烏藥成分異烏藥內(nèi)酯抗H.pylori及其抗菌譜的篩選

覃春，徐佳音，王雪，管愛星，廖麗娟，黃永毅，黃贊松

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院耐藥微生物感染防治研究中心，廣西 百色 533000)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種可定植于人胃黏膜上皮細胞的革蘭陰性、微需氧螺旋桿菌，是導致胃部疾病輕、中、重疾病的主要原因[1]。世界超過50%的人口胃內(nèi)定植有H.pylori，美國將H.pylori明確歸為致癌物。治療并根除H.pylori已成為治療消化性潰瘍及預防胃癌發(fā)生的重要手段。由于抗生素的廣泛使用引起的細菌耐藥，導致H.pylori的根除率逐年下降，耐藥率隨之上升，發(fā)掘新的抗H.pylori藥物非常必要[2]。隨著中藥的不斷發(fā)掘，其抗菌作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。烏藥[Linderaaggregata(Sims)Kosterm]屬樟科植物，其干燥后的塊根是常用的行氣止痛藥物，可治療胸腹脹痛、產(chǎn)后腹痛、寒氣郁滯、痛經(jīng)、頭痛、尿頻、遺尿等癥狀。烏藥中主要含有揮發(fā)油、異喹啉生物堿、呋喃倍半萜及其內(nèi)酯、黃酮類等成分。異烏藥內(nèi)酯，又名異烏藥醚內(nèi)酯，屬于烏藥主要成分中呋喃倍半萜內(nèi)酯化合物的一種[3]。研究顯示，異烏藥內(nèi)酯在卵巢癌、乳腺癌及肺癌等多種腫瘤中具有抑制其增殖、轉移或促進凋亡的作用[4-7]。近幾年，其抗炎作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，在酒精性肝損傷或小鼠炎癥模型中均發(fā)現(xiàn)其抗炎作用[8-10]。另有研究表明異烏藥內(nèi)酯在肝臟糖代謝中也起到關鍵作用[11]。但異烏藥內(nèi)酯在抗菌方面鮮有研究，特別是對H.pylori的抗菌作用很少見報道。因此，本研究針對異烏藥內(nèi)酯對H.pylori及非H.pylori菌株的抑制作用展開研究，篩選其抗菌譜，以期探究其抗菌作用，并為后期研發(fā)先導藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 異烏藥內(nèi)酯(CAS號：957-66-4)購于成都瑞芬思生物科技有限公司，BactoTM Brain Heart infusion(BHI)培養(yǎng)基、哥倫Columbia blood Agar base(G)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、標準小牛血清均購于南京晶格化學科技有限公司，H.pylori標準菌株(26695、NSH57、MSD132、G27)由南京醫(yī)科大學畢洪凱實驗室贈送，H.pylori臨床分離菌株(HPBS001-HPBS016)為本實驗室分離獲得。非Hp菌株：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌、白色念珠菌、新生隱球菌、奇異變形桿菌、熱帶假絲酵母、空腸彎曲菌、枯草芽孢桿菌、摩氏摩根菌、溶血葡萄球菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、醋桿菌、大腸桿菌、彎曲乳桿菌、釀酒酵母、脆弱擬桿菌、長雙歧桿菌、霍氏腸桿菌均購自廣東微生物保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 質譜分析 化合物異烏藥內(nèi)酯質譜分析由成都瑞芬思公司完成。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 使用含10%小牛血清的哥倫比亞固體培養(yǎng)基或腦心浸液培養(yǎng)基，于37 ℃、5%O2、10% CO2培養(yǎng)箱或搖床中進行培養(yǎng)。

1.2.3 微量稀釋法檢測異烏藥內(nèi)酯對H.pylori菌株最小抑菌濃度(MIC) ①藥物制備：配置異烏藥內(nèi)酯濃度為4 mg/ml。②菌液準備：將對數(shù)期H.pylori菌液調(diào)整濃度OD600為0.3(1.0×108CFU/ml)，稀釋至1.0×107CFU/ml，備用。③96孔板制備：以96孔板A1～A12孔作為藥物濃度最高孔，加入173.6 μl培養(yǎng)基及6.4 μl上述藥物，余下7孔均加入90 μl培養(yǎng)基，從上至下對倍稀釋至第8孔，使藥物濃度從1～8孔濃度分別為128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml。設置培養(yǎng)基空白對照孔、藥物陰性孔、細菌陽性孔。④接種菌液：取上述備用菌液10 μl加至第1～8孔和陽性孔中(工作濃度為1×106CFU/ml)，陰性孔不加菌對照。⑤結果判讀：以培養(yǎng)基空白對照孔、藥物陰性孔無菌生長、細菌陽性孔有菌生長為前提進行結果判讀，以完全抑制細菌生長的最低藥物濃度作為MIC。如果出現(xiàn)單一的跳孔時，應記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度，如果出現(xiàn)多處跳孔，則該次結果作廢。實驗重復3次。

1.2.4 微量稀釋法檢測異烏藥內(nèi)酯對非H.pylori菌株MIC ①藥物制備：配置異烏藥內(nèi)酯濃度為4 mg/ml。②菌液準備：將對數(shù)期菌液調(diào)整濃度細菌OD600為0.3(1×108CFU/ml)，稀釋至1×106CFU/ml，真菌調(diào)整濃度OD600為0.5(5×106CFU/ml)，稀釋至5×103CFU/ml，備用。③96孔板制備：以96孔板A1～A12孔作為藥物濃度最高孔，加入173.6 μl培養(yǎng)基及6.4 μl上述藥物，余下7孔均加入90 μl培養(yǎng)基，從上至下對倍稀釋至第8孔，使藥物濃度從1～8孔濃度分別為128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml。設置培養(yǎng)基空白對照孔、藥物陰性孔、細菌陽性孔。④接種菌液：取上述備用菌液10 μl加至第1～8孔和陽性孔中(細菌工作濃度為1×105CFU/ml，真菌工作濃度為5×102CFU/ml)，陰性孔不加菌對照。⑤結果判讀：以培養(yǎng)基空白對照孔、藥物陰性孔無菌生長、細菌陽性孔有菌生長為前提進行結果判讀，以完全抑制細菌生長的最低藥物濃度作為MIC。如果出現(xiàn)單一的跳孔時，應記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度，如果出現(xiàn)多處跳孔，則該次結果作廢。實驗重復3次。

2 結果

2.1 異烏藥內(nèi)酯的分子結構式及質譜圖 異烏藥內(nèi)酯分子式為C15H16O3，分子結構，如圖1A；異烏藥內(nèi)酯分子量為 244.29，質譜為圖1B，鑒定圖譜由成都瑞芬思生物科技有限公司完成。

2.2 異烏藥內(nèi)酯對H.pylori菌株的抑制作用 對18種不同H.pylori菌株進行MIC檢測，如表1所示，異烏藥內(nèi)酯對敏感、耐藥、甚至多重耐藥H.pylori菌株MIC均在8～16 μg/ml，表明異烏藥內(nèi)酯對H.pylori具有良好的抑制作用，且對不同H.pylori菌株間抑制作用強度相似，菌株耐藥性對其抑制作用無明顯影響。

A.異烏藥內(nèi)酯的分子結構式；B.異烏藥內(nèi)酯的質譜圖

表1 異烏藥內(nèi)酯對不同H.pylori菌株的抑制作用

2.3 異烏藥內(nèi)酯對非H.pylori菌株的抑制作用 為篩選異烏藥內(nèi)酯的抗菌譜，選擇金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、白色念珠菌、新生隱球菌、奇異變形桿菌、熱帶假絲酵母、空腸彎曲菌、枯草芽孢桿菌等20種細菌及真菌進行檢測，見表2。MIC均>128 μg/ml，表明異烏藥內(nèi)酯的對非H.pylori菌株抑制作用不明顯，對H.pylori菌株的抑制作用明顯優(yōu)于以上20種細菌及真菌，可專一作用于H.pylori菌株。

表2 烏藥成分異烏藥內(nèi)酯的對非H.pylori菌株的MIC檢測

3 討論

H.pylori在人類胃內(nèi)普遍定植，并成為威脅全人類健康的明確致癌物，抗生素耐藥性升高對根除造成嚴重影響，發(fā)現(xiàn)新藥物成為迫切需要[12]。中藥是我國傳統(tǒng)的藥材，目前已發(fā)現(xiàn)許多中藥在抗菌領域中起到一定作用，常見于具有清熱解毒功效的中藥，例如黃芩、金銀花、板藍根、連翹等[8]?；改鹊萚13]在針對烏藥的中藥學及其臨床應用進行總結，發(fā)現(xiàn)烏藥具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛及抗炎作用，同時對中樞神經(jīng)、消化系統(tǒng)和預防糖尿病腎病起到有益作用。早在20世紀70年代就發(fā)現(xiàn)烏藥具有抑制金黃色葡萄球菌、甲型溶血鏈球菌、傷寒沙門菌、變形桿菌、大腸埃希菌的作用[13]。后來張琳等[14]發(fā)現(xiàn)烏藥對空腸彎曲菌也起到抑菌作用，但烏藥成分異烏藥內(nèi)酯在抗菌中的研究鮮少見報道。通過本研究發(fā)現(xiàn)，烏藥成分異烏藥內(nèi)酯具有較良好的抗H.pylori作用，其對敏感及耐藥菌株MIC均在8～16 μg/ml之間，但對除H.pylori以外的細菌及真菌抑制作用遠不及對H.pylori的抑制作用，表明異烏藥內(nèi)酯對H.pylori作用具有專一性。除了穿心蓮內(nèi)酯、苦地膽內(nèi)酯、小白菊內(nèi)酯等外，中藥成分內(nèi)酯類抗菌作用的報道比較少[15-17]，而且其作用機制基本不清楚，對細胞膜或生物膜的作用可能性比較大。烏藥成分異烏藥內(nèi)酯特異性作用于H.pylori，這是非常值得探討的問題，應該不單是對細胞膜或生物膜作用，否則其抗菌特異性不會這么高。本文在烏藥中挖掘出異烏藥內(nèi)酯成分能專一抑制H.pylori，不僅對烏藥的抗菌成分添加新認知，且為研發(fā)抗H.pylori的先導藥物提供非常有意義的候選化合物。

綜上所述，異烏藥內(nèi)酯對敏感和耐藥的H.pylori均具有良好的抑制效果，可專一作用于H.pylori，具有較好的研發(fā)前景。