聚苯乙烯微塑料和納米塑料對萼花臂尾輪蟲有性生殖的毒性影響

陳 濤，徐曉平,2*，李彬彬，陶開燕，謝 安，黃志鵬

1. 安徽工程大學(xué)建筑工程學(xué)院，安徽 蕪湖 2410002. 皖江流域退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建省部協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 蕪湖 241000

塑料制品已成為人類生活不可或缺的一部分，特別是近年來，隨著快遞、外賣等行業(yè)的迅猛發(fā)展，塑料制品的使用頻次急劇上升造成了大量塑料垃圾. 研究[1]表明，全球范圍內(nèi)估計每年有4.80×106～1.27×107t塑料垃圾流入水環(huán)境中. 這些排入水體中的塑料在水解、風(fēng)化、光降解和生物降解等作用下會形成粒徑更小的微米級和納米級塑料微粒[2-3]. 這些粒徑較小的塑料微粒在自然作用以及人類活動的影響下進(jìn)入全球不同的水域中，在全球范圍內(nèi)不同水環(huán)境中均發(fā)現(xiàn)了微塑料污染的現(xiàn)象[4-6]. 我國長江三峽大壩上游地表水中也檢測到每平方公里含有1.925×102～1.36175×104個微塑料顆粒[7]；此外，在天津市北塘排污河表層沉積物中測得微塑料平均豐度為202.17個/kg[8]. 這些流入自然水體中的塑料微粒不僅會進(jìn)一步加重水體的污染程度，甚至可能通過食物鏈富集等形式進(jìn)入人體并危害人類健康.

微塑料(粒徑為0.1～5000 μm)和納米塑料(粒徑為1～100 nm)已經(jīng)被證明比普通塑料毒性作用更大，且它們在水體中分布廣泛，種類繁多[9-12]. 研究[13-17]表明，微塑料和納米塑料能被水生生物吸入體內(nèi)并在體內(nèi)殘留，會對許多生物產(chǎn)生不利影響. 微米尺寸的塑料會給生物腸道造成物理損傷[18]，而納米尺寸的塑料由于其粒徑小、比表面積大，甚至可能通過生物屏障，穿過生物膜，對生物的功能和健康產(chǎn)生負(fù)面作用[19].Pitt等[20]研究發(fā)現(xiàn)，聚苯乙烯納米粒子在斑馬魚處于胚胎時期起在卵黃囊中積累，并在整個發(fā)育過程中遷移到胃、腸道、肝臟、胰腺和心臟等部位，導(dǎo)致幼魚的行為受到影響. 田莉莉等[21]采用熒光和C-14同位素法研究了微塑料對海水青鳉的影響，發(fā)現(xiàn)青鳉攝食微塑料72 h后腸道內(nèi)仍有微塑料殘留. 此外，當(dāng)大型溞暴露于微塑料中會促進(jìn)其體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等活性的升高，對機體造成氧化損傷[22].暴露于3種不同粒徑的聚苯乙烯微粒中會使褶皺臂尾輪蟲的生長速度減慢、生殖力下降、壽命縮短以及繁殖時間延長，并且誘導(dǎo)機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[16].目前，關(guān)于微塑料和納米塑料對水生生物的毒理學(xué)研究[23-25]發(fā)現(xiàn)，水體中存在的塑料微粒會對多數(shù)水生生物產(chǎn)生危害.

輪蟲作為水生態(tài)系統(tǒng)中的初級消費者，在維持整個生態(tài)系統(tǒng)正常的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著重要作用. 由于輪蟲分布廣泛、世代周期短、對毒物敏感和試驗室易于培養(yǎng)等特點，其被視為水生態(tài)系統(tǒng)中測試有毒物質(zhì)的模式生物. 此外，輪蟲存在兩種生殖方式，它們在外界條件良好時進(jìn)行孤雌生殖，而當(dāng)外界條件發(fā)生改變且不利于輪蟲種群正常生存時，它們會轉(zhuǎn)而進(jìn)行有性生殖，通過產(chǎn)休眠卵的方式來抵御外界環(huán)境的變化[26]. 研究[26-29]發(fā)現(xiàn)，輪蟲種群有性生殖參數(shù)可以作為毒性測試的良好指標(biāo). 目前，關(guān)于聚苯乙烯微塑料和納米塑料對輪蟲有性生殖的影響尚不清楚. 因此，該研究以萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)為受試生物，運用24 h急性毒性、168 h慢性毒性試驗方法，研究了不同粒徑聚苯乙烯微塑料和納米塑料對萼花臂尾輪蟲有性生殖的影響，旨在探明暴露于聚苯乙烯塑料中萼花臂尾輪蟲試驗種群增長和有性生殖情況，以期為探明聚苯乙烯微塑料和納米塑料對輪蟲類重要浮游生物繁殖和種群增長的影響提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 輪蟲的來源和培養(yǎng)

試驗選用的萼花臂尾輪蟲是從蕪湖市鏡湖水體沉積物中挑選出的萼花臂尾輪蟲休眠卵孵化所得. 采用EPA作為輪蟲培養(yǎng)基[30]，斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)作為輪蟲的唯一食物. 斜生柵藻采用HB-4培養(yǎng)基[31]培養(yǎng)，經(jīng)離心濃縮后置于4 ℃下保存使用. 試驗開始前，將一定數(shù)量的萼花臂尾輪蟲置于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間需超過7 d. 預(yù)培養(yǎng)期間，每天更換萼花臂尾輪蟲培養(yǎng)基，并投喂密度為2.0×106cells/mL的斜生柵藻.

1.2 聚苯乙烯微塑料和納米塑料的性能和配制

試驗所用的兩種粒徑的聚苯乙烯微塑料(0.5 μm、1 μm)和一種粒徑的聚苯乙烯納米塑料(100 nm)是由大鵝(天津)科技有限公司生產(chǎn). 使用Malvern Zetasizer Nano ZS90和 Malvern Instruments Z (馬爾文帕納科公司，英國)兩種儀器檢測3種粒徑聚苯乙烯塑料粒子在蒸餾水中的平均粒徑、分散性指數(shù)和ζ-電位等指標(biāo)，每種指標(biāo)重復(fù)檢測3次. 聚苯乙烯微塑料和納米塑料原液在4 ℃下避光保存. 為了減小聚苯乙烯塑料粒子的聚集作用，在每次使用前進(jìn)行超聲處理(15 min). 試驗開始前，用蒸餾水配制1000 mg/L的聚苯乙烯微塑料或納米塑料母液，置于4 ℃下保存. 試驗中不同濃度測試液均采用稀釋的方法配制，為了減少藻對聚苯乙烯微塑料和納米塑料顆粒的吸附以及塑料粒子自身聚集可能帶來的影響，測試液每24 h配制一次.

1.3 聚苯乙烯微塑料和納米塑料的攝入

為了研究輪蟲對聚苯乙烯微塑料和納米塑料顆粒的攝入情況，從預(yù)培養(yǎng)的試管中隨機挑選萼花臂尾輪蟲(500只左右)，暴露在10 mg/L的3種不同粒徑的聚苯乙烯微塑料或納米塑料測試液中(不含藻)，并置于(25±1)℃、無光照的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 24 h后，采用25 μm篩網(wǎng)過濾萼花臂尾輪蟲，并用蒸餾水清洗暴露后萼花臂尾輪蟲體表的聚苯乙烯微塑料或納米塑料，重復(fù)3次. 清洗后的萼花臂尾輪蟲用4%甲醛固定，經(jīng)離心、干燥后備用. 采用掃描電子顯微鏡(SEM, Hitachi S-4800型, 日本日立公司)觀察萼花臂尾輪蟲體內(nèi)的聚苯乙烯微塑料和納米塑料. 將干燥后的部分萼花臂尾輪蟲樣品固定在SEM的樣品臺上進(jìn)行噴金，然后進(jìn)行觀察.

1.4 急性毒性試驗

為了研究聚苯乙烯微塑料和納米塑料在短期內(nèi)對輪蟲的毒性作用，進(jìn)行了24 h急性毒性測試. 根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，將100 nm聚苯乙烯納米塑料濃度設(shè)置為0.01、0.1、1、10和100 mg/L，0.5 μm聚苯乙烯微塑料濃度設(shè)置為10、25、50、100和200 mg/L，1 μm 聚苯乙烯微塑料濃度設(shè)置為1、10、100、200和400 mg/L，此外均設(shè)置1個空白對照組(EPA培養(yǎng)基). 試驗在容積為6 mL的小玻璃杯中進(jìn)行，隨機挑選10只齡長在6 h以內(nèi)的萼花臂尾輪蟲幼體于玻璃杯中，并加入5 mL不同濃度的測試液(不含斜生柵藻)，置于(25±1)℃、無光照的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個濃度設(shè)置3個重復(fù). 試驗開始24 h后，記錄每個玻璃杯中萼花臂尾輪蟲存活數(shù)目，采用機率單位算法求得急性24 h-LC50(24 h半數(shù)致死濃度)值.

1.5 有性生殖試驗

根據(jù)聚苯乙烯微塑料和納米塑料對萼花臂尾輪蟲的急性毒性試驗結(jié)果，將100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料的暴露濃度均設(shè)置為0.01、0.1、1、10和20 mg/L，另設(shè)置1個空白對照組(EPA培養(yǎng)基)，每組設(shè)置8個重復(fù).

從預(yù)培養(yǎng)的試管中挑選帶非混交卵的萼花臂尾輪蟲雌體若干，置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件與預(yù)培養(yǎng)相同)，2 h后收集萼花臂尾輪蟲幼體. 隨機挑選3只輪蟲幼體放入6 mL小玻璃杯中，加入5 mL不同濃度的測試液(內(nèi)含2.0×106cells/mL的斜生柵藻)，置于(25±1)℃、無光照的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng). 試驗開始48 h后，觀察并記錄各玻璃杯中萼花臂尾輪蟲存活總數(shù)，用于計算萼花臂尾輪蟲2 d種群增長率；試驗開始96 h后，參考文獻(xiàn)[32]的方法，對輪蟲雌體進(jìn)行計數(shù)，用于計算輪蟲混交率、受精率等指標(biāo)，計數(shù)后的輪蟲返回新的測試液中繼續(xù)暴露，暴露條件不變；試驗開始168 h后，記錄混交雌體攜帶以及落入玻璃杯底部的休眠卵數(shù)量. 試驗期間，每12 h懸浮一次沉積在玻璃杯底部的綠藻，每24 h更換一次測試液并投喂新鮮的藻.

種群增長率(r)計算公式：

式中：Nt和N0分別為試驗結(jié)束和試驗開始時的輪蟲數(shù)量；t為時間，該研究中t取2 d；

有性生殖試驗包含以下指標(biāo)：OF/NOF為攜卵的雌體數(shù)與不攜卵的雌體數(shù)的比值；MF/AF為攜卵的雌體中混交雌體數(shù)與非混交雌體數(shù)的比值；MR(混交率)為種群中混交雌體數(shù)與雌體總數(shù)的比值；FR(受精率)為種群中受精的混交雌體數(shù)與混交雌體總數(shù)的比值；RE(休眠卵產(chǎn)量)為5 mL培養(yǎng)液中輪蟲在7 d內(nèi)所產(chǎn)的休眠卵總數(shù)[28]；NOEC為最大未觀察到效應(yīng)濃度，mg/L；LOEC為最小觀察到效應(yīng)濃度，mg/L. 根據(jù)單因素方差分析結(jié)果確定各參數(shù)的NOEC和LOEC.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析. 利用單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(LSD檢驗)法比較輪蟲各濃度組有性生殖指標(biāo)與對照組間的差異顯著性，P＜0.05表示顯著性差異. 此外，對輪蟲有性生殖參數(shù)與不同粒徑聚苯乙烯微塑料和納米塑料濃度間的劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行回歸分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 聚苯乙烯微塑料和納米塑料特性

100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm 聚苯乙烯微塑料在蒸餾水中的平均粒徑、分散性指數(shù)和ζ-電位值如表1所示. 數(shù)據(jù)顯示，與1 μm聚苯乙烯微塑料相比，100 nm聚苯乙烯納米塑料和0.5 μm聚苯乙烯微塑料在蒸餾水中穩(wěn)定性更高，聚集程度更低.

表1 不同尺寸聚苯乙烯微塑料和納米塑料在蒸餾水中的參數(shù)Table 1 Parameters of the different size polystyrene microplastics and nanoplastics in the distilled water

2.2 聚苯乙烯微塑料和納米塑料的攝入

圖1為100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料原液經(jīng)過濾、干燥后電鏡掃描結(jié)果.圖2為空白對照組和暴露于10 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料溶液中24 h后被攝入和沉積在輪蟲體內(nèi)的情況. 由圖2可見，暴露24 h后聚苯乙烯微塑料和納米塑料已被攝入并沉積在輪蟲體內(nèi).

圖1 不同粒徑聚苯乙烯微塑料和納米塑料原液的SEM圖Fig.1 SEM images of polystyrene microplastics and nanoplastics with different sizes

圖2 萼花臂尾輪蟲24 h攝入不同粒徑聚苯乙烯塑料的SEM圖Fig.2 SEM Images of the polystyrene plastics of different particle sizes ingested by Brachionus calyciflorus in 24 h

2.3 聚苯乙烯微塑料和納米塑料對輪蟲的急性毒性

急性毒性試驗結(jié)果(見表2)顯示，隨著聚苯乙烯塑料粒徑的增加，100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料對萼花臂尾輪蟲的24 h-LC50值不斷升高，表明隨著聚苯乙烯塑料粒徑的增加，其對輪蟲的急性毒性減小.

表2 不同尺寸聚苯乙烯微塑料和納米塑料對萼花臂尾輪蟲的24 h半致死濃度Table 2 The 24 h median lethal concentration for Brachionus calyciflorus exposed to polystyrene microplastics and nanoplastics of different diameters

2.4 聚苯乙烯塑料對輪蟲有性生殖的影響

單因素方差分析結(jié)果表明，不同粒徑的聚苯乙烯塑料對萼花臂尾輪蟲2 d種群增長率影響不同. 0.5 μm聚苯乙烯微塑料對輪蟲2 d種群增長率有影響，但影響不顯著(P＞0.05)；100 nm聚苯乙烯納米塑料和1 μm聚苯乙烯微塑料均可引起輪蟲種群數(shù)量的顯著變化(P均小于0.05). 與對照相比，暴露于20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.01、0.1、1、10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料均顯著降低了輪蟲的種群增長率(P均小于0.05)(見表3).

0.5、1 μm聚苯乙烯微塑料和100 nm聚苯乙烯納米塑料對輪蟲4 d 的OF/NOF值均有顯著影響. 與對照組相比，10 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.01、0.1、1、20 mg/L的0.5 μm聚苯乙烯微塑料均顯著降低了OF/NOF值(P均小于0.05)；0.01和10 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料則顯著增加了OF/NOF值(P均小于0.05). 10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料均顯著降低了輪蟲的MF/AF值(P均小于0.05)，其他處理組則無顯著變化(見表3).

0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料以及100 nm聚苯乙烯納米塑料對輪蟲4 d混交率(MR)均有顯著影響(見表3). 與對照組相比，暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料均顯著降低輪蟲的混交率(P均小于0.05)，且混交率為0. 暴露于0.01、1和20 mg/L的0.5 μm聚苯乙烯微塑料分別顯著降低了44.3%、66.2%和41.4%的輪蟲混交率(P均小于0.05)；而與對照組相比，暴露于0.01、0.1、1和10 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料分別顯著增加了139.7%、55.3%、110.2%和118.6%的輪蟲混交率(P均小于0.05).

與對照組相比，暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料導(dǎo)致輪蟲的受精率(FR)顯著降低，且受精率均為0 (P均小于0.05)；暴露于0.01和0.1 mg/L的0.5 μm聚苯乙烯微塑料分別顯著增加了105.0%和79.9%的輪蟲受精率(P均小于0.05)；0.01、0.1、1、10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料對輪蟲受精率均無顯著影響(見表3).

單因素方差分析結(jié)果顯示，0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料和100 nm聚苯乙烯納米塑料均對輪蟲休眠卵產(chǎn)量具有顯著影響(P均小于0.05). 暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料均顯著降低輪蟲休眠卵產(chǎn)量，休眠卵產(chǎn)量均為0 (P均小于0.05)，與納米塑料對受精率的影響相似. 暴露于0.01、0.1、1、10和20 mg/L的0.5 μm聚苯乙烯微塑料分別顯著增加了292.9%、307.1%、290.0%、514.3%和152.9%的輪蟲休眠卵產(chǎn)量(P均小于0.05)；暴露于0.1 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料對輪蟲休眠卵產(chǎn)量也有顯著促進(jìn)作用(P＜0.05)，與對照組相比，休眠卵產(chǎn)量增加了50.6%(見表3).

表3 暴露于不同濃度聚苯乙烯微塑料和納米塑料中萼花臂尾輪蟲的有性生殖參數(shù)Table 3 The reproductive parameters of Brachionus calyciflorus exposed to different concentrations of polystyrene microplastics and nanoplastics

回歸分析結(jié)果(見表4)顯示，0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料以及100 nm聚苯乙烯納米塑料濃度的對數(shù)值均與輪蟲有性生殖指標(biāo)之間存在不同程度的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其中，100 nm聚苯乙烯納米塑料濃度的對數(shù)值與輪蟲受精率和休眠卵產(chǎn)量之間存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料濃度的對數(shù)值則分別與輪蟲種群增長率和休眠卵產(chǎn)量存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系. 由表5可見，暴露于1 μm聚苯乙烯微塑料中輪蟲種群增長率、混交率和休眠卵產(chǎn)量的LOEC值均較低，暴露于0.5 μm聚苯乙烯微塑料中輪蟲混交率和休眠卵產(chǎn)量的LOEC值均較低.

表4 萼花臂尾輪蟲有性生殖參數(shù)與聚苯乙烯微塑料和納米塑料濃度對數(shù)值之間的關(guān)系Table 4 Relationships between the reproductive parameters of Brachionus calyciflorus and logarithm concentration of polystyrene microplastics and nanoplastics

表5 暴露于聚苯乙烯微塑料和納米塑料中萼花臂尾輪蟲有性生殖參數(shù)的NOEC、LOEC值Table 5 NOEC and LOEC values of the sexual reproductive parameters of Brachionus calyciflorus exposed to polystyrene microplastics and nanoplastics

3 討論

3.1 聚苯乙烯塑料對輪蟲的急性毒性影響

萼花臂尾輪蟲作為水生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，由于其對毒物十分敏感，在殺蟲劑、重金屬、抗生素等毒物測試中得到廣泛應(yīng)用[33-36]. 因此，該研究選用萼花臂尾輪蟲作為受試生物，探究了不同粒徑聚苯乙烯塑料對輪蟲繁殖的影響. 急性試驗結(jié)果顯示，分別暴露于100 nm、0.5 μm和1 μm三種粒徑的聚苯乙烯塑料24 h后，隨著聚苯乙烯塑料粒徑的增大，輪蟲的24 h-LC50值升高，表明隨著塑料粒徑的增大，其對輪蟲的毒性作用在降低. 研究[16,37]發(fā)現(xiàn)，與大粒徑的微塑料相比，小粒徑的納米塑料具有更高的生物活性，更易穿透生物膜且毒性更強，對生物機體會造成更大的傷害. 因此，相同濃度下聚苯乙烯微塑料和納米塑料的粒徑越小，顆粒越多，對輪蟲的急性毒性更強.

急性試驗作為一種標(biāo)準(zhǔn)的毒物測試方法，在毒理學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[38]. 但僅依靠急性試驗結(jié)果來評價毒物的毒性作用，可能會忽視毒物與生物體之間復(fù)雜的化學(xué)或生物作用，從而影響毒理學(xué)評價結(jié)果的完整性和準(zhǔn)確性. 此外，不同材質(zhì)的塑料顆粒在水體中分布廣泛，且濃度較低，水生生物長期暴露在低濃度的塑料粒子中會產(chǎn)生慢性毒性作用. 因此，該研究還探討了不同粒徑聚苯乙烯微塑料和納米塑料對萼花臂尾輪蟲有性生殖的慢性毒性影響.

3.2 聚苯乙烯塑料對輪蟲種群的影響

目前，關(guān)于微塑料和納米塑料污染物對藻類、輪蟲和大型溞等水生生物種群增長的影響已有報道[15,16,39-41]. Zhang等[42]研究了微塑料與海洋中肋骨條藻(Skeletonema costatum)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)聚氯乙烯微塑料會嵌入微藻細(xì)胞壁，對藻類細(xì)胞表面造成物理損傷，從而限制細(xì)胞與環(huán)境之間能量和物質(zhì)的交換. Jeong等[16]發(fā)現(xiàn)，高濃度的0.05 μm聚苯乙烯微球?qū)喯x的毒性作用顯著高于0.5和6 μm聚苯乙烯微球，暴露于6 μm聚苯乙烯微球后輪蟲只表現(xiàn)出輕微的生長遲緩. 筆者研究中，萼花臂尾輪蟲的生長抑制程度也與聚苯乙烯塑料粒徑密切相關(guān). 與Liu等[15]試驗結(jié)果不同，筆者研究中暴露于100 nm聚苯乙烯納米塑料后，高濃度的聚苯乙烯納米塑料顯著抑制了輪蟲種群增長率，而低濃度的聚苯乙烯納米塑料對輪蟲種群增長率無顯著影響；當(dāng)輪蟲暴露于0.5 μm聚苯乙烯微塑料時，種群增長率卻無顯著變化；暴露于0.01、0.1、1、10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料均顯著抑制輪蟲種群增長率. 輪蟲作為濾食性動物，其通過自身不斷的旋轉(zhuǎn)游動來攝取環(huán)境中的食物，而在試驗期間由于攝入了大量聚苯乙烯微塑料和納米塑料，導(dǎo)致其從綠藻中攝入營養(yǎng)不足，從而影響輪蟲的存活與繁殖，這與Lisbeth等[43]研究結(jié)果類似. 研究[16,41]表明，輪蟲能攝入粒徑較小的微塑料，并且在胃、腸道等消化器官中積累. 當(dāng)輪蟲暴露在濃度較高的100 nm聚苯乙烯納米塑料中，由于相同濃度的小粒徑納米塑料的數(shù)量更多，納米塑料更有可能透過生物膜進(jìn)入組織和細(xì)胞內(nèi)，對輪蟲產(chǎn)生了氧化損傷；而暴露于粒徑相對較大的0.5 μm聚苯乙烯微塑料時，微塑料進(jìn)入組織和細(xì)胞的可能性較小，可能只在輪蟲腸道內(nèi)殘留，并不會對機體產(chǎn)生較大的影響；而輪蟲暴露于1 μm聚苯乙烯微塑料時，輪蟲排泄物顆粒較大、呈團狀，且在輪蟲體表停留時間較長. 研究[7]表明，攝入輪蟲體內(nèi)的聚苯乙烯微塑料可能會影響輪蟲的浮力和游泳行為，進(jìn)而影響輪蟲食物的攝入. SEM測試結(jié)果也表明，暴露于100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料24 h后，塑料顆粒在輪蟲體內(nèi)積累，且小粒徑的塑料顆粒在體內(nèi)積累的數(shù)量更多，這可能是導(dǎo)致小粒徑納米塑料對輪蟲毒性作用更大的原因. 值得注意的是，微塑料和納米塑料的攝入可能導(dǎo)致其從水體進(jìn)入生物體和沉積物中，這些微塑料和納米塑料不僅會對輪蟲產(chǎn)生威脅，還會對輪蟲所處的食物鏈或食物網(wǎng)產(chǎn)生較大影響，甚至經(jīng)食物鏈傳播進(jìn)入人體，對人類的健康存在一定風(fēng)險. 因此，關(guān)于不同粒徑微塑料和納米塑料在輪蟲體內(nèi)積累和排泄的過程值得關(guān)注.

3.3 聚苯乙烯塑料對輪蟲有性生殖的影響

單因素方差分析結(jié)果顯示，0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料以及100 nm聚苯乙烯納米塑料對萼花臂尾輪蟲混交率均有顯著影響. 100 nm聚苯乙烯納米塑料和0.5 μm聚苯乙烯微塑料均顯著抑制了輪蟲混交率，而1 μm聚苯乙烯微塑料則顯著增加了輪蟲混交率，表明3種塑料粒子對輪蟲的生殖已經(jīng)顯示出較高的毒性作用. 與對照組相比，暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料中輪蟲的混交率為0，說明輪蟲的混交行為受到抑制，輪蟲的有性生殖行為減少. 然而，與其他兩種粒徑的聚苯乙烯塑料相比，暴露于相同濃度的1 μm聚苯乙烯微塑料中輪蟲混交率更高. 推測可能是大顆粒聚苯乙烯微塑料影響了輪蟲的正常生命活動，種群增長受到抑制，使得輪蟲轉(zhuǎn)變生殖方式，輪蟲群體中出現(xiàn)大量混交雌體所致. 一般認(rèn)為，輪蟲在受到毒物脅迫時輪蟲親代會將更多的能量投入到解毒過程中，從而導(dǎo)致子代數(shù)量和質(zhì)量的降低[44]. 3種粒徑聚苯乙烯塑料暴露后LOEC結(jié)果顯示，暴露于較低濃度的聚苯乙烯塑料中即可引起輪蟲混交率發(fā)生顯著變化，表明混交率可以作為評價聚苯乙烯微塑料和納米塑料對輪蟲毒性作用的一個敏感參數(shù). Xi等[32]研究了4種有機氯殺蟲劑對輪蟲的生殖影響，發(fā)現(xiàn)混交率是一個合適的毒性評價測試終點，與筆者試驗結(jié)果一致.

在評價污染物對輪蟲有性生殖毒性時，受精率也是一個重要的監(jiān)測指標(biāo). Tian等[45]研究發(fā)現(xiàn)，睪丸酮(testosterone)與不同濃度氟他胺(flutamide)聯(lián)合暴露時，對輪蟲種群混交雌體受精率有顯著抑制作用，進(jìn)而可能影響輪蟲休眠卵產(chǎn)量. 當(dāng)試驗系統(tǒng)中輪蟲混交雌體數(shù)幾乎為0時，會導(dǎo)致輪蟲受精過程無法完成，從而導(dǎo)致受精率下降，休眠卵無法產(chǎn)生. 筆者研究結(jié)果也證實了這一點，試驗開始168 h后，暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料中輪蟲的休眠卵產(chǎn)量為0. 而與對照組相比，低濃度的0.5 μm聚苯乙烯微塑料對輪蟲的受精率有顯著促進(jìn)作用，高濃度也呈現(xiàn)促進(jìn)作用但不顯著. 推測暴露于低濃度0.5 μm聚苯乙烯微塑料后，輪蟲受精作用增強，輪蟲休眠卵的產(chǎn)量也隨之增加. 暴露于1 μm聚苯乙烯微塑料后，輪蟲混交率顯著增加，而受精率無顯著影響，推測該暴露條件下輪蟲受精行為受到影響. 筆者研究發(fā)現(xiàn)，輪蟲生殖方式的改變與聚苯乙烯塑料粒徑之間緊密相關(guān).

休眠卵作為輪蟲有性生殖的最終產(chǎn)物，被認(rèn)為是輪蟲的“種子”，輪蟲通過轉(zhuǎn)變生殖方式產(chǎn)生休眠卵來躲避外界不利的條件，以保證輪蟲種群的延續(xù)性.在毒理學(xué)試驗中，休眠卵產(chǎn)量是比輪蟲其他種群參數(shù)對污染物更為敏感的指標(biāo)[46]. 筆者研究中暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料后，輪蟲休眠卵產(chǎn)量、混交率和受精率均受到顯著抑制；暴露于0.5 μm聚苯乙烯微塑料中輪蟲的混交率受到一定程度的抑制，受精率受到一定程度的促進(jìn)，而休眠卵產(chǎn)量表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，可能與微塑料暴露后，輪蟲的受精作用加強有關(guān)；暴露于不同濃度(除20 mg/L外)的1 μm聚苯乙烯微塑料中，輪蟲混交率均顯著增加，意味著試驗體系中混交雌體數(shù)量增加，輪蟲受精概率增大，但各處理組中輪蟲受精率無顯著變化，且休眠卵產(chǎn)量只在0.1 mg/L下顯著增加. 由此可見，輪蟲休眠卵的產(chǎn)生是多種因素共同作用的結(jié)果，單一指標(biāo)的變化并不能決定最終休眠卵的產(chǎn)量. Tian等[45,47]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于幾種不同內(nèi)分泌干擾素中輪蟲有性生殖指標(biāo)也會發(fā)生改變. 推測聚苯乙烯微塑料和納米塑料暴露導(dǎo)致輪蟲體內(nèi)某些激素含量的變化可能是輪蟲生殖方式發(fā)生改變的一個原因，關(guān)于輪蟲生殖方式發(fā)生轉(zhuǎn)變的內(nèi)在機制還需進(jìn)一步研究.

該研究在評價聚苯乙烯微塑料和納米塑料對輪蟲各有性生殖指標(biāo)影響時，低濃度的聚苯乙烯微塑料和納米塑料即可引起輪蟲休眠卵產(chǎn)量的顯著變化，說明可以選用輪蟲休眠卵產(chǎn)量來評價自然水體中聚苯乙烯微塑料和納米塑料對輪蟲的有性生殖毒性. 然而，由于污染物自身性質(zhì)和輪蟲品系不同，在評價聚苯乙烯微塑料和納米塑料對輪蟲各指標(biāo)的敏感性時可能存在一定差異，還需要進(jìn)一步研究. 輪蟲在整個淡水生態(tài)系統(tǒng)中扮演著非常重要的作用，當(dāng)輪蟲轉(zhuǎn)變生殖方式進(jìn)行有性生殖時，必然導(dǎo)致短期內(nèi)整個輪蟲種群數(shù)量的變化，進(jìn)而影響整個水生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動[48-49]. 因此，如何正確、全面地評價水中聚苯乙烯微塑料和納米塑料對輪蟲種群的影響及其帶來的生態(tài)風(fēng)險還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

a) 聚苯乙烯微塑料和納米塑料對萼花臂尾輪蟲的急性毒性與聚苯乙烯塑料粒徑有關(guān)，暴露于粒徑較小的聚苯乙烯納米塑料后輪蟲的24 h-LC50值較低，急性毒性較大.

b) 暴露于20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料和0.01、0.1、1、10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料中，輪蟲種群增長率均顯著降低.

c) 暴露于聚苯乙烯微塑料和納米塑料均會導(dǎo)致輪蟲有性生殖增加，產(chǎn)生更多的休眠卵，使整個輪蟲種群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能對整個水生態(tài)系統(tǒng)存在一定的環(huán)境風(fēng)險.

d) 在評價聚苯乙烯微塑料和納米塑料對蕪湖水體萼花臂尾輪蟲有性生殖參數(shù)影響時，各參數(shù)的敏感性不同，低濃度的聚苯乙烯微塑料和納米塑料暴露即可引起輪蟲混交率和休眠卵產(chǎn)量的顯著變化，表明輪蟲混交率和休眠卵產(chǎn)量可以作為合適的測試指標(biāo).