人工卵巢的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景

黃嫦嫦，殷偉蔚，金敏，封純*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，杭州 310009；2.杭州市臨平區(qū)第一人民醫(yī)院婦科，杭州 311100)

隨著腫瘤診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，腫瘤患者的生存率明顯提高，但腫瘤治療中的化療和放療可能會(huì)破壞女性卵巢儲(chǔ)備功能，導(dǎo)致不孕不育、更年期癥狀、骨質(zhì)疏松和內(nèi)分泌功能障礙等，從而降低女性的生育力和生活質(zhì)量。目前，胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍是可行的生育力保存方式，但有一些腫瘤患者因病情不允許或青春期前的女性不能進(jìn)行促排卵治療而不能使用該技術(shù)[1]。此外，胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)局限于腫瘤治療后可恢復(fù)生育能力的患者，其并不能改善因卵巢功能減退導(dǎo)致其他副作用的患者的生育需求。為解決上述問(wèn)題，有研究者采用放、化療前凍存卵巢組織，腫瘤治愈后再植入的方法保存生育力。有研究發(fā)現(xiàn)，凍融卵巢組織移植術(shù)后可獲得妊娠或者活產(chǎn)[2]。目前，凍融卵巢組織移植術(shù)的活產(chǎn)率可達(dá)到35%以上[3]。

盡管卵母細(xì)胞沒(méi)有引入腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，但周邊卵巢組織可能被侵犯，如血液淋巴系統(tǒng)及卵巢的惡性腫瘤可能將癌細(xì)胞重新引入體內(nèi)，所以，更安全的方法是構(gòu)建人工卵巢(artificial ovary)。Laronda等[4]通過(guò)3維(3D)打印技術(shù)將明膠制成生物支架，在支架中植入卵泡后分別移植到9只小鼠體內(nèi)，隨后在7個(gè)人工卵巢中發(fā)現(xiàn)了存活的卵泡，且卵泡分泌激素刺激乳汁生成，提示人工卵巢具有生育力保存和維持正常內(nèi)分泌的功能，也證明組織工程學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)的結(jié)合是未來(lái)發(fā)展的可行方案。Pors等[5]通過(guò)去除人卵巢組織中易造成癌細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，制作出“脫細(xì)胞支架”，再將未成熟的人和小鼠卵泡與其整合后移植到雌性小鼠中，發(fā)現(xiàn)大約有25%的人類和小鼠卵泡可以恢復(fù)活性，這標(biāo)志著人類卵泡首次在“脫細(xì)胞支架”上存活下來(lái)。由此推斷，人工卵巢可能解決腫瘤患者的生育問(wèn)題并提高生活質(zhì)量。

一、人工卵巢簡(jiǎn)介

人工卵巢是指在生物材料構(gòu)成的半固體3D骨架結(jié)構(gòu)內(nèi)種植未成熟卵泡、卵巢基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞后形成的復(fù)合物[6-7]。其常用的生物材料包括藻酸鹽、殼聚糖、細(xì)胞外基質(zhì)、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、聚乙二醇(PEG)等[8]。人工卵巢移植入生物體內(nèi)后，未成熟卵泡可發(fā)育成熟并分泌性激素。患者可以選擇冷凍保存卵巢組織或整個(gè)卵巢，需要妊娠時(shí)從解凍的卵巢組織中分離卵泡，放置在配有生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢基質(zhì)細(xì)胞的支架中構(gòu)建人工卵巢。人工卵巢移植成功后，卵母細(xì)胞為后續(xù)的生殖過(guò)程提供配子，顆粒細(xì)胞和卵泡細(xì)胞提供雌性類固醇激素[9]。

二、人工卵巢的制作過(guò)程

1.卵巢組織的獲取及冷凍保存：切除多少卵巢組織主要與未來(lái)的治療計(jì)劃和現(xiàn)有的卵巢容積相關(guān)。由于大多數(shù)卵泡位于卵巢皮質(zhì)中，少量的卵巢皮質(zhì)組織足以進(jìn)行生育力保存，但如果患者喪失生育能力的風(fēng)險(xiǎn)很高，冷凍保留整個(gè)卵巢可以確保獲得最大數(shù)量的原始卵泡，為后續(xù)治療提供更多的機(jī)會(huì)[10]。

目前，用于卵巢組織冷凍的方法有程序化慢速冷凍和玻璃化快速冷凍兩種(表1)。關(guān)于卵巢組織低溫保存的最佳技術(shù)還沒(méi)有達(dá)成共識(shí)，但是，目前已獲得活產(chǎn)的病例都是采用程序化慢速冷凍保存[11]。研究表明，程序化慢速冷凍在原始卵泡保存、卵泡細(xì)胞增殖、血管生成、抗苗勒管激素表達(dá)和脫氧核糖核酸損傷方面均優(yōu)于玻璃化快速冷凍[12]。但就整個(gè)卵巢而言，冷凍過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)、外冰晶的形成，特別是血管內(nèi)冰晶的形成會(huì)破壞器官的結(jié)構(gòu)并損害其功能。冷卻速率也受到冷凍器官尺寸和幾何形狀的限制，冷卻所需的低溫很難在有限時(shí)間內(nèi)均勻地傳遞給所有細(xì)胞，所以，目前還沒(méi)有最有效的冷凍保存方案[13]。至今為止，冷凍小塊卵巢組織以防止卵泡丟失和損傷是比較理想的選擇。

表1 程序化慢速冷凍和玻璃化快速冷凍方法比較

2.卵泡的分離和選擇：目前，機(jī)械法、酶法和機(jī)械/酶結(jié)合法廣泛用于從卵巢組織中分離卵泡。其中，機(jī)械法(手動(dòng)攪拌器或手術(shù)刀)分離卵泡能保持卵泡基底膜的完整性但獲卵率相對(duì)較低。酶法獲卵率較高，但卵泡的基底膜損傷，卵泡發(fā)育欠佳。大多數(shù)原始卵泡分布在卵巢皮層纖維中，將機(jī)械法和酶法結(jié)合消化卵巢皮質(zhì)可獲得較高的獲卵率且獲得的卵泡質(zhì)量高，此法在臨床較為常用[8]。目前，形態(tài)正常和顆粒細(xì)胞層完整的存活卵泡的回收率仍然不盡如人意。研究發(fā)現(xiàn)，用Lymphosep分離液進(jìn)行顆粒細(xì)胞分離，使得獲取卵泡更可行，成本更低[14]。惡性腫瘤患者的卵巢組織行卵泡分離時(shí)需重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題是惡性細(xì)胞可能污染懸浮液。Soares等[15]設(shè)計(jì)了一種洗滌步驟，將分離的卵泡從一個(gè)液滴轉(zhuǎn)移到另一個(gè)液滴，從而將其與周圍細(xì)胞分離，在分離前66%的卵巢組織和消化的卵巢懸浮液中可檢測(cè)到白血病細(xì)胞，分離后所有的卵泡樣本的白血病細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。有研究表明，人工卵巢中移植次級(jí)卵泡的卵泡生存率和生長(zhǎng)率均優(yōu)于移植原始卵泡[16]。

3.卵巢基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞：卵泡的生存和生長(zhǎng)取決于卵泡與周圍卵巢細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的對(duì)話，早期卵泡的發(fā)育是由卵泡和卵巢基質(zhì)的卵巢自分泌/旁分泌調(diào)節(jié)控制的。在原始卵泡激活后，原始卵泡分泌因子從卵巢基質(zhì)招募成纖維細(xì)胞樣前體細(xì)胞或干細(xì)胞并分化成功能細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞的缺乏可能影響卵泡的存活[5]。因此，卵巢基質(zhì)細(xì)胞與人工卵巢的結(jié)合可重建卵泡與周圍基質(zhì)細(xì)胞之間的交互，促進(jìn)卵泡發(fā)育[17]。內(nèi)皮細(xì)胞負(fù)責(zé)卵巢組織的血管重建，運(yùn)輸旁分泌因子、氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及去除代謝廢物，提高移植后的血運(yùn)重建有助于多種細(xì)胞的存活。內(nèi)皮細(xì)胞可以在患者完成化療、放療后從新鮮的卵巢活檢組織中分離出來(lái)，化療并不影響細(xì)胞行為[18]。聯(lián)合使用新鮮卵巢髓質(zhì)組織的基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞與卵泡聯(lián)合移植，可以提高人工卵巢的效率[18-19]。另外，小鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞與早期卵泡的共包埋，有助于顆粒細(xì)胞和卵膜細(xì)胞的功能和存活，促進(jìn)卵泡發(fā)育[20]。

4.人工卵巢的支架：卵泡3D培養(yǎng)采用以生物材料為基礎(chǔ)的支架，對(duì)維持卵泡的球形結(jié)構(gòu)具有重要的作用。生物功能化的3D支架通過(guò)維持3D卵泡結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間相互作用和旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)模擬自然卵巢環(huán)境，誘導(dǎo)卵泡發(fā)育[21]。理想情況下，支架植入后應(yīng)具有生物相容性和可降解性，不影響卵泡的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)，并通過(guò)提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)新生血管形成[22]。從廣泛的生物材料中選擇一種適合人工卵巢的生物材料是具有挑戰(zhàn)性的。卵巢支架成分依賴于卵泡發(fā)育階段和特異性，該材料必須復(fù)制相應(yīng)的功能性卵泡周圍細(xì)胞外基質(zhì)，并尊重卵巢組織的異質(zhì)性，以保證其生物模擬性[23]。在研究了膠原蛋白、纖維蛋白、血漿凝塊、藻酸鹽、殼聚糖水凝膠、脫細(xì)胞化卵細(xì)胞外基質(zhì)等天然聚合物和合成聚合物如PEG后，提示合成材料在降解率和機(jī)械性能方面更穩(wěn)定[17]，而天然聚合物在細(xì)胞粘附、遷移、增值和分化等方面更有優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步通過(guò)天然聚合物與合成聚合物相結(jié)合而獲得混合聚合物水凝膠[24]，相關(guān)研究的具體信息見(jiàn)表2。

表2 人工卵巢基質(zhì)材料及相關(guān)研究

三、人工卵巢的植入及監(jiān)測(cè)

1.人工卵巢移植部位及注意事項(xiàng)：人工卵巢的移植部位包括原位(盆腔、卵巢、腹膜窗)移植和異位(前臂、頸部、直肌)移植[9]。原位移植在輸卵管保持完整及人工卵巢適當(dāng)定位的情況下可以實(shí)現(xiàn)自然妊娠，而異位移植無(wú)法自然妊娠[27]。人工卵巢原位移植為卵泡發(fā)育提供了良好的環(huán)境，有病例報(bào)告證明原位移植是有效的[32]。人工卵巢進(jìn)行異位移植時(shí)，應(yīng)考慮患者的體溫、血壓、旁分泌因素和血液供應(yīng)的差異[33]。異位移植移植過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，重復(fù)移植的成本更低。

人工卵巢移植手術(shù)后面臨的主要問(wèn)題是免疫排斥反應(yīng)和缺血性損傷。人工卵巢支架生物材料的免疫反應(yīng)仍然是一個(gè)值得注意的問(wèn)題，支架設(shè)計(jì)應(yīng)考慮緩解免疫反應(yīng)。移植后機(jī)體血管生成和微循環(huán)灌注的時(shí)效性對(duì)人工卵巢的存活和功能恢復(fù)至關(guān)重要[34]。移植后超聲靶向破壞微泡可增加血管生成，通過(guò)引起毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷造成短暫的炎癥反應(yīng)來(lái)增加血流灌注[35]。圍手術(shù)期使用促紅細(xì)胞生成素可促進(jìn)有效血液運(yùn)輸系統(tǒng)的重建[36]。除此之外，血管生成生物材料、內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、維生素E、促性腺激素、褪黑素的使用可能改善人工卵巢的移植結(jié)局[37-38]。

2.評(píng)估與監(jiān)測(cè)：在進(jìn)行生育力保存手術(shù)之前，可以通過(guò)檢測(cè)血清激素水平、B超評(píng)估卵巢體積、竇卵泡數(shù)及卵巢組織活檢等方式評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能。在解凍和移植卵巢組織后，可通過(guò)形態(tài)學(xué)評(píng)估和免疫組織化學(xué)了解解凍后和移植后的卵泡情況[38]。當(dāng)人工卵巢應(yīng)用于臨床時(shí)，通過(guò)監(jiān)測(cè)C-反應(yīng)蛋白水平、CD4/WBC計(jì)數(shù)評(píng)估移植后的炎癥免疫反應(yīng)，通過(guò)血清激素水平和超聲成像評(píng)估卵泡發(fā)育情況，通過(guò)多光譜光聲層析成像選擇有活力的卵母細(xì)胞[39]。此外，確認(rèn)卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞的遺傳信息在生育力保存過(guò)程中沒(méi)有被改變非常重要，可在移植前、體內(nèi)成熟和誘導(dǎo)后對(duì)卵母細(xì)胞分別進(jìn)行遺傳信息核對(duì)。

四、人工卵巢的應(yīng)用前景

對(duì)于不能移植解凍卵巢組織的腫瘤患者以及卵巢功能衰竭患者，可以通過(guò)移植人工卵巢恢復(fù)生育能力并提高生活質(zhì)量。人工卵巢提供了一個(gè)合適的微環(huán)境來(lái)研究卵巢干細(xì)胞，并評(píng)估它們重啟人類配子發(fā)生的能力，也有助于理解卵泡發(fā)生過(guò)程。且人工卵巢在毒理學(xué)研究中可以為各類藥物臨床試驗(yàn)提供新的試驗(yàn)體，以闡明不同藥物對(duì)生殖的影響。隨著人工卵巢中卵巢細(xì)胞基質(zhì)的制作技術(shù)發(fā)展，該技術(shù)可以擴(kuò)展到制造其他人工器官。

一般患者自身冷凍卵巢組織的卵泡可以成為配子的來(lái)源，而卵巢早衰患者需要采用捐贈(zèng)的卵母細(xì)胞或其他替代來(lái)源，各種來(lái)源的干細(xì)胞也可成為配子重要的儲(chǔ)備。除了胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，還包括兩種在成年哺乳動(dòng)物卵巢表面上皮中發(fā)現(xiàn)的具有高核質(zhì)比的球形干細(xì)胞：即微小胚胎樣干細(xì)胞和卵巢生殖干細(xì)胞，也可作為卵母細(xì)胞的其他潛在來(lái)源[32]。另外，人卵巢卵泡液(human ovarian follicular fluid，HOFF)中含有蛋白質(zhì)、卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟所必需的細(xì)胞外基質(zhì)。上皮細(xì)胞和干細(xì)胞可以從HOFF中分離出來(lái)，其在HOFF中的培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)后，可以觀察到卵母細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，以上結(jié)果證明，從卵泡液中提取的細(xì)胞具有干細(xì)胞特征，這可能有助于再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用和細(xì)胞治療[40]。

五、社會(huì)和生物倫理問(wèn)題

首先，人工卵巢技術(shù)特殊，且其非常重要的特征是疾病風(fēng)險(xiǎn)不僅涉及患者本人，還涉及子代。卵泡體外操作可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳發(fā)生變化，這將直接影響子代健康。此外，惡性疾病常常是遺傳性的，人工卵巢技術(shù)可能將與惡性腫瘤相關(guān)的遺傳變異傳給下一代，人為增加惡性腫瘤患者的占比[41]。其次，如果將人工卵巢的應(yīng)用范圍擴(kuò)展到非腫瘤患者身上，問(wèn)題就會(huì)變得更加復(fù)雜，人工卵巢可能成為因職業(yè)或個(gè)人原因而推遲生育的方法，但也可能成為遺傳操縱工具[32]。除此之外，仍有許多問(wèn)題需要考慮，如人工卵巢技術(shù)是否應(yīng)該有年齡限制？如果患者已經(jīng)有了孩子，是否允許再移植？人工卵巢是否影響患者的身心健康？資源如何合理分配？等等。但不可否認(rèn)的是，人工卵巢技術(shù)的發(fā)展將為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步提供新的思路和方向。

六、小結(jié)

迄今為止，在動(dòng)物研究和人體試驗(yàn)中，人工卵巢可分泌激素并產(chǎn)生卵泡。然而，考慮到其臨床應(yīng)用的遺傳安全性和有效性，還需要優(yōu)化設(shè)計(jì)人工卵巢支架、改良移植技術(shù)以防止術(shù)后缺血，并通過(guò)選擇合理的卵巢組織保存方式及更可靠的卵泡分離方法來(lái)提高卵泡的復(fù)蘇率。人工卵巢不僅為生育力保存帶來(lái)新希望，也為未來(lái)人口老齡化提供了新的生育儲(chǔ)備方式；還可能用于瀕臨滅絕物種的保護(hù)，維持生態(tài)多樣性；同時(shí)也可為再生醫(yī)學(xué)提供新的方向。如果未來(lái)人工卵巢可以實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，可能成為組織和器官工程領(lǐng)域新的突破點(diǎn)。