健脾斂瘡方對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠保護作用的機制研究*

張雪俠，鐘 鑫，劉方洲，劉長河，周 敏，何穎欣，郭曉燕

(1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004；2.鄭州卷煙廠康復醫(yī)院，河南 鄭州 450004；3.鄭州大學，河南 鄭州 450001)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種非特異性的慢性炎癥疾病，臨床以腹痛、腹瀉、膿血便為特征，發(fā)展為結(jié)腸癌的概率較高，炎癥反應起著重要的作用[1-2]。研究[3-4]表明，UC發(fā)生后，機體迅速產(chǎn)生白細胞介素-1β(IL-1β),引起炎癥介質(zhì)釋放，同時刺激腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等更多細胞因子的釋放，加重炎癥反應，造成機體損傷?；ㄉ南┧?AA)是炎癥反應的重要介質(zhì)，可被其限速酶環(huán)氧合酶-2(COX-2)和5-脂氧化酶(5-LOX)催化，從而產(chǎn)生代謝物前列腺素E2(PGE2)、白三烯B4(LTB4)等，分別在炎癥的啟動、發(fā)展中起著重要作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸(AA)與腸道疾病有密切關系[7-8]，UC的發(fā)展伴隨著COX-2/5-LOX的激活和PGE2/LTB4含量的增加[9]。健脾斂瘡方由葛根5份、黃芩4份、川黃連2份、廣木香2份、烏藥4份、白扁豆10份、山藥10份、太子參4份、砂仁3份、山楂炭5份、車前子5份、甘草片1份、紅棗1份組成，其作用機制尚不清楚。本研究以質(zhì)量分數(shù)40 g/L葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠UC模型為研究對象，采用健脾斂瘡方治療，觀察對AA代謝中兩個主要酶COX-2和5-LOX表達的影響，從而探討健脾斂瘡方對UC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠50只，雄性，42～62 d，體質(zhì)量20～25 g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證號為11400700362621，飼養(yǎng)在河南省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心[設施使用許可證號為SYXK(豫)2019-0001]，設施使用證明號00014258。

1.2 藥品、試劑與儀器

健脾斂瘡方組成：葛根、黃芩、川黃連、太子參、白扁豆、山藥、砂仁、廣木香、烏藥、山楂炭、車前子、甘草片、紅棗。藥材均購于亳州市張仲景中藥飲片有限責任公司，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所的劉長河副研究員鑒定為正品。藥液由河南省中醫(yī)藥研究院制劑室制備。將上述藥材按照1∶10的比例與去離子水混合，靜置浸泡，然后倒入高壓提取罐內(nèi)進行提取濃縮，高溫消毒后放在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用時配制成適當?shù)馁|(zhì)量分數(shù)。

DSS,美國MP Biomedicals有限責任公司產(chǎn)品，批號Q7418；美沙拉嗪，葵花藥業(yè)集團有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號181019；PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒,均為武漢伊萊瑞特生物工程有限公司產(chǎn)品，批號依次為E-EL-0034c、E-EL-0061c、E-BC-K035-M、E-BC-K020-M；兔抗COX2，武漢三鷹生物技術有限公司產(chǎn)品，批號10003388；兔抗5-LOX、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體，艾博抗生物技術有限公司產(chǎn)品，批號依次為ab169755、ab-181602；ECL顯影液，博士德生物技術有限公司產(chǎn)品，批號AR1172。Synergy NEO型全功能酶標儀，美國BioTek儀器有限公司產(chǎn)品；DYCZ-24DNX型電泳儀和DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀，均為北京六一儀器廠產(chǎn)品；Ti型顯微鏡，日本Nikon映像儀器銷售有限公司產(chǎn)品；Fluor Chem R凝膠成像分析儀，美國Protein Simple公司。

1.3 模型的建立、動物分組與給藥

小鼠適應性喂養(yǎng)3 d，按照體質(zhì)量根據(jù)隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、美沙拉嗪組、中藥高劑量、中藥低劑量組5組，每組10只。除正常對照組外，其余各組飼喂質(zhì)量分數(shù)40 g/L DSS制備UC模型[9]。造模開始的同時進行灌胃給藥，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪溶液0.42 g/kg體質(zhì)量，中藥高、低劑量組分別給予健脾斂瘡方藥液16.6，8.3 g/kg體質(zhì)量，正常對照組和模型對照組給予去離子水，灌胃體積均為0.02 mL/g，1 d 1次，共7 d。末次給藥2 h后處死動物獲取樣本進行后續(xù)的實驗。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)及組織病理學改變

給藥結(jié)束后解剖各組小鼠，取出相同部位結(jié)腸組織測量長度，并剖開觀察結(jié)腸組織，進行CMDI判定，并進行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察。

CMDI按照參考文獻[10]的標準。0分：結(jié)腸無損傷。1分：結(jié)腸輕度水腫但沒有潰瘍。2分：充血且腸黏膜粗糙呈顆粒狀。3分：結(jié)腸黏膜潰瘍形成，直徑0～1 cm。4分：結(jié)腸黏膜潰瘍形成，直徑1～2 cm，但腸管與外周臟器無粘連。5分：潰瘍直徑 1～2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴重。

1.4.2 結(jié)腸組織中LTB4、PGE2、TNF-α、IL-1β含量

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢驗。末次給藥后，留取結(jié)腸組織，勻漿，分離上清，按試劑盒說明書方法檢測LTB4、PGE2、TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.3 結(jié)腸組織中5-LOX和COX-2蛋白含量表達

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測。用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取結(jié)腸組織總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，變性后取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉，2 h后棄封閉液，TBST緩沖液漂洗后加入COX-2(1∶1 000)、5-LOX(1∶1 000)一抗，4 ℃過夜，滴加二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL顯色液曝光拍照，用Image J軟件分析，以目的條帶灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白表達水平。

1.4.4 結(jié)腸組織LTB4、PGE2、5-LOX、COX-2 mRNA的表達

采用聚合酶鏈反應法(PCR)檢測。取各組小鼠結(jié)腸組織，將組織研磨碎，加入1 mL Trizol裂解，分別提取各組總RNA。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以cDNA為模板擴增5-LOX、COX2，以GAPDH為內(nèi)參照。引物序列見表1。PCR擴增條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，40個循環(huán)。

表1 逆轉(zhuǎn)錄PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

實驗中，由于造模原因，模型對照組死亡1只，美沙拉嗪組2只，中藥高劑量組3只，中藥低劑量組2只。

2.1 各組小鼠結(jié)腸長度、CMDI值和組織病理學形態(tài)對比

與正常對照組對比，模型對照組小鼠結(jié)腸長度變短、CMDI值變大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組比，美沙拉嗪組、中藥高劑量組小鼠結(jié)腸長度變長，CMDI值變小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠結(jié)腸長度和CMDI值對比

正常對照組小鼠結(jié)腸黏膜完整均勻，隱窩結(jié)構規(guī)則，無炎癥細胞浸潤。模型對照組小鼠結(jié)腸黏膜層厚薄不均勻，隱窩結(jié)構改變，細胞排列紊亂，部分腺體消失，大量炎癥細胞浸潤，個別區(qū)域出現(xiàn)陳舊性病變，腸腔內(nèi)有纖維素樣病變及細胞壞死碎片。美沙拉嗪組小鼠黏膜層局部出現(xiàn)厚薄不均勻，腺體有炎癥細胞浸潤，腸腔內(nèi)有少量纖維素樣病變，較模型對照組顯著減輕。中藥高、低劑量組小鼠結(jié)腸黏膜層結(jié)構變化、炎癥浸潤和腸腔病變與模型對照組對比有明顯減輕，以中藥高劑量組減輕更為明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學對比(HE染色)

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量對比

與正常對照組對比，模型對照組PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，美沙拉嗪組、中藥高劑量組PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量降低(P<0.01);中藥低劑量組雖降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量對比

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織中5-LOX和COX2蛋白表達對比

與正常對照組對比,模型對照組小鼠結(jié)腸組織中5-LOX和COX-2表達水平升高(P<0.01)；與模型對照組對比，各給藥組小鼠結(jié)腸組織中5-LOX和COX-2表達水平降低(P<0.01)。見表4、圖2。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.美沙拉嗪組；D.中藥高劑量組；E.中藥低劑量組

表4 各組小鼠結(jié)腸組織中5-LOX和COX-2蛋白表達對比

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織中5-LOX和COX-2 mRNA表達對比

與正常對照組比較,模型對照組小鼠結(jié)腸組織中5-LOX和COX-2 mRNA表達水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，各給藥組小鼠結(jié)腸組織中5-LOX和COX-2 mRNA表達水平降低(P<0.01)，見表5。

表5 各組小鼠結(jié)腸組織中5-LOX和COX-2 mRNA表達對比

3 討 論

目前，潰瘍性結(jié)腸炎的治療藥物有水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和生物制劑等。美沙拉嗪是臨床治療輕中度UC的常用藥，可以抑制前列腺素和白三烯的釋放，抑制炎癥反應的發(fā)生，減少腸黏膜損傷[11]，但部分患者易出現(xiàn)耐藥性。因此，尋找毒副作用小的天然藥物具有重要意義。以DSS制備UC模型[12]，誘發(fā)腸道的炎癥反應從而導致腸黏膜損傷和炎性細胞的浸潤，類似于人類UC癥狀及組織學改變，是目前研究 UC 病因病機及藥物治療的最常用的造模方法[13-14]。

中醫(yī)學認為，該病多因外感時邪、飲食不節(jié)、情志內(nèi)傷、素體脾腎不足所致,病位在大腸,溫熱蘊腸、氣滯絡瘀為基本病機，脾虛失健為主要發(fā)病基礎，飲食不調(diào)和情志內(nèi)傷是主要發(fā)病誘因[15]。健脾斂瘡方中葛根為君藥，甘辛而涼，入脾胃經(jīng)，既能解表退熱又能升發(fā)脾胃清陽之氣而治下利。黃連、黃芩為臣藥，苦寒，清熱燥濕，厚腸止痢。太子參益氣健脾滲濕，白扁豆、山藥健脾益氣兼能止瀉；砂仁、木香醒脾和胃，行氣化滯；烏藥辛溫，行氣止痛，溫腎散寒；山楂炭性微溫，味酸甘，入脾、胃、肝經(jīng)，有消食健胃、活血化瘀、收斂止痢的功能；車前子性味甘寒，入腎、膀胱、肝、肺經(jīng)，有利水通淋、滲濕止瀉的作用。以上諸藥共為佐藥。甘草片和大棗共用，健脾和中，調(diào)和諸藥，為使藥。全方清濕熱，補中氣，滲濕濁，行氣滯，使脾氣健運、濕邪得去，諸癥自除。研究[16]表明，治療UC的藥物主要以補益藥和清熱藥為主，其中木香、黃連、甘草片等是UC治療用藥網(wǎng)絡中的核心。本研究首次基于AA通路研究健脾斂瘡方治療UC的機制，以期為UC患者的治療提供理論依據(jù)。

結(jié)腸長度及組織病理學改變是UC研究中衡量結(jié)腸損傷的重要指標，可評價藥物對 UC 小鼠結(jié)腸組織炎癥及損傷的治療效果。炎癥是UC的中心發(fā)病機制，涉及各種細胞因子[17]。TNF-α是啟動UC發(fā)病的主要的炎性細胞因子，參與并促進腸黏膜的炎癥反應，故被認為是UC發(fā)病的禍首因子[18]；此外，其還可加重炎癥反應[19]。IL-1家族有IL-1α、IL-1β和IL-1受體拮抗劑，其中IL-1β是促炎作用最強的細胞因子。正常情況下，IL-1受體拮抗劑可以阻斷IL-1的促炎作用，但UC患者體內(nèi)的IL-1受體拮抗劑和IL-1β嚴重失衡，IL-1β水平增高，加重了腸黏膜的炎癥反應[20]，從而引起一系列的病理改變導致UC的形成[21]。本研究結(jié)果顯示，UC發(fā)生時小鼠結(jié)腸長度縮短，CMDI值增大，血清中TNF-α、IL-1β含量升高。給予藥物處理后，美沙拉嗪組和中藥高劑量組小鼠的結(jié)腸長度變長、CMDI值變小，血清TNF-α、IL-1β水平降低，結(jié)腸的組織病理損傷得到顯著改善。此說明健脾斂瘡方可以增加UC小鼠的抗炎能力。

AA是一種存在于細胞膜中的多不飽和脂肪酸，是合成促炎介質(zhì)的重要前體，與炎癥[22]、脂質(zhì)過氧化和鐵死亡[23]等有密切聯(lián)系。研究顯示，抑制AA代謝對UC具有明顯治療作用[24]。環(huán)氧合酶(COX)和脂氧化酶(LOX)是AA進一步代謝為炎癥介質(zhì)的主要途徑，LOX可將AA代謝為白三烯等促炎介質(zhì)，其中LTB4不僅可激活白細胞產(chǎn)生趨化作用，還可通過釋放內(nèi)含髓過氧化酶的溶酶體酶產(chǎn)生過氧化物陰離子[25]。在COX途徑中，AA被COX催化為具有多種生物活性的前列腺素E，而前列腺素E在調(diào)節(jié)免疫細胞分化及促進細胞因子表達過程中均具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，給予藥物干預后，UC小鼠結(jié)腸組織中5-LOX和COX-2蛋白和mRNA表達水平降低，血清中炎癥代謝物PGE2、LTB4含量降低，提示健脾斂瘡方可能通過抑制AA代謝通路發(fā)揮抗炎的保護作用。

綜上所述，健脾斂瘡方能夠抵抗質(zhì)量分數(shù)40 g/L DSS誘導的UC，保護結(jié)腸損傷，其具體作用機制可能與抑制AA代謝通路發(fā)揮抗炎的保護作用有關。本研究證實了AA代謝通路在健脾斂瘡方對UC作用機制中的作用，AA代謝物與鐵死亡相關，UC是否與鐵死亡相關，需要進一步深入的研究。