發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

羅 萍 張昊楠 徐建民 胡 冰 王曉萍 李光友 范春節(jié)*

（1. 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局熱帶林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520；2. 南京林業(yè)大學(xué)，南京 210037；3. 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040）

桉樹（spp.）是桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（）的總稱，原產(chǎn)澳大利亞及其附近島嶼。由于桉樹具有速生豐產(chǎn)、材質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性廣等優(yōu)良特性，因此廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是世界四大速生造林樹種之一，也是我國(guó)華南地區(qū)主要造林樹種之一。尾巨桉（×）是尾葉桉（.）與巨桉（.）的雜交種，具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，其樹干通直均勻、輪伐周期短以及出材率高，是我國(guó)桉樹人工林的主栽品種。

近年來，植物基因工程技術(shù)在林木育種中被廣泛應(yīng)用，彌補(bǔ)了常規(guī)育種周期長(zhǎng)、定向改良難以控制、遠(yuǎn)緣雜交或物種間雜交幾乎難以實(shí)現(xiàn)的不足。目前，不同桉樹品種已成功建立了農(nóng)桿菌（）介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，如赤桉（）、藍(lán)桉（）、尾葉桉等。部分研究獲得了與開花、材性、抗性等相關(guān)的轉(zhuǎn)基因株系并進(jìn)行了田間試驗(yàn)。盡管如此，以根癌農(nóng)桿菌（）介導(dǎo)法進(jìn)行桉樹遺傳轉(zhuǎn)化存在著轉(zhuǎn)化效率低、穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)化系統(tǒng)冗長(zhǎng)耗時(shí)等問題，難以建立快速、高效的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，嚴(yán)重影響了桉樹的進(jìn)一步遺傳改良和基因功能鑒定的進(jìn)一步發(fā)展。而發(fā)根農(nóng)桿菌（）介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化可以從外植體組織中快速、高效地誘導(dǎo)出大量的毛狀根。誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因毛狀根可以用來開展體內(nèi)基因功能表征的研究，如亞細(xì)胞定位/雙分子熒光互補(bǔ)以及特定基因的功能鑒定。另外，這種轉(zhuǎn)基因體系也可以與常規(guī)基因工程方法，如過表達(dá)、基因沉默、基因編輯工具CRISPR/Cas9 等技術(shù)相結(jié)合。此外，通過載體優(yōu)化以及激素配比等方法在棉花（）、蒺藜苜蓿（）等植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因毛狀根的不定芽誘導(dǎo)，從獲得的轉(zhuǎn)基因組織中直接再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株，這為發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的應(yīng)用進(jìn)一步拓寬了范圍。

關(guān)于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的桉樹毛狀根轉(zhuǎn)化體系僅少量報(bào)道，且由于不同的桉樹種和無性系遺傳背景不一致，導(dǎo)致遺傳方法也有所差異，而對(duì)于我國(guó)華南地區(qū)廣泛種植的栽培品種尾巨桉的遺傳轉(zhuǎn)化體系國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。因此，建立一個(gè)高效穩(wěn)定的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)一步開展桉樹木質(zhì)素合成、次生代謝產(chǎn)物合成等相關(guān)基因功能的鑒定顯得尤為重要。在本研究中，以華南地區(qū)廣泛種植的尾巨桉優(yōu)良無性系DH3229 為外植體材料，通過篩選外植體和農(nóng)桿菌菌株等重要因素開展毛狀根誘導(dǎo)，以期建立發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化體系，為今后開展桉樹特定基因功能的鑒定和桉樹的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以尾巨桉（×）優(yōu)良無性系DH3229的無菌苗為材料，在添加0.5 mg·L6-芐氨基嘌呤（6-BA）和0.1 mg·Lα-萘乙酸（NAA）的MS 基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)20～25 d，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間16 h·d，光照強(qiáng)度100 μmol·m·s，培養(yǎng)溫度（25±2）℃。分別選取生長(zhǎng)健壯，高度超過2 cm 的芽苗上的葉片和莖段為外植體材料，其中葉片選取完全舒展的葉片，莖段選取莖部節(jié)間，切除兩端腋芽。試驗(yàn)所用材料由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所保存培養(yǎng)。

卡那霉素（Kanamycin，KM）、鏈霉素（Strepto?mycin，Strep）、頭孢噻肟鈉（Cefotaxime sodium，Cef）和Wood Plant Medium（WPM）均購(gòu)自Duchefa 公司，GUS 染色試劑盒購(gòu)自北京華越洋生物技術(shù)有限公司，發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司，植物表達(dá)載體pBI121 為本實(shí)驗(yàn)室保存，該載體含有35 S 啟動(dòng)子，NOS 終止子，基因（卡那霉素抗性基因）和基因（編碼-葡萄糖醛酸苷酶基因）。發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)采用TY培養(yǎng)基（3 g·L酵母提取物+5 g·L蛋白胨+10 μmol·L氯化鈣，pH7.0），懸浮液（WPM+30 g·L蔗糖），共培養(yǎng)基（WPM+30 g·L蔗糖+6 g·L瓊脂），毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基（WPM+30 g·L蔗糖+2.5 mg·L聚乙烯吡咯烷酮PVP10+2 g·L交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮PVPP+0.8 g·L水解酪蛋白+200 mg·LCef+6 g·L瓊脂），懸浮液和培養(yǎng)基pH 值調(diào)整到5.8，然后高溫高壓滅菌備用。

1.2 方法

選取ArA4、Ar1193、K599、MSU440、ArQual 共5 種野生型發(fā)根農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行測(cè)試。取保存的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，劃平板后挑取單菌落，分別接種至加有不同抗生素的TY 液體培養(yǎng)基中（見表1）。在28 ℃，200 r·min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜，4 000×離心10 min 收集菌液，棄上清，加入等體積的懸浮液，待侵染。

表1 發(fā)根農(nóng)桿菌類型及抗性Table 1 A.rhizogenes strain and antibiotics

取培養(yǎng)20～25 d 的增殖苗葉片和莖段為外植體，在外植體表面輕輕劃1～2 道傷口，置于含有農(nóng)桿菌的懸浮液中30 min，每隔5 min 震蕩一次。然后取出侵染后的外植體，使用無菌濾紙吸干表面菌液，放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培3 d，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。隨后將外植體轉(zhuǎn)移到毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在光照時(shí)間為16 h·d，光照強(qiáng)度100 μmol·m·s，以及培養(yǎng)溫度為（25±2）℃的條件下培養(yǎng)2～3 個(gè)星期，統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率，計(jì)算公式如下：

誘導(dǎo)率=產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)量/總外植體數(shù)量×100%

采用電轉(zhuǎn)法將pBI121 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440 的感受態(tài)細(xì)胞中，加入600 μL 無抗生素的TY 培養(yǎng)基，28 ℃恒溫，200 r·min振蕩培養(yǎng)2～3 h，然后4 000×離心1 min 收集菌液，留取100 μL上清輕輕吹打混勻后涂布于附加有50 mg·L卡那霉素及50 mg·L鏈霉素的TY 固體培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單克隆進(jìn)行PCR 鑒定獲得陽(yáng)性克隆，搖菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

將攜帶有質(zhì)粒pBI121 的發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440搖菌培養(yǎng)，待菌液濃度分別為OD=0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 時(shí)對(duì)葉片進(jìn)行侵染，經(jīng)過共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)后，3 個(gè)星期后誘導(dǎo)出毛狀根，然后取出毛狀根進(jìn)行GUS 染色分析。每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20～25 個(gè)外植體。將攜帶有質(zhì)粒pBI121 的發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440 搖菌培養(yǎng)，待菌液濃度分別為OD=0.3 時(shí)分別侵染葉片10、30、50、70、90 min，經(jīng)過共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)后，3個(gè)星期后誘導(dǎo)出毛狀根，然后取出毛狀根進(jìn)行GUS 染色分析。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20～25個(gè)外植體。

在毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別加入100、200、300、400、500 mg·L的Cef，3個(gè)星期后統(tǒng)計(jì)葉片毛狀根誘導(dǎo)率和毛狀根根長(zhǎng)，確定抑菌劑對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的影響。每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20～25個(gè)外植體。在毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別加入0、10、15、20、25、30 mg·L的KM，3 個(gè)星期后統(tǒng)計(jì)葉片毛狀根誘導(dǎo)率和毛狀根根長(zhǎng)，確定合適的篩選濃度。每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20～25 個(gè)外植體。

將獲得的所有毛狀根置于加有5-溴-4-氯-3-吲哚---葡萄糖苷酸（X-gluc）染液的離心管中，37 ℃避光保溫12～24 h，觀察顯色反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)染色率。以野生型菌株MSU440 侵染的毛狀根作為陰性對(duì)照，并計(jì)算陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率，計(jì)算公式如下：

陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率=染上藍(lán)色毛狀根數(shù)量/染色總數(shù)量×100%

選取抗性平板上的毛狀根，采用CTAB法提取毛狀根DNA，利用特異性引物基因和基因確定誘導(dǎo)出來的根是否為毛狀根，使用基因和基因引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)確定報(bào)告基因是否穩(wěn)定整合到毛狀根中（見表2）。

表2 引物列表Table 2 Primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)記錄以及柱狀圖的繪制，采用SPSS 分析軟件進(jìn)行單方差分析（ANOVA）和Duncan 多重比較（=0.05），其中所有百分?jǐn)?shù)要先經(jīng)平方根反正弦化處理再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株和外植體對(duì)桉樹毛狀根誘導(dǎo)的影響

不同的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對(duì)植物毛狀根的誘導(dǎo)能力存在差異。本研究中共選取5 種不同類型的發(fā)根農(nóng)桿菌包括ArA4、Ar1193、K599、MSU440、Ar?Qual（見表1），分別以葉片和莖段為外植體進(jìn)行試驗(yàn)。如圖1所示，不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對(duì)桉樹毛狀根的誘導(dǎo)呈現(xiàn)出明顯的差異，其中ArA4 和MSU440 菌株可以誘導(dǎo)出大量的毛狀根（見圖1：D，E），而K599 幾乎沒有毛狀根。與莖段相比，葉片為外植體材料時(shí)能夠獲得更高的毛狀根誘導(dǎo)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，以葉片為外植體時(shí)MSU440和ArA4 毛狀根誘導(dǎo)率較高分別為81.0% 和79.1%。與葉片略微不同，以莖段為外植體，ArA4誘導(dǎo)率最高，為59.2%，其次是MSU440，誘導(dǎo)率為25.4%（見圖2A）。通過對(duì)毛狀根根長(zhǎng)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Ar1193 誘導(dǎo)的毛狀根平均長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為5.23 cm，其次是MSU440 和ArA4 分別為3.23、3.20 cm（見圖2B）。綜合毛狀根誘導(dǎo)率、毛狀根根長(zhǎng)和形態(tài)的比較分析，在后期的試驗(yàn)中，采用發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440 為侵染菌株，以葉片為受體材料，進(jìn)行進(jìn)一步轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。

圖1 不同發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的毛狀根A～F 分別為對(duì)照、Ar1193、ArQual、ArA4、MSU440、K599，受體材料為葉片；G～L 分別為對(duì)照、Ar1193、ArQual、ArA4、MSU440、K599，受體材料為莖段Fig.1 Hairy roots induced by different A.rhizogenes A?F represent control，Ar1193，ArQual，ArA4，MSU440，K599，respectively，the leaves were used as receptor material；G?L represent control，Ar1193，ArQual，ArA4，MSU440，K599，respectively，the stem segments were used as receptor material

圖2 不同菌株和外植體對(duì)毛狀根的影響Fig.2 Effectsofdifferentstrainsandexplantsonhairyroots

2.2 毛狀根誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

農(nóng)桿菌的菌液濃度在一定的程度上能影響發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染效率。結(jié)果如圖3A～E 所示，菌液濃度顯著影響了毛狀根的誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化率。菌液濃度在OD=0.1～0.9 范圍內(nèi)毛狀根誘導(dǎo)率及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)（見圖4A）。當(dāng)OD為0.3 時(shí)，毛狀根誘導(dǎo)率達(dá)到峰值，為24.6%，顯著高于其他處理；其毛狀根陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率在OD為0.3 時(shí)也達(dá)到了峰值，其陽(yáng)性率為20.5%，與其他處理組也存在著顯著性差異。與MSU440野生型農(nóng)桿菌相比，含有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌其毛狀根誘導(dǎo)率大大下降，這可能與外源基因的插入以及誘導(dǎo)培養(yǎng)基中抗生素的加入有關(guān)。因此，綜合毛狀根誘導(dǎo)率以及陽(yáng)性毛狀根誘導(dǎo)率比較分析，選取OD為0.3為最佳侵染濃度。

同時(shí)開展了不同侵染時(shí)間對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化率的影響研究，結(jié)果如圖3F～J 所示。結(jié)果表明在一定的侵染時(shí)間范圍內(nèi)，毛狀根誘導(dǎo)率和陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)（見圖4B）。當(dāng)侵染時(shí)間為30 min 時(shí)毛狀根誘導(dǎo)率最高，為23.2%，且與其他處理相比存在著顯著的差異性。與毛狀根誘導(dǎo)率相似，對(duì)毛狀根陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)侵染30 min 時(shí)毛狀根陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率也達(dá)到了峰值，為20.2%，且與其他處理相比存在著顯著的差異性。因此，綜合毛狀根誘導(dǎo)率和陽(yáng)性毛狀根誘導(dǎo)率比較分析，發(fā)現(xiàn)侵染30 min 可達(dá)到最佳的遺傳轉(zhuǎn)化效果，選定為最佳侵染時(shí)間。

圖3 菌液濃度和侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)率的影響A～E分別為農(nóng)桿菌菌液吸光值OD600為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9；F～J分別為侵染時(shí)間10、30、50、70、90 minFig.3 Effects of bacterial concentration and infection time on the induction rate of transgenic hairy roots A?E represent the Agrobacterium concentration，which OD600 reaches 0.1，0.3，0.5，0.7 and 0.9 respectively；F?J represent the infection time of 10，30，50，70 and 90 min，respectively

圖4 菌液濃度和侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)率的影響Fig.4 Effects of bacterial concentration and infection time on the induction rate of transgenic hairy roots

2.3 抗生素對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的影響

為了抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)需加入適量的抑菌生長(zhǎng)素，同時(shí)抑菌劑的添加可能會(huì)對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，為了確定抑菌抗生素是否對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)造成影響。本研究中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的Cef 進(jìn)行確定合適的抑菌劑濃度。結(jié)果表明：在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度的Cef 對(duì)尾巨桉葉片毛狀根誘導(dǎo)率和毛狀根根長(zhǎng)的影響差異不顯著（見圖5）。在添加量為200 mg·L時(shí)，培養(yǎng)基中的農(nóng)桿菌在一定時(shí)間范圍內(nèi)基本受到抑制。綜合毛狀根誘導(dǎo)率及表型和經(jīng)濟(jì)效益考慮，確定最適的Cef 抑菌濃度為200 mg·L。

圖5 Cef質(zhì)量濃度對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率（A）和毛狀根根長(zhǎng)（B）的影響Fig.5 Effect of cefotaxime sodium concentration on inducing rate（A）and length of hairy roots（B）

在此基礎(chǔ)上，將桉樹葉片分別接種于含有不同卡那霉素濃度的毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，以確定合適的KM 篩選壓。結(jié)果表明，KM 濃度顯著影響了毛狀根的誘導(dǎo)率和毛狀根根長(zhǎng)（見圖6）。與對(duì)照相比，隨著卡那霉素濃度增加，毛狀根生長(zhǎng)明顯受到抑制，且毛狀根長(zhǎng)度明顯變短，當(dāng)濃度為20 mg·L時(shí)，毛狀根生長(zhǎng)完全被抑制。因此，20 mg·L卡那霉素濃度為篩選轉(zhuǎn)基因毛狀根的最適濃度。

圖6 卡那霉素對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率（A）和毛狀根根長(zhǎng)（B）的影響Fig.6 Effect of kanamycin concentration on inducing rate（A）and length of hairy roots（B）

2.4 轉(zhuǎn)基因毛狀根的獲得與鑒定

在建立起的毛狀根誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，通過抗生素篩選后獲得大量的毛狀根，為進(jìn)一步驗(yàn)證GUS等外源基因是否整合到發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)形成的桉樹毛狀根基因組中，選取卡那霉素抗性平板上生長(zhǎng)的毛狀根，進(jìn)行GUS 組織化學(xué)染色（見圖7A）。另外提取抗性板上的毛狀根基因組DNA，并利用特異性引物PCR（見表2）分別檢測(cè)、、和基因。由圖7B、C 可知，和基因已經(jīng)整合到桉樹毛狀根中。進(jìn)一步采用和基因檢測(cè)表明外源的基因已穩(wěn)定整合到毛狀根的基因組中。經(jīng)卡那霉素篩選后獲得了23.2%的毛狀根誘導(dǎo)率，其中87.1%發(fā)生了顯色反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率為20.2%。

圖7 桉樹毛狀根的誘導(dǎo)過程簡(jiǎn)易圖以及轉(zhuǎn)基因毛狀根的GUS組織化學(xué)染色分析（A）和PCR分子鑒定（B～C）A.1～2 為陰性對(duì)照；3～5 為陽(yáng)性毛狀根；圖B～C 中1，5 為陽(yáng)性對(duì)照，2，6 為陰性對(duì)照（野生型菌株侵染得到的毛狀根），3，7 為ddH2O（陰性對(duì)照），4，8為抗性板上誘導(dǎo)的毛狀根；B.分別檢測(cè)rola，rolb；C.分別檢測(cè)NPTⅡ，GUS Fig.7 Chart of Eucalyptus hairy root and GUS histochemical staining analysis（A）and molecular analysis of hairy roots（B～C）A.1?2 are negative controls；3?5 are positive hairy roots；In figures B and C，1，5 are positive controls，2，6 are negative control（shairy roots infected by wild-type strains），3，7 are ddH2O（negative control），4，8 are hairy roots induced on the resistant plate；B detects rola and rolb genes respective?ly；C detects NPTⅡand GUS genes respectively

3 討論

由于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系具有便利性和高效性，目前在多種植物中開展應(yīng)用，尤其是在缺乏高效穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的非模式物種以及生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化困難的木本植物中，已有不少報(bào)道。例如Meng 等在木豆（）中利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因毛狀根作為試驗(yàn)材料，采用雙分子熒光互補(bǔ)分析驗(yàn)證CBLs 與CIPKs相互作用。Plasencia 等在巨桉中利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4RS 誘導(dǎo)巨桉生成毛狀根對(duì)木質(zhì)素生物合成的基因CCR1進(jìn)行功能分析。由此可見，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為基因功能的鑒定提供了一條新途徑。

發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立受許多因素的影響，包括菌株類型、外植體類型、菌液濃度和侵染時(shí)間等。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物的受傷部位后，會(huì)將其Ri質(zhì)粒的T-DNA 區(qū)的DNA 片段插入并整合至宿主細(xì)胞的基因組，因此，不同Ri質(zhì)粒類型的發(fā)根農(nóng)桿菌具有不同的致根能力。本研究中無論以桉樹葉片還是莖段為外植體時(shí)，黃瓜堿型K599 菌株無法誘導(dǎo)其毛狀根形成，這與Meng等發(fā)現(xiàn)K599廣泛適用于多種植物的結(jié)果有所不同，可能是由于不同物種之間的差異。而另外4種農(nóng)桿堿型菌株均有一定的誘導(dǎo)毛狀根的能力，其中MSU440 誘導(dǎo)毛狀根的能力高于其他3 種農(nóng)桿堿型菌株，且毛狀根生長(zhǎng)粗壯、狀態(tài)較好，是開展尾巨桉發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的首選菌株。肖璇在建立甜橙（）的遺傳轉(zhuǎn)化體系中表明MSU440誘導(dǎo)的毛狀根效果最好，其毛狀根轉(zhuǎn)化效率高達(dá)68.3%。Gharari 等使用MSU440 對(duì)黃芩（）的莖段外植體進(jìn)行注射時(shí)發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)100%，與本研究采用的菌株一致。

外植體類型是毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化過程中的一大重要因素。本研究選用葉片和莖段作為外植體材料，盡管不同農(nóng)桿菌菌株在毛狀根誘導(dǎo)率上存在一定的差異，但是不管使用哪種菌株都是葉片較莖段更為敏感，誘導(dǎo)率較高。與之相似，劉雪羽等在建立發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)光皮樺（）的遺傳轉(zhuǎn)化體系中表明，葉片作為外植體能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，其轉(zhuǎn)化率為36.4%，高于莖段和種子苗下胚軸。賴家業(yè)等在建立的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化體系中發(fā)現(xiàn)，莖段誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)量較高，可再分化出不定芽，并保持較高的分化率。主要原因可能是由于不同品種之間的差異，也有可能是根癌農(nóng)桿菌與發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)外植體的敏感程度不同造成的。

另外菌液濃度和侵染時(shí)間也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。本研究結(jié)果表明在菌液OD為0.3、侵染時(shí)間為30 min，以及葉片為外植體時(shí)毛狀根的誘導(dǎo)率及轉(zhuǎn)化率最高，這與劉思巧在研究發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)銀杏（）毛狀根培養(yǎng)中得出的結(jié)論相似。丁雪在建立銀中楊（×）的遺傳轉(zhuǎn)化體系中也表明最佳侵染時(shí)間為30 min，其轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了57.0%。主要原因可能是菌液濃度過低或侵染時(shí)間過短時(shí)農(nóng)桿菌可能無法大量吸附于外植體細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致外源基因無法整合到植物中。而當(dāng)農(nóng)桿菌菌液濃度過高或侵染時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，大量農(nóng)桿菌附著于外植體表面，共培養(yǎng)過程中農(nóng)桿菌大量繁殖導(dǎo)致后期脫菌困難，引起植物褐化死亡，導(dǎo)致毛狀根誘導(dǎo)率及轉(zhuǎn)化率均降低。

獲得KM 的最適篩選壓是植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中十分關(guān)鍵的步驟，是獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根的重要因素。本試驗(yàn)中以無性系尾巨桉DH3229 的葉片作為外植體，在KM 濃度為20 mg·L時(shí)，毛狀根生長(zhǎng)完全被抑制。這與周利建等在建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的巨尾桉遺傳轉(zhuǎn)化體系過程中的研究結(jié)果相同。根據(jù)其他研究者的試驗(yàn)結(jié)果可知不同品系的桉樹篩選壓大小會(huì)有較大差別。Mullin 等在研究赤桉的報(bào)告中表明，9 mg·L的KM 能抑制未轉(zhuǎn)化外植體再生出植株，10 mg·L的KM能抑制根的生長(zhǎng)。而藍(lán)桉具有較高的KM抗性，愈傷組織在KM濃度75～100 mg·L時(shí)仍然有植株再生。

4 結(jié)論

本研究以尾巨桉優(yōu)良無性系DH3229 為外植體材料，分別優(yōu)化了發(fā)根農(nóng)桿菌菌株、外植體材料以及菌液濃度等因素，并通過GUS 染色分析和PCR 分子檢測(cè)證實(shí)該體系可以穩(wěn)定獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根，其轉(zhuǎn)化效率為20.2%。但是誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化率都有待進(jìn)一步提高，可以從其他因素來進(jìn)一步完善遺傳轉(zhuǎn)化體系，例如酚類物質(zhì)乙酰丁香酮的添加以及基本培養(yǎng)基的選擇等。本研究建立的轉(zhuǎn)基因毛狀根體系為今后尾巨桉優(yōu)良無性系DH3229優(yōu)良基因的挖掘奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，也為后續(xù)利用毛狀根誘導(dǎo)完整的轉(zhuǎn)基因再生植株提供穩(wěn)定的材料。