胚胎滯留-立即二次移植臨床妊娠結(jié)局的回顧性病例匹配研究

李曉芳，師娟子，施文浩，柏海燕

(西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710003)

胚胎移植(ET)是輔助生殖技術(shù)體外受精(IVF)后最關(guān)鍵的步驟。當(dāng)ET結(jié)束時(shí)，若發(fā)現(xiàn)胚胎滯留則需再次移植。胚胎滯留會(huì)令患者沮喪及焦慮，也會(huì)影響移植醫(yī)生的情緒，但胚胎滯留又無法完全避免。腹部B超引導(dǎo)可以改善IVF-ET助孕的臨床妊娠結(jié)局，困難移植發(fā)生率和胚胎滯留率均顯著降低，然而胚胎滯留率仍然可達(dá)0.3%～7.5%[1-3]。目前，導(dǎo)致胚胎滯留的原因尚不明確，可能的影響因素包括移植醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)、移植過程宮腔壓力變化、移植導(dǎo)管被宮頸粘液阻擋或血液污染等[4-5]。由于胚胎滯留在輔助生殖助孕中的發(fā)生率較低，因此，胚胎滯留-立即二次移植臨床結(jié)局的相關(guān)研究較少，并且不同研究間妊娠結(jié)局異質(zhì)性較強(qiáng)。Visser等[6]研究發(fā)現(xiàn)，胚胎滯留-立即二次移植的臨床妊娠率較低，建議胚胎滯留患者可推遲1 d后再行ET以提高臨床妊娠率。Xu等[7]和Alvero等[8]研究發(fā)現(xiàn)，胚胎滯留-立即二次移植的臨床妊娠率顯著低于無胚胎滯留組。然而，Lee等[9]和Oraif等[1]研究發(fā)現(xiàn)，胚胎滯留-立即二次移植對臨床結(jié)局并無顯著影響。由此可見，輔助生殖助孕中胚胎滯留-立即二次移植對臨床結(jié)局的影響仍有爭議。因此，本研究擬通過對胚胎滯留-立即二次移植和無胚胎滯留患者進(jìn)行回顧性病例1∶1匹配對照研究，探討胚胎滯留的發(fā)生率以及胚胎滯留-立即二次移植對IVF-ET臨床結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集2019年1月至2021年6月于我院生殖中心行IVF/ICSI助孕患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)行IVF/ICSI助孕；(2)新鮮移植的周期和凍融胚胎移植(FET)周期；(3)臨床及隨訪資料完整的周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有精神疾病、嚴(yán)重心腦血管疾病等；(2)數(shù)據(jù)缺失以及失訪周期。

共納入28 089個(gè)移植周期。根據(jù)患者是否發(fā)生胚胎滯留進(jìn)行分組，即胚胎滯留組(n=59)及非胚胎滯留組(n=28 030)。兩組患者進(jìn)一步進(jìn)行1∶1病例匹配，匹配因素包括：(1)女性年齡(±1歲)；(2)移植胚胎數(shù)目、類型(囊胚或卵裂期胚胎)以及優(yōu)胚數(shù)目；(3)促排卵方案或FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案；(4)授精方式；(5)不孕年限(±2年)；(6)移植醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)；(7)移植胚胎學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)。以上除了“移植胚胎學(xué)家”因素有部分病例不能完全匹配，其余1～6項(xiàng)匹配因素均為完全匹配。1∶1病例匹配后，胚胎滯留組和非胚胎滯留組各納入59個(gè)周期。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)、穿刺取卵及授精：根據(jù)患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)以及基礎(chǔ)性激素水平等選擇適合的COH方案。動(dòng)態(tài)監(jiān)測卵泡發(fā)育情況及血清激素水平，促排卵一般持續(xù)約10 d左右。當(dāng)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的優(yōu)勢卵泡(直徑≥18 mm)時(shí)，給予HCG誘發(fā)排卵，36 h后行B超引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)。之后行常規(guī)IVF或ICSI授精。

2.胚胎培養(yǎng)、評級：于37℃恒溫、5%CO2、5%O2和90%N2條件下培養(yǎng)胚胎。受精后43～45 h觀察卵裂期胚胎發(fā)育情況，91～120 h觀察囊胚期胚胎并進(jìn)行評級。卵裂期胚胎通過觀察卵裂球數(shù)量、形態(tài)以及胚胎碎片率等進(jìn)行綜合評分。根據(jù)卵裂球數(shù)量分為4個(gè)等級：8～10細(xì)胞胚胎劃分為I級，6～7或>10細(xì)胞被劃分為Ⅱ級，5細(xì)胞被劃分為Ⅲ級，<4細(xì)胞則劃分為Ⅳ級；根據(jù)卵裂球細(xì)胞均勻性分為4個(gè)等級：卵裂球大小均勻且形態(tài)規(guī)則為I級，卵裂球大小略不均勻、形態(tài)略不規(guī)則為Ⅱ級，卵裂球大小不均勻、形態(tài)不規(guī)則為Ⅲ級；卵裂球大小極不均勻、形態(tài)極不規(guī)則為Ⅳ級；根據(jù)細(xì)胞碎片率分為4個(gè)等級：細(xì)胞碎片率<10%的為I級，細(xì)胞碎片率10%～20%的為Ⅱ級，細(xì)胞碎片率20%～30%的為Ⅲ級，細(xì)胞碎片率>30%為Ⅳ級。根據(jù)以上3個(gè)方面進(jìn)行綜合評級，將卵裂期胚胎劃分為I～Ⅳ等級，Ⅳ級為廢棄胚胎，I和Ⅱ級為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅲ級為非優(yōu)質(zhì)胚胎[10]。囊胚評級亦通過囊胚擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量以及滋養(yǎng)外胚層質(zhì)量3個(gè)方面進(jìn)行綜合評價(jià)，其中擴(kuò)張程度3～5級≥BB的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚，其余可用囊胚為非優(yōu)質(zhì)囊胚[11]。

3.胚胎移植術(shù)：移植前，患者需充盈膀胱，在腹部B超引導(dǎo)下進(jìn)行。取膀胱截石位，充分暴露宮頸，用無菌棉簽沾胚胎培養(yǎng)液清洗宮頸，腹部B超引導(dǎo)下置入1根移植外管，將胚胎及20 μl培養(yǎng)基加載至移植內(nèi)管，為了方便移植時(shí)B超可視化，留5 μl左右氣泡(B超下可看到亮點(diǎn))，將內(nèi)管通過外管置入，在子宮底約1 cm左右進(jìn)行移植。移植后用培養(yǎng)基對移植管進(jìn)行沖洗，并置于顯微鏡下觀察沖洗液，若發(fā)現(xiàn)胚胎滯留，則立即進(jìn)行二次移植。二次移植位置同第1次移植，若為部分胚胎滯留，二次移植位置略低于第1次移植位置。

4.ET：若無特殊情況(子宮內(nèi)膜異位癥、未處理的輸卵管積水、宮腔黏連、孕酮升高等)均進(jìn)行新鮮卵裂期胚胎或囊胚移植；若新鮮周期移植未妊娠、全胚冷凍或有凍存胚胎擬生育二胎患者，則進(jìn)行FET。

5.妊娠結(jié)局判斷：移植囊胚后12 d或移植卵裂期胚胎后14 d測血HCG，血HCG≥7 U/L為HCG陽性；孕6周B超下可見宮內(nèi)孕囊為臨床妊娠；HCG陽性患者孕6周未見宮內(nèi)孕囊或臨床妊娠患者孕12周前發(fā)生自然妊娠丟失的為早期流產(chǎn)。

6.觀察指標(biāo)：比較兩組患者的一般資料及臨床資料。一般資料包括：年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH(bFSH)、移植前子宮內(nèi)膜厚度等；臨床資料包括：胚胎種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率及早期流產(chǎn)率。胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%，HCG陽性率=HCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/HCG陽性周期數(shù)×100%。

她天天無所事事，這次無聊耍苦情玩，無端拉上他，這更讓田銘氣憤難平。他平靜地打電話給范青青邀見面，范青青一臉小女友的可愛賢惠，左手提著新鮮出爐的披薩，右手提著大蔥白菜、排酸冷鮮肉，進(jìn)門就嬌俏地喊：“田銘，今天讓你嘗嘗我的手藝哦?！薄昂谩！碧镢懢拐f了一聲好，心想嘗罷手藝再說。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、胚胎滯留發(fā)生基本情況

本研究納入28 089個(gè)移植周期，其中11 987個(gè)周期為新鮮胚胎移植周期，16 102個(gè)周期為FET周期，總胚胎滯留率為0.21%(59/28 089)。新鮮移植周期的胚胎滯留率0.18%(22/11 987)與FET周期的胚胎滯留率0.23%(37/16 102)比較無顯著性差異(P>0.05)；移植D3卵裂期胚胎的胚胎滯留率0.22%(19/8 463)與移植D5/D6囊胚的胚胎滯留率0.20%(40/19 626)比較無顯著性差異(P>0.05)；移植≥2枚胚胎的胚胎滯留率0.35%(27/7 651)顯著高于移植1枚胚胎的胚胎滯留率0.16%(32/20 438)(P<0.05)。本研究中發(fā)現(xiàn)胚胎滯留的患者均立即進(jìn)行第2次移植，僅1例由于第2次移植后仍有胚胎滯留，進(jìn)行了第3次移植。

二、病例1∶1匹配后兩組患者的一般資料比較

根據(jù)匹配因素以1∶1匹配病例后，非胚胎滯留組和胚胎滯留組各納入59個(gè)周期，各組中新鮮移植為22個(gè)周期，F(xiàn)ET為37個(gè)周期。

兩組間平均年齡、BMI、bFSH、不孕年限、內(nèi)膜厚度以及移植周期數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料比較(-±s)

三、病例1∶1匹配后兩組患者的妊娠結(jié)局比較

兩組間胚胎種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率以及早期流產(chǎn)率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者的妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

在過去的幾十年間，關(guān)于胚胎滯留-立即二次移植是否對IVF助孕結(jié)局有不良影響一直存在爭議。因此，本研究嚴(yán)格按照病例1∶1匹配研究，對本中心胚胎滯留-立即二次移植的IVF/ICIS-ET助孕結(jié)局進(jìn)行分析。

本研究共納入28 089個(gè)胚胎移植周期，總胚胎滯留率為0.21%(59/28 089)，胚胎滯留率低于既往報(bào)道[1-2]。目前，胚胎滯留發(fā)生的原因尚不明確，可能的因素包括移植醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)、移植導(dǎo)管被宮頸粘液阻擋或血液污染等原因。既往文獻(xiàn)提示，胚胎移植前去除宮頸管粘液會(huì)縮短插管時(shí)間并可顯著提高臨床妊娠率[12-13]。ET是輔助生殖助孕最后且關(guān)鍵的一步，本中心ET操作一般由3位有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的副主任醫(yī)師以上級別醫(yī)生進(jìn)行，且移植前會(huì)對宮頸粘液進(jìn)行充分清洗，放置胚胎位置在距離宮底1～1.5 cm處，為了避免刺激子宮收縮，盡量輕柔操作。本中心參與ET操作的臨床醫(yī)生以及胚胎學(xué)家評估的胚胎滯留情況基本一致，提示移植醫(yī)生以及胚胎學(xué)家之間的質(zhì)控基本沒有差異。

既往文獻(xiàn)多集中于分析卵裂期胚胎滯留-二次移植對臨床結(jié)局的影響，而對移植囊胚-二次移植的胚胎滯留率及妊娠結(jié)局的研究相對較少。有研究發(fā)現(xiàn)，囊胚透明帶在孵化時(shí)更加脆弱，ET操作可能會(huì)對囊胚造成一定程度的損傷，且D5/D6囊胚相較D3卵裂期胚胎體積更大，擴(kuò)張后密度更低，移植D5/D6囊胚更容易發(fā)生胚胎滯留[9，14]。但本研究結(jié)果顯示，移植D3卵裂期胚胎的胚胎滯留率與移植D5/D6囊胚比較無顯著性差異(0.22% vs. 0.20%，P>0.05)，這與既往幾篇文獻(xiàn)[7，15-16]結(jié)果相符。Yi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，單囊胚移植后無胚胎滯留發(fā)生，而移植2枚囊胚的胚胎滯留率為3.5%，提示移植胚胎數(shù)目越多發(fā)生胚胎滯留的風(fēng)險(xiǎn)越高；我們的研究結(jié)果與之一致，移植≥2枚胚胎的胚胎滯留率顯著高于移植1枚胚胎(0.35% vs. 0.16%，P<0.05)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ET周期的胚胎滯留率略高于新鮮移植周期，但尚無顯著性差異(0.23% vs. 0.18%，P>0.05)，這與Lee等[9]的研究結(jié)果相符。

影響IVF助孕妊娠率的因素，包括女性年齡，移植胚胎數(shù)目、類型以及優(yōu)胚數(shù)目、促排卵方案或FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、授精方式、不孕年限及人為因素(移植醫(yī)生及胚胎專家的經(jīng)驗(yàn))等，本研究為了減少這些可能因素的影響，進(jìn)行了嚴(yán)格的病例1∶1匹配研究。通過嚴(yán)格的病例1∶1匹配后研究發(fā)現(xiàn)，胚胎滯留組的胚胎種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率及早期流產(chǎn)率與非胚胎滯留組比較均無顯著性差異(P>0.05)，這與既往多篇研究[1，9]結(jié)果相符。

由于胚胎滯留事件的特殊性，僅能進(jìn)行回顧性研究分析，本研究是單中心的回顧性研究，存在回顧性研究固有的缺陷和選擇偏倚等問題；此外，本研究未對移植管粘液或血液污染進(jìn)行分析，存在一定局限性。移植導(dǎo)管被粘液/血液污染與否對胚胎滯留發(fā)生的影響目前尚無明確結(jié)論，較早文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，移植導(dǎo)管無粘液/血液污染組的胚胎滯留率與有粘液/血液污染組比較無顯著性差異，且當(dāng)導(dǎo)管無粘液或血液污染時(shí)，胚胎滯留組的臨床結(jié)局與非胚胎滯留組比較無顯著性差異(P>0.05)[17]；但最近有文獻(xiàn)提出，粘液/血液污染可能增加胚胎滯留的發(fā)生，且血液污染可能對妊娠結(jié)局帶來一定負(fù)面影響[18]。移植導(dǎo)管被血液或粘液污染是否導(dǎo)致胚胎滯留并影響妊娠結(jié)局尚需要后續(xù)進(jìn)一步深入探討。

綜上，本研究是目前胚胎滯留相關(guān)研究中納入移植周期數(shù)較多的一項(xiàng)研究，且通過嚴(yán)格的病例1∶1匹配對照研究，結(jié)果顯示胚胎滯留-二次移植對IVF/ICSI-ET的臨床結(jié)局無明顯影響；但胚胎滯留事件可能導(dǎo)致患者產(chǎn)生不良情緒，應(yīng)盡量避免。另外，移植胚胎數(shù)目增多會(huì)增加胚胎滯留的風(fēng)險(xiǎn)，因此臨床工作中仍推薦單胚胎移植，可以同時(shí)降低胚胎滯留和多胎妊娠的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。