煙草疫霉菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的開發(fā)與應(yīng)用

李江林 李宏江 李昊熙

（貴州大學(xué)煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)重點實驗室，貴州貴陽 550025）

煙草黑脛病由煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）引起[1]，主要危害煙草的根和莖基部，致使維管束組織壞死，最終導(dǎo)致煙株萎蔫枯死。煙草黑脛病發(fā)病率高、危害嚴(yán)重，在我國大部分煙草種植區(qū)均造成重大經(jīng)濟(jì)損失，是困擾煙草生產(chǎn)的主要病害[2]。更為重要的是，煙草疫霉菌產(chǎn)生的病殘體可以在煙田土壤中存留若干年，導(dǎo)致黑脛病非常頑固，防控措施效果有限，極大地增加了病原菌檢測工作的難度[3]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification assay，LAMP）是一種利用目標(biāo)基因設(shè)計4條特異性引物，在恒溫條件下實現(xiàn)大量擴(kuò)增靶標(biāo)的新方法[4]。該方法可以在恒溫條件下快速高效地檢測病原菌，目前已經(jīng)在青枯病[5]和柑橘線蟲病[6]等土傳性病害中得到應(yīng)用。經(jīng)過鑒定，煙草疫霉菌對煙草的致病因子為煙草疫霉菌特有的半胱氨酸蛋白酶[7]，可以作為該種病原菌鑒定的目標(biāo)基因。本研究針對煙草疫霉菌特有的致病因子半胱氨酸蛋白酶，設(shè)計了一套LAMP檢測方法，并在反應(yīng)條件上進(jìn)行了簡化，目的是為基層煙葉站等機(jī)構(gòu)建立煙草黑脛病的快速檢測體系。

1 材料與方法

1.1 LAMP反應(yīng)引物的設(shè)計

根據(jù)Zhang等[7]開展的煙草疫霉菌致病因子對煙草侵染發(fā)病的相關(guān)試驗結(jié)果，選取該病原菌具有明顯致病作用的半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45作為檢測體系的靶標(biāo)位點。從GenBank的數(shù)據(jù)庫中下載煙草疫霉菌菌株INRA-310的PpCys45完整基因序列，該段序列全長1 068 bp，對應(yīng)的序列號為XM_00 8906602.1。以這段PpCys45基因的序列為模板，在LAMP 引物設(shè)計軟件 PrimerExplorer V5（http：//primer explorer.jp/e/）中設(shè)計反應(yīng)引物。選擇ΔG最低的一組4條反應(yīng)引物到檢測體系中，選取的4條引物序列如表1所示。由生工生物工程（上海）股份有限公司按照序列合成4條引物后，將引物配制成濃度為10 μmol/L的溶液，供后續(xù)檢測反應(yīng)使用。

表1 針對煙草疫霉菌PpCys45基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測引物

1.2 煙草疫霉菌DNA的檢測

在貴州省貴陽市開陽縣宅吉鄉(xiāng)和畢節(jié)市大方縣六龍鎮(zhèn)的煙草種植區(qū)采樣取得感染煙草黑脛病的煙株樣品各1個，命名為樣品Z和樣品L。剖開感病煙株，從發(fā)病部位與健康木質(zhì)部的交界處挑取煙株組織若干，置于配制好的V8培養(yǎng)基（配方為V8混合果汁 100 mL、瓊脂粉 20 g、碳酸鈣 2.5 g）表面，分離煙草疫霉菌菌株。培養(yǎng)基在25℃條件下培養(yǎng)48 h后，挑取一小塊從煙株組織生長出的灰色菌絲，置于另一個配制好的V8培養(yǎng)基上表面，在25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，得到煙草疫霉菌菌株的純培養(yǎng)，該純培養(yǎng)保存在貴州大學(xué)煙草學(xué)院實驗室供后續(xù)使用。使用Ezup柱式超級植物基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司生產(chǎn)），從保存的純培養(yǎng)中提取菌株的DNA，用于后續(xù)檢測反應(yīng)。

利用Loopamp?朗報?脫氧核糖酸擴(kuò)增試劑盒（榮研生物科技中國有限公司生產(chǎn)）與合成并配制到相應(yīng)濃度的4條引物，對提取得到的菌株Z、L的DNA進(jìn)行煙草疫霉菌LAMP檢測反應(yīng)，利用熒光目視檢測試劑（FD，榮研生物科技中國有限公司生產(chǎn)）顯示反應(yīng)結(jié)果。LAMP反應(yīng)在200 μL的透明PCR管中進(jìn)行，反應(yīng)體系的總體積為25 μL，分別包含各個菌株的DNA提取物2 μL，以及試劑盒中包含的其他反應(yīng)試劑和引物，反應(yīng)量如表2所示。檢測反應(yīng)利用無菌水作為空白對照。

表2 針對煙草疫霉菌PpCys45基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測反應(yīng)試劑和引物用量單位：μL

將配制好反應(yīng)體系的PCR管在60℃條件下反應(yīng)60 min之后，在80℃條件下再反應(yīng)5 min來終止環(huán)介導(dǎo)的進(jìn)行。相關(guān)的恒溫反應(yīng)在PCR儀（型號為Biometra Tone 96G）中進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后直接觀察PCR管內(nèi)熒光變化。

1.3 感染黑脛病煙株組織的檢測

在貴陽市開陽縣楠木渡鎮(zhèn)采樣取得感染黑脛病的煙株樣品1個。該樣品的癥狀如圖1所示，表現(xiàn)為煙株莖基部發(fā)黑壞死，根部萎蔫，根毛大部分脫落；用刀片縱向剖開煙株的莖基部，還可以觀察到明顯的木質(zhì)部感病組織脫水，皺縮成碟片狀。

利用Loopamp?朗報?脫氧核糖酸擴(kuò)增試劑盒與合成并配制到相應(yīng)濃度的4條引物，對感染黑脛病煙株的根部組織（編號G）和莖基木質(zhì)部組織（編號J）直接進(jìn)行煙草疫霉菌LAMP檢測，不再提取DNA。挑取一小段感病根部尖端組織用于直接檢測根部煙草疫霉菌（G），挑取小片木質(zhì)部碟片狀感病組織用于直接檢測莖基木質(zhì)部病原菌（J）。將挑取的根部組織（G）和莖基木質(zhì)部組織（J）轉(zhuǎn)移到PCR管中，按照表2的試劑量加入各種反應(yīng)試劑和4條引物開展后續(xù)反應(yīng)，利用熒光目視檢測試劑顯示反應(yīng)結(jié)果。直接檢測反應(yīng)利用無菌水作為陰性對照，利用前一步驟提取的菌株Z的DNA作為陽性對照。

將感病組織、配制好的試劑與引物反應(yīng)體系的PCR管直接在電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)）中反應(yīng)60 min（60℃），之后再在約80℃的熱水中反應(yīng)5 min來終止環(huán)介導(dǎo)進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后直接觀察PCR管內(nèi)熒光變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草疫霉菌DNA的檢測結(jié)果

從貴陽市和畢節(jié)市的烤煙種植區(qū)采樣取得的煙草疫霉菌菌株Z和L的DNA經(jīng)過LAMP反應(yīng)的熒光檢測結(jié)果如圖2所示。利用擴(kuò)增試劑盒和設(shè)計的4對引物，在PCR儀中進(jìn)行LAMP 60℃反應(yīng)60 min，菌株Z和L的DNA可以在該反應(yīng)體系條件下發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生綠色熒光，反應(yīng)結(jié)果能夠被肉眼觀察到?？瞻讓φ諢o菌水加上相同的試劑和引物，在相同的反應(yīng)條件下不能發(fā)生反應(yīng)，也就不能產(chǎn)生熒光。

2.2 感染黑脛病煙株組織的檢測結(jié)果

感染黑脛病的煙株組織直接LAMP檢測結(jié)果的熒光反應(yīng)結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過在水浴鍋中60℃LAMP反應(yīng)60 min，從貴陽市烤煙種植區(qū)采集得到的感染黑脛病的煙株根部組織（G）、莖基木質(zhì)部組織（J）與4條引物在擴(kuò)增試劑盒中在本反應(yīng)體系之下可以發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生綠色熒光。感病烤煙組織經(jīng)過直接反應(yīng)產(chǎn)生的熒光較陽性對照菌株DNA經(jīng)過LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的熒光略淺，但是仍然可用肉眼觀察到。陰性對照無菌水在相同條件下的反應(yīng)沒有產(chǎn)生熒光。

3 結(jié)論與討論

本研究針對煙草疫霉菌的致病因子半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45設(shè)計了4條特異性引物，并利用Loopamp?朗報?脫氧核糖酸擴(kuò)增試劑盒和熒光目視檢測試劑，在PCR儀中進(jìn)行60℃條件下的LAMP反應(yīng)60 min后，貴陽市開陽縣宅吉鄉(xiāng)和畢節(jié)市大方縣六龍鎮(zhèn)收集的煙草疫霉菌菌株的DNA均可以在本研究設(shè)計的檢測體系下發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可以直接觀察到的綠色熒光反應(yīng)，檢測方法快速高效。除此之外，利用這4條特異性引物和相應(yīng)試劑盒中的各個試劑，將感染黑脛病煙株的根部組織和莖基部木質(zhì)部組織在電熱恒溫水浴鍋中進(jìn)行60℃條件下的LAMP反應(yīng)60 min后，也可以發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生綠色熒光。直接從感染黑脛病組織上產(chǎn)生的熒光也能被肉眼直接觀察判斷。由此得出，青枯病[5]和柑橘線蟲病[6]等土傳性病害的LAMP檢測方法也可以在黑脛病上應(yīng)用，本研究設(shè)計的LAMP檢測方法可以應(yīng)用于黑脛病的檢測，結(jié)果快速準(zhǔn)確。

吳 娜等[8]開發(fā)過一套針對煙草疫霉菌的分子標(biāo)記位點核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）的LAMP檢測體系，靈敏度非常高。本研究開發(fā)的LAMP體系使用半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45為靶斑，靈敏度也足夠用肉眼分辨。但是，疫霉菌屬（Phytophthora）還有其他種類的幾種病原菌，能引起多種根腐類病害[9]，它們在ITS存在一定程度的相似性。本檢測體系針對的半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45是煙草疫霉菌特異性的致病因子[7]，對于煙草黑脛病的病原有極強(qiáng)的針對性，可以提高檢測的靈敏度。此外，本研究開發(fā)的LAMP體系利用普通電熱恒溫水浴鍋就可以完成檢測，直接針對感染黑脛病的煙株組織就能夠完成反應(yīng)，方便煙葉站等分子實驗設(shè)備不充分的基層檢測隊伍使用，對于煙草黑脛病等土傳性病害的快速精確檢測有極大的促進(jìn)作用。