RPE與VEGF-A間的相互作用在年齡相關(guān)性黃斑變性發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展

何廣輝 陳松

年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneration, AMD)是一種多因素誘發(fā)的與年齡相關(guān)的黃斑疾病。早期病變僅表現(xiàn)為玻璃膜疣形成，對患者視功能影響較小。進(jìn)展期病變分為干性和濕性：干性AMD病變特點(diǎn)為緩慢進(jìn)展的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞變性及光感受器細(xì)胞凋亡，最終表現(xiàn)為地圖樣萎縮，患者視力低下；而濕性AMD則以脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)形成為主要病變特征，由于CNV管壁結(jié)構(gòu)不完善常自發(fā)破裂導(dǎo)致引起視網(wǎng)膜下出血，脂質(zhì)沉積及纖維瘢痕形成，破壞RPE細(xì)胞，繼而光感受器細(xì)胞損傷，造成的永久性中心視力喪失[1]。兩種類型AMD的結(jié)局均以RPE結(jié)構(gòu)遭到破環(huán)而告終。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是維持人體血管系統(tǒng)平衡的重要因子[2]，在眼底，VEGF主要由RPE分泌產(chǎn)生，正常量的VEGF對脈絡(luò)膜血管的構(gòu)建及維持穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用，但當(dāng)眼部內(nèi)外環(huán)境遭受刺激，RPE分泌VEGF水平異常時(shí)，眼底病變就會產(chǎn)生[3]。VEGF家族包含5個(gè)亞族：A、B、C、D和胎盤樣生長因子(placenta growth factor，PGF),VEGF-A與眼內(nèi)新生血管生成密切關(guān)聯(lián)[4]。研究表明兩種類型AMD的發(fā)病過程中，VEGF-A水平均表達(dá)異常[5]。本文歸納近年相關(guān)文獻(xiàn)，就RPE與VEGF-A之間的相互關(guān)系，及二者在AMD發(fā)病進(jìn)程中的相互作用進(jìn)行綜述。

一、生理狀態(tài)下的RPE與VEGF-A

1.眼球發(fā)育過程中的RPE與VEGF-A 在胚胎發(fā)育第9周，VEGF-A即開始在胚眼內(nèi)表達(dá)，在此期間，視泡具有多分化潛能，每個(gè)視泡細(xì)胞均表達(dá)相同的轉(zhuǎn)錄因子，使其具有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N眼部細(xì)胞的能力[6]。在眼發(fā)育過程中早期VEGF-A的表達(dá)作用之一是促進(jìn)脈絡(luò)膜發(fā)育，使脈絡(luò)膜在視杯形成時(shí)環(huán)繞在外，此后VEGF-A進(jìn)一步調(diào)節(jié)脈絡(luò)膜血管化過程。視網(wǎng)膜多種細(xì)胞均可以產(chǎn)生VEGF-A，例如節(jié)細(xì)胞和Muller細(xì)胞等，但主要來自于RPE的分泌[7]。在經(jīng)過RPE細(xì)胞去VEGF化處理的鼠模型中，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管不發(fā)育，RPE表現(xiàn)為不連續(xù)的單層結(jié)構(gòu)[8]。在產(chǎn)后第一周，RPE細(xì)胞開始與其周圍散在表達(dá)的VEGF受體(vascular endothelial growth factor recepter，VEGFR)2結(jié)合，光感受器在產(chǎn)后第7周開始形成外層和突觸，而大約在產(chǎn)后第8周，視網(wǎng)膜深層血管復(fù)合體開始發(fā)育[9]。中和RPE細(xì)胞分泌的VEGF-A將導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而在體內(nèi)中和VEGF-A則導(dǎo)致RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體的短暫缺陷，包括液泡化，光感受器外層的喪失及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管窗減少，這證實(shí)了RPE中VEGF-A自分泌的作用及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的旁分泌作用[10]。Byeon等[11]研究證實(shí)通過VEGFR2/PI3K/Akt等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的VEGF自分泌通路增強(qiáng)了氧化應(yīng)激條件下RPE細(xì)胞的存活率。

2.體內(nèi)外VEGF-A抑制后對于RPE的影響 VEGF-A不僅影響RPE細(xì)胞的生存，而且影響RPE功能。體外研究顯示，與貝伐單抗共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞吞噬作用明顯減弱[12]。RPE的微絨毛結(jié)構(gòu)由內(nèi)部密集的肌動(dòng)蛋白束構(gòu)成，并包括EBP50和埃茲蛋白，VEGF-A在維持RPE微絨毛的結(jié)構(gòu)中發(fā)揮了重要作用[13]。先兆子癇的患者由于可溶性VEGFR1的過表達(dá)，顯示出足細(xì)胞埃茲蛋白的減少[14]；與此類似的是，埃茲蛋白去除的鼠模型顯示出RPE頂部微絨毛減少及底部內(nèi)折[15]，上述研究提示我們在VEGF抑制后，光感受器外節(jié)由于微絨毛結(jié)構(gòu)破壞會吞噬作用受到影響。這同樣對于目前應(yīng)用抗VEGF藥物治療AMD起到提示作用，那就是過度的抗VEGF作用會影響光感受器外節(jié)的吞噬作用。

在體內(nèi)，持續(xù)性的VEGF-A表達(dá)下調(diào)后，RPE和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管均具備自我修復(fù)能力。VEGF受體絡(luò)氨酸激酶抑制因子作用導(dǎo)致VEGF-A阻斷時(shí)，血管窗樣結(jié)構(gòu)的自我修復(fù)受到抑制，例如脈絡(luò)膜血管叢和腎臟，只有VEGF-A阻斷被解除，毛細(xì)血管才會重新生長[16]。在全身VEGF抑制狀態(tài)下，局部RPE分泌的VEGF-A增加則對于RPE的再生起到了補(bǔ)償作用。此外，在氧化應(yīng)激條件下，神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)增加會增強(qiáng)RPE生存率，對于RPE的再生也發(fā)揮了一定作用[17]。在VEGF抑制狀態(tài)下，VEGF-A表達(dá)反饋性上調(diào)在鼠類早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變模型中亦可觀察到，在注射抗VEGF藥物后第一天，視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF-A的水平明顯增加[18]。在單獨(dú)及聯(lián)合使用抗血管生成藥物的研究中也觀察到了補(bǔ)償性的VEGF-A增加[19]。在體內(nèi)其他部位，VEGF抑制將導(dǎo)致不同的結(jié)構(gòu)損傷，例如腦部脈絡(luò)叢血管灌注的降低，眼部視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡，以及腎小球內(nèi)皮細(xì)胞增生等[20]。在體外試驗(yàn)中，VEGF抑制條件下并沒有導(dǎo)致細(xì)胞本身反饋性VEGF-A表達(dá)上調(diào)，這可能是外界培養(yǎng)系統(tǒng)沒有完整復(fù)制體內(nèi)生長環(huán)境所致[21]。細(xì)胞本身存在VEGF-A自分泌可以維持自身增殖，如體外培養(yǎng)的腎足細(xì)胞系，隨著細(xì)胞分化，VEGF-A及VEGFR2表達(dá)均有增加, 此外，表達(dá)上調(diào)的VEGF-A使細(xì)胞凋亡率降低了40%，而VEGF抑制后將導(dǎo)致凋亡率提高2倍[22]。在體內(nèi)，VEGF抑制的首要副作用是蛋白尿，常常繼發(fā)于腎小球毛細(xì)血管的損傷,因而對于正常的腎足細(xì)胞及RPE細(xì)胞， VEGF抑制將導(dǎo)致組織損傷及毛細(xì)血管滲漏[23]。所以針對于眼底局灶性的CNV，抗VEGF治療對于局部異常高分泌的VEGF-A具有良好抑制作用，從而使CNV病灶縮小，局部水腫減輕；但對于病灶區(qū)以外的正常RPE的基礎(chǔ)分泌VEGF-A同樣具有抑制作用，這就會為正常RPE細(xì)胞帶來損傷的風(fēng)險(xiǎn)。

二、影響RPE/脈絡(luò)膜分泌VEGF-A的相關(guān)因子及補(bǔ)體

RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體是由RPE，Bruch’s膜及脈絡(luò)膜等高分化組織構(gòu)成，其頂部和基底部的VEGF-A具有不同的功能：頂部分泌的VEGF-A具有神經(jīng)保護(hù)作用，而基底部分泌的VEGF-A具有維護(hù)脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的作用，并且基底部分泌的VEGF-A要高于頂部[24]。

1.PGF與VEGF-A PGF主要是RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體基底部分泌產(chǎn)生，頂部分泌極少。在健康組織中，PGF不會產(chǎn)生任何作用，而當(dāng)缺血狀態(tài)及病理性血管形成時(shí)，PGF則與VEGF-A協(xié)同發(fā)揮作用[25]。迄今為止，PGF的生理作用仍未被完全闡明，其在生理性血管生產(chǎn)成過程中的作用微乎其微，但在脈絡(luò)膜中大量分泌的PIGF則具有重要意義，即提高VEGF-A的效力[26]。因此，PIGF與VEGF-A在維持脈絡(luò)膜穩(wěn)定過程中共同發(fā)揮了作用。

2.轉(zhuǎn)錄因子對于VEGF-A及PIGF分泌的調(diào)節(jié) 在VEGF-A分泌過程中，轉(zhuǎn)錄因子NF-KB和SP-1發(fā)揮了作用。SP-1抑制VEGF-A的作用非常強(qiáng)，這與肺癌細(xì)胞中的研究相吻合[27]。而細(xì)胞因子誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞分泌VEGF-A則不受SP-1調(diào)節(jié)，證實(shí)SP-1僅是基本通路的組成部分而非決定部分[28]。p38蛋白則主要是影響RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體基底部的VEGF-A分泌，其不僅僅在VEGF-A的基礎(chǔ)分泌時(shí)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，在高溫情況下，p38蛋白也能夠促進(jìn)VEGF-A分泌；但對于氧化應(yīng)激狀態(tài)下VEGF-A的高表達(dá)，p38蛋白則未發(fā)揮明確作用[29]。這提示在不同病理狀態(tài)下，相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號通路參與了RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體頂部及基底部的VEGF分泌調(diào)節(jié)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下RPE細(xì)胞通過自我保護(hù)機(jī)制保護(hù)光感受器，而高溫狀態(tài)時(shí)，脈絡(luò)膜循環(huán)則發(fā)生了改變，因此，VEGF的分泌是根據(jù)內(nèi)外刺激不同情況的精密調(diào)節(jié)的[30]。VEGFR-2參與了RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體頂部VEGF-A調(diào)節(jié)，并且只存在于RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體中，通過VEGFR-2參與的頂部VEGF-A分泌調(diào)節(jié)顯示了RPE的自分泌作用，這顯示了RPE對抗氧化應(yīng)激的自我保護(hù)功能[31]。NF-KB和SP-1不僅對VEGF-A起到調(diào)節(jié)作用，而且對于PGF也能進(jìn)行調(diào)節(jié)，在胚胎腎細(xì)胞中，NF-KB對于PGF的表達(dá)起到了明顯調(diào)節(jié)作用[32]。另有研究證實(shí)了RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體基底部PGF的調(diào)節(jié)主要通過VEGFR-2來實(shí)現(xiàn)，但PGF并沒有與VEGFR-2直接捆綁，提示了VEGF-A有可能通過VEGFR-2活化來上調(diào)PGF表達(dá)，這就證實(shí)了PGF和VEGF-A協(xié)同發(fā)揮作用的觀點(diǎn)33]，因此抑制PGF的對于病理性新生血管生成也能起到抑制作用。

3.補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46對于RPE分泌VEGF-A的調(diào)節(jié) 補(bǔ)體系統(tǒng)激活對于促進(jìn)RPE細(xì)胞或是AMD動(dòng)物模型分泌VEGF具有促進(jìn)作用[34]。Vogt等[35]通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在人眼RPE基底部，CD46是唯一的補(bǔ)體激活膜限制性調(diào)節(jié)因子。而盡管CD46 與RPE萎縮之間的關(guān)系仍未能完全闡明，但CD46在人bruch’s膜表面RPE細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)方面起到了關(guān)鍵作用[36]。地圖樣萎縮患者的RPE表達(dá)CD46明顯下降，并且是漸進(jìn)性的[37],因此，CD46是健康RPE表型的重要組成部分，而CD46缺失將導(dǎo)致疾病進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)RPE-CD46表達(dá)改變將逐漸導(dǎo)致視網(wǎng)膜形態(tài)改變，即從健康狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榈貓D樣萎縮，而在疾病早期，也就是RPE細(xì)胞形態(tài)正常時(shí)，就能夠檢測出CD46表達(dá)的變化[37]。這說明在普通粘附機(jī)制作用下，存在由RPE細(xì)胞關(guān)聯(lián)蛋白構(gòu)成的功能單元，來維持RPE的正常形態(tài)而避免增生或遷移。有研究顯示，CD46陰性實(shí)驗(yàn)鼠由于補(bǔ)體抑制不足，VEGF分泌量增加而更容易產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)性CNV，并且經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染的人CD46表達(dá)增加能夠降低補(bǔ)體介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)鼠眼部損傷[38]。這說明在像AMD這類疾病發(fā)展過程中，CD46起到了視網(wǎng)膜保護(hù)作用。

三、RPE, VEGF-A與AMD

1.濕性AMD 在濕性AMD中CNV突破RPE滲透到視網(wǎng)膜下間隙，使RPE屏障被破壞，從而使RPE得功能受損[39]。局部異常分泌增多的VEGF-A不僅僅刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)新生血管生成，它還能起到破壞RPE屏障的作用[40]。研究發(fā)現(xiàn)，在體外用VEGF-A處理單層RPE后，RPE的屏障作用減弱，增加了跨屏障的分子流動(dòng)[41]。人類RPE細(xì)胞除了表達(dá)VEGF-A之外，還表達(dá)VEGF-A受體，包括VEGFR1和VEGFR2。研究顯示VEGF-A不僅在VEGFR1上游通路的激活中起到重要作用，還可以誘導(dǎo)VEGFR2下游通路的激活，VEGF-A可以通過自分泌或旁分泌的途徑激活RPE細(xì)胞VEGFR2的信號通路，總而促進(jìn)nAMD病程不斷進(jìn)展，RPE細(xì)胞不斷損傷[42]。而VEGF-A高分泌的鼠類動(dòng)物模型顯示出隨著年齡增長而逐漸發(fā)展的RPE屏障功能減弱，使得緊密連接處的屏障蛋白細(xì)胞質(zhì)解聚，在此類鼠類模型中，隨著RPE屏障破壞，CNV發(fā)生發(fā)展[43]。因此，在濕性AMD的發(fā)展過程中，VEGF-A水平增高與CNV形成和RPE功能異常息息相關(guān)。

2.干性AMD 干性AMD的特征是伴隨年齡增長的RPE細(xì)胞和Bruch’s膜的結(jié)構(gòu)逐步破壞，最終造成光感受器結(jié)構(gòu)功能異常[44]。干性與濕性AMD雖然臨床特征不同，但研究顯示，兩類AMD可以交叉發(fā)生，干性AMD患者可以發(fā)展為濕性AMD[45]。遺傳學(xué)研究已經(jīng)確定此類進(jìn)展性AMD的遺傳位點(diǎn), 有關(guān)基因組研究分析顯示，干性和濕性AMD都與VEGF-A基因位點(diǎn)有關(guān)[46]。動(dòng)物研究顯示，高VEGF-A表達(dá)的鼠類模型中不僅表現(xiàn)出濕性AMD的機(jī)構(gòu)特征，而且表現(xiàn)干性AMD的結(jié)構(gòu)特征，這些鼠類模型不僅表現(xiàn)出VEGF-A誘導(dǎo)的RPE屏障損傷，CNV形成并延伸到視網(wǎng)膜下，而且表現(xiàn)出年齡相關(guān)的RPE和視網(wǎng)膜萎縮及RPE下的層狀顆粒物沉積[47]。Ablonczy等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在高VEGF-A鼠模型中，RPE屏障破壞要早于視網(wǎng)膜異常及光感受器損傷出現(xiàn)，研究結(jié)果顯示VEGF-A除了導(dǎo)致CNV形成之外，還通過損傷RPE屏障，影響在RPE細(xì)胞和光感受器之間的視黃酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，從而導(dǎo)致光感受器功能異常。由此可見，VEGF-A在干性AMD發(fā)病過程中也發(fā)揮了重要作用。

3.抗VEGF藥物與RPE 抗VEGF藥物已經(jīng)廣泛被用于濕性AMD的治療，并取得了不錯(cuò)的臨床效果[49]。但是研究發(fā)現(xiàn)，在一些病例中長期使用抗VEGF藥物治療，濕性AMD仍然會進(jìn)展，并且，長時(shí)間抗VEGF藥物治療后，黃斑區(qū)會發(fā)生萎縮[50]。正常情況下，RPE分泌合理量的VEGF-A，這對于維持成年人的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)非常重要，而長期的VEGF-A抑制會損傷脈絡(luò)膜毛細(xì)血管，并影響RPE功能，從而導(dǎo)致黃斑萎[51]。抗VEGF藥物對于RPE及黃斑的副作用與高VEGF-A表達(dá)造成RPE功能異常卻可以同時(shí)發(fā)生，長期抗VEGF藥物治療使通過干擾脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的生理VEGF-A分泌而導(dǎo)致黃斑萎縮，而高VEGF表達(dá)則是通過造成RPE屏障破換影響視黃酸代謝導(dǎo)致RPE功能異常[52]。這就為濕性AMD的治療提出了新的問題，頻繁的抗VEGF藥物使用有時(shí)會起到反作用。

四、小結(jié)

多種細(xì)胞因子參與了RPE分泌VEGF-A的調(diào)節(jié)，適量的VEGF表達(dá)對于眼部的結(jié)構(gòu)完整和穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要，而當(dāng)體內(nèi)外環(huán)境因各種刺激受到影響時(shí)，此種平衡遭到破壞，AMD就會應(yīng)運(yùn)而生。目前抗VEGF藥物已廣泛應(yīng)用于濕性AMD的治療，但如何使局部過度表達(dá)的VEGF-A下調(diào)至正常水平并保持穩(wěn)定，而不是使之一味下調(diào)，最終導(dǎo)致RPE功能受損，是我們面臨的新挑戰(zhàn)。未來，如果能開發(fā)新型生物活性制劑選擇性調(diào)整眼內(nèi)VEGF水平，使之高降低升，或許對于濕性乃至干性AMD的治療取得意想不到的成效。