稱HPLC法)法測定毒素

參照梁 坤的方法分別測定9個不同抗性小麥樣品的DON、NIV和ZEN含量。同時測定DON、NIV含量，采用(250 mm×4.6 mm, 5 μm)C18色譜柱，流動相為水∶乙腈∶甲醇(90∶5∶5，v/v/v)，流速為1.0 m L·min，柱溫40 ℃，進樣量為20 μL，DAD檢測波長為218 nm；ZEN含量測定，采用色譜柱為C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為水∶乙腈∶甲醇(46∶46∶8，v/v/v)，DAD檢測波長270 nm，柱溫40 ℃，進樣量為20 μL。3次重復。

1.4 數(shù)據處理

數(shù)據用EXCEL 2016進行統(tǒng)計及初步處理，用 GraphPad Prism 8.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 UPLC法的建立

2.1.1 標準曲線及定量限分析

結果(表1)表明，三種毒素標準曲線的相關系數(shù)()均大于0.994，說明其在一定檢測范圍(0.01～10.00 μg·mL)內線性關系良好。在儀器信噪比3(S/N)和10時所對應的濃度分別為檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，DON、NIV及ZEN毒素的LOD分別為15 μg·kg、78 μg·kg、18 μg·kg，LOQ分別為19 μg·kg、90 μg·kg、18 μg·kg。測定的三種真菌毒素的LOD和LOQ均低于《食品國家安全標準食品中真菌毒素限量》(GB2761-2017)中毒素限量標準。

表1 UPLC法DON、NIV、ZEN的標準曲線、檢出限及定量限

2.1.2 精密度及回收率分析

精密度測定結果(表2)表明，本方法精密度均小于2%?；厥章仕鶞y結果(表3)表明，回收率在80.25%～118.35%之間，相對標準偏差為 0.20%～1.92%，說明該方法重現(xiàn)性及回收率均良好。

表2 UPLC法DON、NIV、ZEN的精密度

表3 UPLC法DON、NIV、ZEN的回收率

2.2 UPLC與HPLC法保留時間、精密度和回收率比較

分別使用UPLC法與HPLC法測定不同濃度的三種毒素的混合標準溶液測定精密度時混合標準溶液中DON、NIV及ZEN毒素含量分別為5.00、5.00以及1.00 μg·mL；測定回收率時混合標準溶液中DON、NIV以及ZEN毒素含量皆為100 μg·kg。結果顯示，在0.01～10.00 μg·mL內，三種毒素的標準曲線具有良好的線性關系，說明這兩種方法的測量結果均準確、可靠。UPLC法同時測定三種毒素所需保留時間為14.68 min，而HPLC法不能同時測定ZEN與另外兩種毒素，需要分2次前處理制備和上機，累積保留時間為25.19 min；兩種方法的精密度均低于2%，精密度良好；UPLC法測定三種毒素的回收率均高于HPLC法。

表4 兩種方法保留時間、精密度及回收率情況

2.3 UPLC法與HPLC法測定結果比較

分別使用兩種方法對9個小麥材料中3種毒素含量進行檢測，結果如表5所示，DON、NIV、ZEN的檢出率在UPLC法中分別為77.78%、77.78%、29.62%，而在HPLC法中分別為 51.85%、62.96%、44.44%，說明UPLC法更靈敏；兩種方法檢出DON、NIV和ZEN值的相關系數(shù)分別為0.993、0.979和0.906，一致性良好。

表5 UPLC法和HPLC法DON、NIV、ZEN毒素含量測定結果

2.4 UPLC法對129個材料的檢測結果

如圖1所示，DON與NIV檢出率分別為99%(128/129)和92%(119/129)，ZEN的檢出率較低，為70%(90/129)。根據GB2761-2017中對小麥及小麥制品DON毒素和ZEN毒素的限量標準，DON毒素含量超標(>1 000 μg·kg)的品種有33份,占所測小麥品種的25%；ZEN毒素含量超標(>60 μg·kg)的為20份，占所測小麥品種的15%；我國尚未出臺食品中NIV的限量標準，但NIV毒素含量>500 μg·kg的有17份，占所測小麥的13%。三種毒素累積量較低且符合標準(DON毒素含量≤1 000 μg·kg，NIV毒素含量≤500 μg·kg，ZEN毒素含量≤60 μg·kg)的共80個，占全部小麥材料的 62.01%，主要來自長江中下游麥區(qū)以及黃淮冬麥區(qū)南片。

a:DON毒素頻率分布圖；b:NIV毒素頻率分布圖；c:ZEN毒素頻率分布圖；No:未檢出。

3 討 論

小麥赤霉病嚴重影響小麥產量和品質，特別是真菌侵染后產生的多種鐮刀菌毒素威脅食品安全。乳熟期前后小麥感染赤霉菌，病植株病癥較輕、病情指數(shù)低，但籽粒毒素累積量高，難以通過發(fā)病情況來判斷其毒素累積量。目前，對抗赤霉病育種的研究絕大多數(shù)集中在對抗擴展基因的應用上，缺乏對抗毒素累積/主動解毒機制的研究，不同品種小麥籽粒毒素累積量的測定是研究毒素累積抗性的第一步。對食品或飼料中的毒素測定方法很多，單一毒素檢測如ELISEA或國標法薄層色譜法，均能滿足食品檢測的需求，但精確度較低，難以用于比較品種間的差異。小麥因赤霉病引起的鐮刀菌毒素中威脅糧食安全的主要是DON、NIV和ZEN毒素，分別屬于單端孢霉烯族和玉米赤霉烯酮，為保證檢測的準確度而分別開展3種毒素的檢測，不僅增加了前處理工作量和試劑成本，也降低了儀器通量。梁 穎建立液相色譜-質譜聯(lián)用同時測定小麥面粉中DON、NIV和ZEN的方法，檢出限為5～12 ng·g，具有很好的精密度；劉笑笑建立了超高效液相色譜串聯(lián)質譜法，可同時檢測包括DON、ZEN毒素在內的15種真菌毒素，檢出限為0.2～15 μg·kg，精確度高，但前處理方法為較復雜的固相萃取法；質譜與HPLC或UPLC的聯(lián)用能夠提高檢測精度，但質譜儀造價昂貴，一般實驗室難以承擔。本研究建立了基于MFC-UPLC-DAD法同時檢測小麥中DON、NIV和ZEN三種毒素；檢出限為15～78 μg·kg；回收率在 80.25%～118.35%之間，相對標準偏差為 0.20%～1.92%；本方法所采用的多功能凈化柱前處理法無需淋化、洗脫等步驟，簡化了前處理程序；縮短了測定3種毒素的色譜分析時間，大大降低檢測成本。分別利用UPLC法和HPLC法對標準混合樣進行重復性試驗，結果顯示，在 0.01～10 μg·mL內，三種毒素的標準曲線具有良好的線性關系，說明兩種方法的測量結果均準確、可靠。UPLC法檢測體系中流速為0.1～0.15 mL·min，低于HPLC法所需流速1.0 mL·min；UPLC法同時測定三種毒素所需保留時間更短，為14.68 min。利用這兩種方法分別測定9個小麥品種的三種毒素累積量，測定結果差異不顯著，且UPLC法毒素檢出率更高。這兩種方法均可滿足實驗室中對不同小麥品種毒素累積量精確分析的需求，但UPLC法低流速、短時間、前處理簡單、可同時檢測三種毒素，節(jié)省了檢測時間和成本，提高了毒素測定的效率。

利用MFC-UPLC-DAD法測定自然發(fā)病的129份材料發(fā)現(xiàn)，符合限量標準且毒素含量較低的材料共80份，主要來自長江中下游麥區(qū)品種，例如揚麥158、揚麥14、鎮(zhèn)麥9號和安農1581，這些品種赤霉病抗性大多表現(xiàn)為中抗及以上，這與該地區(qū)長期受赤霉病危害導致的選擇壓力有關；黃淮南片的品種西農899和西南麥區(qū)的貴農775在赤霉病抗性表現(xiàn)為中抗-中感，但三種毒素累積值均較低，可作為抗毒素累積育種的 親本。

4 結 論

本研究建立了快速準確地同時定量分析小麥籽粒中DON、NIV和ZEN的MFC-UPLC-DAD方法。該方法操作簡單、靈敏度高，三種毒素的檢出限分別為78 μg·kg、15 μg·kg和18 μg·kg，遠低于《食品國家安全標準食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2017)中的相關限量規(guī)定，可滿足常規(guī)實驗室快速、準確定性定量分析和比較不同小麥品種籽粒中赤霉病毒素污染情況的 需求。