逍遙散通過PI3K/AKT/mTOR通路調節(jié)mPFC-BLA髓鞘功能改善VaD小鼠焦慮抑郁行為

單楠,譚子虎,2,楊冰,尹茜茜,馬崢玲

(1.湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院,湖北 武漢 430065;2.湖北省中醫(yī)院老年病科,湖北 武漢 430061;3.湖北省第三人民醫(yī)院中醫(yī)科,湖北 武漢 430030)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類型[1]。隨著心腦血管疾病患病率的顯著增加,VaD發(fā)病率也呈明顯上升趨勢[2]。獲得性認知能力下降是癡呆的主要特征,但越來越多的證據表明,神經精神癥狀在VaD中非常普遍,最常見的行為和情緒癥狀是抑郁、冷漠、躁動和易怒[3]。癡呆伴隨的精神行為異常,導致醫(yī)療和社會負擔加重、預后惡化,與認知障礙一起作為兩大核心標準被納入診斷指南[4]。目前對其機制還缺乏足夠清晰全面的闡釋。僅以神經元死亡難以解釋精神癥狀的波動性[5],提示其他病理機制存在的可能。

少突膠質細胞(Oligodendrocyte,OL)和髓鞘異常與精神性疾病發(fā)病密切關聯[6-8]。一些脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化癥等,除運動-感覺功能異常外,也會有部分精神異常癥狀[9]。白質病變和脫髓鞘是VaD的重要病理特征,而VaD患者缺血性白質損傷可以導致腦內功能網絡結構紊亂和功能連接障礙[10]。提示髓鞘受損很可能是VaD合并焦慮抑郁獨立于神經元死亡以外的重要病理基礎。

目前,癡呆伴隨精神行為異常缺乏安全有效的治療方法,非藥物干預在臨床實踐中常難以得到執(zhí)行,而抗精神病藥物的使用反而加劇認知功能惡化[11],增加死亡風險[12]。有研究顯示,使用5-羥色胺再攝取抑制劑類抗抑郁藥舍曲林,12周治愈率僅為33%[13],因此,針對VaD伴隨精神行為異常進行機制研究和藥物開發(fā),顯得尤為迫切。逍遙散(Xiaoyao Powder,XYP)源于宋代《太平惠民和劑局方》,已有臨床研究初步發(fā)現,逍遙散可以改善VaD伴隨的抑郁癥狀,降低康奈爾癡呆抑郁量表評分及中醫(yī)證候積分[14-15]。因此,本研究擬采用VaD合并焦慮抑郁動物模型,深入研究逍遙散對髓鞘結構和功能的影響及其具體作用機制,從而為逍遙散在癡呆伴隨精神行為異常中的應用提供更充分的研究證據。

1 材料

1.1 動物

60只3月齡SPF級雄性C57BL/6小鼠,體質量24～30 g,購于湖北省實驗動物中心,許可證號:SCXK(鄂)2020-0018,飼養(yǎng)于湖北省中醫(yī)院實驗動物中心,溫度(21±3)℃,相對濕度(60±5)%,自由攝食攝水,12 h明暗交替。本實驗獲得湖北省中醫(yī)院倫理委員會批準,倫理審批號:HBZY2020-C47-01。

1.2 藥物

逍遙散劑量參照《方劑學》[16]所載(60 kg成人日用量),由柴胡9 g,當歸9 g,白術9 g,白芍9 g,茯苓9 g,生姜9 g,炙甘草4.5 g,薄荷1.5 g組成,均購于湖北省中醫(yī)院藥劑科,浸泡30 min后,分3次煎煮,過濾合并水煎液,生藥濃度為1 g·mL-1,低劑量逍遙散用超純水稀釋至生藥濃度為0.5 g·mL-1的水煎液，高劑量逍遙散濃縮至生藥濃度為2 g/mL的水煎液，分裝后-20 ℃保存。鹽酸氟西汀膠囊(每粒20 mg,法國Patheon公司,批號:J20170012)購于湖北省中醫(yī)院,氟西汀溶于生理鹽水制成濃度為1 mg·mL-1的溶液。

1.3 試劑

DAPI、BCA試劑盒、ECL顯影液購于上海碧云天生物技術有限公司(批號:C1006、P0012、P0018AM),一抗MAG、MOG、GAPDH購于武漢三鷹生物技術有限公司(批號:14386-1-AP、12690-1-AP、60004-1-Ig);MBP、PI3K、p-PI3K(Tyr458/Tyr199)、AKT、p-AKT(Ser473)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)抗體購于美國Cell Signaling Technology公司(批號:78896、4249、17366、2920、4060、2972、5536);化學二抗羊抗鼠、羊抗兔購于美國Jackson ImmunoResearch公司(批號:115-005-003、111-005-003),熒光二抗驢抗兔AF555購于SouthernBiotech(批號：6441-32)。

1.4 儀器

蛋白電泳及轉印裝置(美國Bio-Rad公司,044BR8277)，超聲破碎儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，XM-650T)，全自動倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司,Observer Z1)，酶標儀(上海科華生物工程股份有限公司，KHB ST-360)，高速冷凍離心機(美國Beckman公司,AllegraX-30R),體視顯微鏡(上海光學儀器廠，PXS-1040)。

2 方法

2.1 雙側頸總動脈狹窄(Bilateral carotid artey stenosis,BCAS)法構建VaD小鼠模型

術前12 h予各組小鼠禁食不禁水,1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,剪開頸部正中皮膚,分離小鼠雙側頸總動脈。在體視顯微鏡下,將微型線圈(直徑0.08 mm,內徑0.18 mm,螺距0.5 mm,全長2.5 mm)以螺旋轉入方式固定于雙側頸總動脈,造成BCAS。2周后進行水迷宮實驗,篩選認知功能障礙小鼠應用于后續(xù)實驗。假手術組只分離頸總動脈,不予彈簧圈置入。

2.2 慢性束縛應激(Chronic restraint stress,CRS)方法

將通過篩選的VaD小鼠給予束縛應激(50 mL離心管管壁均勻開小窗,供小鼠呼吸及散熱,束縛期間禁食禁水),于每日固定時間9:00 am開始,束縛6 h,假手術組只禁食禁水,不予束縛。

2.3 動物分組及給藥

其中10只假手術+無束縛小鼠為對照組,將50只BCAS+CRS造模小鼠隨機分為模型組,氟西汀組以及逍遙散低、中、高劑量組,每組10只,給藥過程中同時繼續(xù)CRS維持。其中逍遙散低、中、高劑量組小鼠給予的生藥劑量分別為5、10、20 g·kg-1·d-1,氟西汀組小鼠按10 mg·kg-1·d-1劑量給予氟西汀溶液，對照組和模型組每日予等量生理鹽水,每日1次,共計4周。

2.4 行為學檢測方法

2.4.1 強迫游泳實驗 強迫游泳實驗測試工具為透明塑料圓筒(20 cm×10 cm),水面高12 cm,溫度(22±3)℃。實驗開始時將小鼠放入水中,測試時間為6 min,視頻記錄整個過程,統計每只小鼠在測試后4 min內的不動時間。

2.4.2 曠場實驗 將小鼠放置在一個50 cm×50 cm×40 cm的白色敞箱中,敞箱底面平均劃分為16個小方格。統計5 min內小鼠在曠場內的運動總距離、曠場中心區(qū)域時間,評估小鼠焦慮狀態(tài)。

2.4.3 高架十字迷宮實驗 將小鼠置于中央區(qū)為5 cm×5 cm,開放臂和閉合臂長為35 cm,距離地面50 cm的高架十字迷宮裝置中。記錄小鼠在高架十字迷宮裝置5 min內進入開放臂和封閉臂的次數，在開放臂和在封閉臂內的停留時間。進入開放臂次數百分比=開放臂進入次數/(開放臂進入次數+封閉臂進入次數)×100%；開放臂停留時間百分比=開放臂停留時間/(開放臂停留時間+封閉臂停留時間)×100%。

2.4.4 糖水偏好實驗 測試前訓練小鼠適應含糖飲水,每籠同時放置2個水瓶,第1個24 h內,2瓶均為1%蔗糖水,隨后的24 h內,1瓶盛1%蔗糖水,另1瓶為純水。正式測試時,首先禁食禁水24 h,再予每只小鼠事先定量好的1瓶1%蔗糖水和1瓶純水,測試期間每6 h更換水瓶位置,24 h后,取2瓶水稱量,計算小鼠糖水偏好率=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

2.5 動物處理及取材

行為學檢測后,每組隨機取4只小鼠,1%戊巴比妥鈉麻醉,4%多聚甲醛心臟灌注后取腦,蔗糖溶液梯度脫水,包埋,冰凍切片后置入防凍液,-20 ℃保存,用于免疫熒光和LFB染色;剩余6只小鼠取新鮮腦組織,取前額葉皮層(Medial prefrontal cortex,mPFC)、基底外側杏仁核(Basolateral amygdala,BLA)裝于不同EP管,-80 ℃保存,用于Western blot實驗。

2.6 免疫熒光染色

取腦片貼于玻片上,待干,組化筆畫圈,0.5%Triton破膜40 min,PBS洗3遍,5%BSA封閉1 h,一抗(MBP 1∶1 000稀釋)4 ℃過夜,棄一抗,PBS洗3遍,二抗(AF555 1∶500稀釋)室溫孵育4 h后,棄二抗,PBS洗3遍,DAPI封片,熒光顯微鏡采集圖像。

2.7 Western blot檢測

分別取適量腦組織加入RIPA裂解液,在超聲下破碎,離心后取上清,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,配平待測。電泳、轉膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗(均按1∶1 000稀釋)4 ℃過夜;PBS洗3遍,二抗室溫孵育2 h(1∶10 000);PBS洗3遍,ECL發(fā)光液使條帶可視化,Image J測條帶灰度值進行分析。

2.8 LFB染色

將冰凍切片貼于明膠包被的玻片,待干后復水2次,然后置于0.1%LFB中,在28 ℃恒溫箱中過夜。次日用95%乙醇去除多余染料、蒸餾水漂洗,再用0.05%碳酸鋰分化,梯度脫水，二甲苯透明后封片,隨后進行圖像采集。

2.9 統計學分析

3 結果

3.1 逍遙散對小鼠焦慮抑郁表型的影響

與對照組相比,模型組小鼠存在明顯抑郁、焦慮行為,表現在曠場實驗中運動總距離、中心區(qū)運動時間,高架十字迷宮中開放臂停留時間百分比、進入次數百分比減少(P<0.01);給予高劑量逍遙散干預后,運動總距離、中心區(qū)運動時間,開放臂停留時間百分比、進入次數百分比增加(P<0.01)。與對照組相比,模型組小鼠表現出不動時間增加(P<0.01),糖水偏好率降低(P<0.01)。中、高劑量逍遙散干預后,模型小鼠糖水偏好率增加(P<0.01),不動時間縮短(P<0.05,P<0.01)。見圖1。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖1 逍遙散對小鼠焦慮抑郁表型的影響Fig.1 Effect of XYP on anxiety and depression phenotype in mice

3.2 逍遙散對模型小鼠mPFC和BLA中髓鞘相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示:與對照組相比,模型組小鼠mPFC和BLA中髓鞘相關蛋白MBP、MAG、MOG均顯著下降(P<0.01)；與模型組比較,逍遙散中、高劑量組mPFC和BLA中髓鞘相關蛋白MBP、MAG、MOG顯著上調(P<0.01)。見圖2。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖2 逍遙散對小鼠mPFC-BLA髓鞘相關蛋白表達的影響Fig.2 Effect of XYP on the expressions of myelin associated-proteins in mPFC and BLA of mice

3.3 逍遙散對模型小鼠mPFC和BLA髓鞘蛋白MBP熒光表達的影響

與對照組相比,模型組小鼠mPFC和BLA中MBP熒光強度明顯降低(P<0.01),結構顯示不清;與模型組比較,逍遙散各劑量組和氟西汀組熒光強度均顯著增加(P<0.05,P<0.01)。見圖3～4。

3.4 逍遙散對模型小鼠胼胝體(Corpus callosum,CC)髓鞘損傷的影響

免疫熒光染色結果顯示:與對照組相比,模型組小鼠CC中MBP熒光強度明顯降低(P<0.01),結構欠清晰,通過藥物干預后,各組小鼠MBP熒光強度有不同程度增加(P<0.01)。LFB染色結果顯示：對照組小鼠CC髓鞘藍染清晰,無脫髓鞘改變;模型組小鼠CC著色變淺,髓鞘纖維排列疏松,提示在模型組小鼠中存在明顯脫髓鞘變化。給予中、高劑量逍遙散和氟西汀干預后,小鼠CC染色程度及髓鞘結構有所恢復。見圖5～6。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖3 逍遙散對mPFC中MBP熒光表達的影響Fig.3 Effect of XYP on the fluorescence expression of MBP protein in mPFC

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖4 逍遙散對BLA中MBP熒光表達的影響Fig.4 Effect of XYP on the fluorescence expression of MBP protein in BLA

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖5 各組小鼠CC中MBP免疫熒光圖及相對熒光強度統計圖Fig.5 Immunofluorescence diagram and relative fluorescence intensity statistical diagram of MBP in CC in each group

圖6 各組小鼠CC LFB染色代表圖Fig.6 Representative diagram of LFB staining in CC in each group

3.5 逍遙散對模型小鼠mPFC和BLA中PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達的影響

Western blot結果顯示:與對照組相比,模型組小鼠mPFC和BLA中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達水平明顯降低(P<0.01);與模型組比較，逍遙散中、高劑量組及氟西汀組小鼠mPFC和BLA核團中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達水平有不同程度增加(P<0.01)。見圖7。

4 討論

本研究通過BCAS模擬慢性腦低灌注,結合CRS模擬VaD常有的行動受限。在我們此前研究中，VaD合并焦慮抑郁動物模型已被證實具有很好的表面效度和建構效度[17]。本研究結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠表現出明顯的焦慮抑郁行為:強迫游泳實驗中小鼠不動時間顯著增加,糖水偏好率降低,在曠場實驗中表現出中心區(qū)活動時間明顯減少,高架十字迷宮實驗表現進入開放臂次數及時間明顯減少。逍遙散干預后模型組小鼠的糖水偏好率以及在曠場實驗中的中心區(qū)時間、高架十字迷宮實驗中進入開放臂次數及時間均顯著增加,強迫游泳實驗中的不動時間減少。以上行為學測試結果表明逍遙散能有效地改善模型組小鼠焦慮抑郁行為表型。

mPFC和BLA是參與抑郁癥和焦慮癥等精神疾病發(fā)病過程的關鍵核團[18]。mPFC與其他大腦區(qū)域的豐富聯系在記憶、認知、決策、社會行為和情緒中起著關鍵作用[19]。BLA被認為是編碼情緒效價并指導行為的關鍵結構,主導焦慮、恐懼及其他負面情緒形成。mPFC通過對BLA的纖維投射形成自上而下的抑制性控制,這一過程需要環(huán)路神經元之間信號傳遞的高度協同[20]。缺血導致的髓鞘受損引起神經電傳導延遲,使空間上離散的神經核團在信息傳遞的時間同步性上出現不協調,以致大腦在執(zhí)行自發(fā)行動時產生預測錯誤,引起行為混亂[21-22]。本研究結果顯示:模型組小鼠mPFC、BLA髓鞘相關蛋白MBP、MAG和MOG表達顯著降低,逍遙散可以部分逆轉這一改變;同時,對mPFC、BLA及大腦重要的神經纖維束CC進行MBP免疫熒光染色和LFB染色,證實逍遙散能減輕髓鞘損傷,可能是其改善模型小鼠精神行為異常的重要作用機制。

注:與對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖7 逍遙散對小鼠mPFC-BLA PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達的影響Fig.7 Effect of XYP on the expression of mPFC and BLA PI3K/Akt/mTOR pathway protein in mice

髓鞘損傷后,機體啟動包括少突膠質前體細胞(OPC)遷移、增殖、分化成新的OL并重新包裹軸突形成髓鞘等一系列復雜過程,以恢復軸突傳導功能。有研究表明PI3K/AKT/mTOR是參與OPC遷移、增殖的重要信號通路[23]。PI3K是由調節(jié)亞基p85和催化亞基p110構成的二聚體,與生長因子受體結合后,可改變AKT蛋白結構使其活化,并以磷酸化作用激活下游mTOR,從而調節(jié)OPC的增殖、分化以及遷移等[24-25]。研究顯示,上調AKT/mTOR信號通路明顯增加小鼠CC髓鞘厚度及腦白質體積[26],而條件性敲除PI3K/AKT上游抑制劑PTEN會導致小鼠中樞系統髓鞘明顯增加[27]。腦慢性低灌注會抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活,使OPC募集及正常分化受阻,導致腦白質損傷加重[28]。通過對逍遙散中136種有效成分進行生信分析及體外驗證顯示,PI3K/AKT信號通路是逍遙散減輕缺血性卒中損傷的主要效應通路[29]。我們檢測了mPFC和BLA神經核團中PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達變化。模型組小鼠p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平明顯降低,而在給予逍遙散干預后,mPFC和BLA神經核團中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達水平顯著增加。提示逍遙散可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,參與調節(jié)mPFC-BLA神經環(huán)路髓鞘的形成,從而改善VaD焦慮抑郁表型。

VaD伴抑郁、焦慮可歸屬于中醫(yī)“郁證”范疇。郁證以氣郁為先,總體雖可概括為虛、郁、瘀三個方面,但在腦血管疾病的病理基礎下,氣郁血滯則精血不能上榮于頭竅,瘀血阻滯于腦脈經絡而致神機失用,則以“氣郁”與“留滯”互為因果,病情更甚。逍遙散由柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、甘草、薄荷、生姜共8味藥物組成,肝脾同調,氣血兼顧,剛柔相濟,疏散有度。針對VaD氣郁血虛、腦竅失養(yǎng)的病機特點,逍遙散疏肝解郁、氣血條達,精血津液之精華上達頭目,充髓養(yǎng)神。逍遙散在長期臨床應用中,其安全性和有效性得到了充分證實。我們的研究結果也表明,逍遙散可能是治療VaD伴精神行為異常更好的選擇。

綜上所述,本研究從神經環(huán)路髓鞘功能角度探討了逍遙散改善VaD伴隨精神行為異常的作用機制,顯示逍遙散可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,促進mPFC-BLA神經環(huán)路髓鞘再形成,增加神經核團間信息整合能力,從而改善VaD小鼠焦慮抑郁表型。在后續(xù)工作中我們將進一步利用光遺傳學調控、在體場電位記錄等工具，針對髓鞘病理在VaD合并焦慮抑郁中角色進行驗證探索和更深入的藥物機制研究,可能為這一臨床棘手難題提供有希望的干預靶點和藥物選擇。