先天性晶狀體脫位一家系致病基因突變篩查

倪淑華 王強 張娟美 房祥杰 趙軍

原發(fā)性晶狀體脫位(ectopia lentis, EL)是由睫狀小帶發(fā)育不良引起的晶狀體異位，可以單獨發(fā)生，也可以以綜合征的方式發(fā)生，如馬方綜合征(Marfan syndrome，MFS)[1，2]。根據(jù)2010年Ghent標準，如果患者的FBN1突變曾被描述為主動脈擴張(Aortic dilatation, AO)，則患有晶狀體脫位的患者可被歸類為MFS[3]。無論是EL還是MFS，F(xiàn)BNl基因均是其主要致病基因[4]。FBNl基因位于15號染色體上，編碼了320 kDa富含半胱氨酸的糖蛋白即原纖維蛋白[5]，后者是構(gòu)成睫狀小帶的主要成分[6]。在FBNl基因中已鑒定出3000多個突變，其中不到20個與單純的EL相關(guān)[7]。為了尋找致病基因的突變位點，我們對一山東省臨沂市的EL家系進行了EL患病狀況調(diào)查、全身檢查和基因篩查，尋找與該家系EL發(fā)病相關(guān)的基因突變位點。研究發(fā)現(xiàn)，該家系所有患者均攜帶有FBNl基因 c.3965A>G(p.D1322G)突變，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

一、患者招募和臨床評估

前瞻性系列病例研究。在臨沂市人民醫(yī)院招募了一個來自山東省臨沂市的三代漢族常染色體顯性遺傳的先天性晶狀體脫位家庭，另選取100名健康志愿者作為正常對照。從家庭成員中收集全面的家族史和病史，特別是心臟病史、心臟彩超以及眼科檢查結(jié)果，包括視力、眼壓、眼軸、裂隙燈顯微鏡和眼底檢查。根據(jù)《赫爾辛基宣言》，每個參與者都提供了知情同意書。該項目遵循赫爾辛基宣言的原則，并獲得臨沂人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的批準。

二、樣本收集和基因組DNA提取

用涂有乙二胺四乙酸的真空管收集每個參與者的靜脈血(5 ml)。通過使用QIAamp DNA血液試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)，根據(jù)制造商的方案從外周血白細胞中提取受試者的基因組DNA。

三、目標基因捕獲和高通量測序

應(yīng)用GenCap液相捕獲目標基因技術(shù)，采用全外顯子檢測(北京邁基諾公司)，捕獲患兒所有基因的編碼外顯子區(qū)域和側(cè)翼區(qū)域。利用Illumina Nextseq 500第二代測序儀捕獲到的區(qū)域進行雙端測序，讀長為150bp。目標區(qū)域測序后，去除測序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)。運用BWA軟件比對到參考基因組上(hg19版本)，對測序深度、均一性、探針特異性等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

四、數(shù)據(jù)篩選和生物信息學(xué)分析

用GATK軟件對這個樣本的比對數(shù)據(jù)進行多態(tài)性位點的檢測，對單核苷酸多態(tài)性( single nucleotidepolymorphisms，SNPs) 和插入缺失突變( InDels)等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，查找SNPs及InDels在千人基因組、ESP6500si、ExAC_ALL、ExAC_EAS及邁基諾內(nèi)部1000正常漢族人群數(shù)據(jù)庫頻率，利用SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++ 等數(shù)據(jù)庫對SNPs及InDels 的致病性進行預(yù)測分析，篩選千人基因組、ESP6500si、ExAC_ALL、ExAC_EAS及邁基諾內(nèi)部1000正常漢族人群數(shù)據(jù)庫中頻率<0.05且預(yù)測結(jié)果均為致病性的位點作為與疾病相關(guān)的位點。

五、Sanger測序驗證

根據(jù)需要測序的DNA片段合成引物，用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法進行擴增，用ABI3730xl測序儀(美國Applied Biosystems公司)以Sanger測序法進行測序，測序結(jié)果與目標區(qū)域捕獲測序后的結(jié)果進行比對。此外，用于聚合酶鏈反應(yīng)的所有引物都是通過引物優(yōu)先5.0設(shè)計的(正向，5′-CCATTGGAACATTCGTCCAG-3′，反向，5′-TACCATGGGAAGTTTGAAGGC-3′)。

結(jié) 果

一、家系資料及遺傳學(xué)特征

圖1為該家系的譜系。該家系為一三代常染色體顯性遺傳家系，13例家系成員中4例患病，1例已逝，患者男女比例為1：1。所有患者均表現(xiàn)為雙眼晶狀體脫位。先證者為1名14歲的女性患者(III-1)，身高1.74 m，雙手指細長，雙眼晶狀體向顳上方脫位(圖2)，伴有長眼軸、高度近視，心臟內(nèi)科檢查無明顯器質(zhì)性病變，骨科 X 光檢查未見脊柱側(cè)彎。II-1患者身高1.91 m，雙手指細長，于13年前行心臟超聲心動圖檢查，提示有主動脈瘤樣擴張和二尖瓣脫垂并行二尖瓣置換術(shù)，于7年前因雙眼晶狀體脫位行雙眼白內(nèi)障超聲乳化和人工晶狀體植入術(shù)，X光檢查有脊柱側(cè)彎。III～2患者10歲，身高1.65 m，雙手指細長，雙眼晶狀體向顳上方脫位，伴有長眼軸、中度近視，心臟內(nèi)科檢查無明顯器質(zhì)性病變，于1年前行骨科X線檢查見脊柱側(cè)彎已行手術(shù)治療。

圖1 先天性晶狀體脫位的家系圖

圖2 先證者的眼前節(jié)照相

二、遺傳學(xué)檢測結(jié)果

高通量測序檢測結(jié)果證明該家系的先證者有一錯義突變，位于FBN1 c.3965A>G(p.D1322G)。Sanger測序證實，這種新的突變僅存在于所有其他受影響的家庭成員中，但不存在于未受影響的成員和正常對照中(圖3)?？梢姡摶蛲蛔兣c疾病表型完全共分離。另外，PolyPhen2和SIFT預(yù)測這種新的CRYBB1變體對CRYBB1的功能具有高度破壞性。不同物種中FBN1氨基酸序列的比對顯示天冬氨酸在1 322位高度保守(圖4)。

圖3 Sanger測序峰圖

圖4 FBN1基因的突變分析

討 論

MFS是一種顯性遺傳性結(jié)締組織疾病，主要臨床特征是長骨過度生長、EL和AO，其中約80%患者會出現(xiàn)EL[8，9]。1991年，Dietz等[10]首次報道了FBNl基因的突變會導(dǎo)致MFS。隨后，1996年建立的Ghent標準強調(diào)了陽性基因發(fā)現(xiàn)的重要性并有助于將MFS與具有類似癥狀的其他疾病區(qū)分開[11]。與1996年的Ghent標準[11]相比，2010年新修訂的Ghent標準[3]加大了AO和EL在MFS診斷中的權(quán)重并再次強調(diào)了FBNl基因檢測是診斷MFS的重要手段。應(yīng)注意的是，EL患者，特別是在年輕時多有典型的FBNl基因突變導(dǎo)致的骨病表現(xiàn)但無心臟病變，這使EL 與 MFS 很難區(qū)別[12]。

本研究采用靶向外顯子測序?qū)ο茸C者進行可能的致病基因的篩查，而后用Sanger測序法在其余家系成員和100位健康人上驗證，得出該晶狀體脫位家系的基因突變位點是位于第33個外顯子的雜合錯義突變，患者均表現(xiàn)為雙眼顳上方晶狀體脫位。僅在家系II代中發(fā)現(xiàn)主動脈瘤樣擴張但未發(fā)現(xiàn)其他患者有 MFS 的心血管表現(xiàn)，從樣本病例數(shù)量上也不能提供有效遺傳連鎖分析證實 FBN1 基因是該患者主動脈瘤樣擴張的致病基因。根據(jù)2010年新修訂的Ghent標準[3]，該家系目前只能診斷為“晶狀體脫位綜合征“(ectopia lentis syndrome，ELS)。Détaint等[13]發(fā)現(xiàn)對于FBN1 基因突變致 MFS的患者，升主動脈擴張的患病率會隨其年齡的增長而升高，建議對 20 歲以前的 EL 患者診斷需長期隨訪后再下定論。因此，需要長期臨床隨訪后才可確診本 EL 家系是否為 MFS。

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，高通量測序已成為遺傳病基因篩查的主流方法。截至2018年3月，HGMD數(shù)據(jù)庫中已有2 000多個FBNl基因的突變位點，其中2/3為錯義突變[14]。FBNl是一個大基因(全長235kb)，定位于15q21.1，包含65個外顯子，編碼一個由五結(jié)構(gòu)域和2 871個氨基酸組成的細胞外蛋白—原纖維蛋白-1[15]。原纖維蛋白-1是一種聚合成微纖維的結(jié)構(gòu)大分子，其中微纖維存在于所有結(jié)締組織中，并組裝成組織特異性結(jié)構(gòu)框架[16]。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，原纖維蛋白蛋白-1是睫狀小帶中最豐富的蛋白質(zhì)[17，18]，在小鼠模型中敲除FBN1顯示小帶破裂[19]。可見，F(xiàn)BNl基因突變會導(dǎo)致晶狀體脫位。另外，該家系患者均有長眼軸、中高度近視的特點，這可能是由于原纖維蛋白—1參與鞏膜組織的構(gòu)成[6]。

本研究在一個晶狀體脫位家族中發(fā)現(xiàn)了一致病的基因突變位點，即FBN1基因外顯子33中的c.3965A>G(p.D1322G),該突變導(dǎo)致第1 322個天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?并通過生物信息學(xué)分析預(yù)測對CRYBA1具有高度破壞性，這與國外的報道[20]相吻合，但Rachel等[20]僅說明其為MFS的致病基因突變位點并未說明相關(guān)的臨床表型。因此，該研究為晶狀體脫位家系的遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷提供了堅實的證據(jù)。