lncRNA PTENP1 通過miR-142-5p/PTEN 分子軸調(diào)控結(jié)直腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制①

凌旭坤 謝文鴻 張 喆 胡 琛 （惠州市中心人民醫(yī)院胃腸外科，惠州 516200）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內(nèi)常見的癌癥，其高侵襲性是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一，患者五年生存率低于10%［1］。因此，研究與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制基因PTEN 的假基因lncRNA PTENP1 參 與 調(diào) 控 多 種 腫 瘤 的 發(fā) 展 進 程［2-4］。PTENP1 位于 9p 13.3，與 PTEN 的 3'UTR 上游區(qū)域存在高度同源性，它可以通過競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）機制結(jié)合PTEN 上游 miRNAs 調(diào)控 PTEN 的表達［3，5］。例如，PTENP1 通過海綿吸附miR-19b 調(diào)控PTEN 的表達，進而抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲［6］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-5p 作為致癌基因在CRC 組織和細胞中高表達，沉默miR-142-5p 顯著抑制CRC 細胞增殖和遷移［7］。同時也有研究表明，PTEN 是miR-142-5p的下游靶基因，miR-142-5p 能夠通過調(diào)控PTEN 發(fā)揮其功能［8］。但 PTENP1 通過 miR-142-5p/PTEN 軸調(diào)控HCT116 細胞增殖、遷移和侵襲的研究尚未有文獻報道。本研究將從細胞水平探討PTENP1/miR-142-5p/PTEN 分子軸調(diào)控HCT116 細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制，為尋找抑制CRC 腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移的手段提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集 2015 年 3 月至 2017 年 8 月手術(shù)切除的CRC組織和配對癌旁組織22例，樣本收集后立刻放入液氮中保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)診斷為CRC，術(shù)前未行任何放化療治療或輔助治療；排除標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)診斷為非CRC。本研究經(jīng)惠州市中心人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑和儀器 人正常腸上皮細胞FHC（貨號：KCB2017068YJ）及 CRC 細胞系 HCT116（貨號：KCB 200706YJ）、SW620（貨號：KCB201198YJ）和SW480（貨號：KCB200848YJ）購自中國科學(xué)院昆明動物所；胎牛血清、RPMI1640 購自Thermo Scientific HyClone 公 司 ；Lipofectamine3000 購 于 Invitrogen 公司；miR-142-5p inhibitor 及 RT-qPCR 引物由北京金唯智生物技術(shù)公司合成；Trizol 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 試劑盒均購自Promaga公司；PTEN及β-actin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國Abcam公司；CCK-8檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人正常腸上皮細胞F4C 和CRC 細胞系，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)。隔天換液1次，細胞融合度達到90%左右進行傳代培養(yǎng)。

以對數(shù)期HCT116細胞為實驗對象，將HCT116細胞傳代至6 孔板，待細胞融合度達到60%~70%時，根據(jù)Lipofectamine3000說明書將pcDNA3.1-PTENP1、miR-142-5p inhibitor、sh-PTENP1、pcDNA3.1-PTEN 及sh-PTEN混合轉(zhuǎn)染至HCT116細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-qPCR 檢 測 PTENP1 和 miR-142-5p 的 表達水平 提取CRC 組織和細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用PIKO Red9 6PCR 擴增儀檢測PTENP1和miR-142-5p 的表達水平；引物序列為PTENP1 F：5′-TCAGAACATGGCATACACCAA-3′，R：5′-TGATGACGTCCGATTTTTCA-3′；miR-142-5p F：5'-GGCCCATAAAGTAGAAAGC-3′，R：5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'。反應(yīng)條件為：95 ℃變性2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40 個循環(huán)。以 U6 為內(nèi)參，用 Piko Real 2.0 軟件計算 Ct 值，采用 2-ΔΔCt方法計算相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測HCT116細胞中PTEN的表達水平 收集各轉(zhuǎn)染組細胞，PBS 洗滌2 次后RIPA裂解液提取細胞總蛋白，Lowry 法進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白條帶。使用電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜封閉后，加入兔抗人PTEN 抗體，4 ℃過夜孵育；次日，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 室溫孵育2 h；化學(xué)發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描。以β-actin 為內(nèi)參，采用Image J 圖像編輯軟件分析條帶灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8 檢測HCT116 細胞增殖活力 取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，使用RPMI1640 培養(yǎng)液制備成單細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度為5×104個/ml。將細胞懸液接種至96 孔板中，200 μl/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后，每孔加入20 μl CCK-8溶液，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后在酶標(biāo)儀上檢測450 nm處光密度（D）值。

1.2.5 Transwell 檢測HCT116 細胞遷移和侵襲能力 用無血清的培養(yǎng)基將4 ℃過夜溶解的Matrigel膠在冰上按1∶7 的比例稀釋。并將25μl Matrigel 膠加入Transwell 小室上室，37 ℃無菌保持過夜，確保Matrigel 膠充分聚合。Transwell 細胞遷移實驗不鋪Matrigel膠。分別收集各組轉(zhuǎn)染細胞，將各組細胞分別加入Transwell 小室上室（1.5×104個/小室），下室中加入650μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)48 h，用棉簽擦凈上室細胞，PBS 清洗后，結(jié)晶紫染色，于倒置相差顯微鏡下（×200）觀察并拍照，隨機觀察5個視野，拍照計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-142-5p 與PTENP1 和PTEN 的靶向關(guān)系 利用生物信息預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測PTENP1 和PTEN 與miR-142-5p 的結(jié)合序列，用 RT-qPCR 擴增 PTENP1 和 PTEN 上兩者的結(jié)合序列，并將該擴增片段插入到pMIR-report 中，構(gòu)建pMIR-report-PTENP1-WT和pMIR-report-PTEN-WT野生質(zhì)粒，再利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點突變，構(gòu)建突變質(zhì)粒pMIR-report-PTENP1-MUT 和pMIR-report-PTEN-MUT 突變型質(zhì)粒。用PTENP1 和PTEN野生質(zhì)粒、PTENP1 和PTEN 突變質(zhì)粒和miR-142-5p mimic分別或同時轉(zhuǎn)染293T細胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測各組熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 組織和細胞系中PTENP1 低表達 采用RT-qPCR 檢測CRC組織和細胞系中PTENP1的表達水平，結(jié)果顯示，CRC組織中PTENP1的表達水平顯著低于癌旁組織（P＜0.001，圖1A）；PTENP1 在CRC 細胞系（HCT116、SW620和SW480）中的表達水平明顯低于正常腸上皮細胞FHC（P＜0.05，P＜0.01，圖1B），且HCT116 細胞在3 株CRC 細胞系中表達水平最低（P＜0.01），故選擇HCT116 細胞進行后續(xù)實驗。由此可知，PTENP1在CRC組織和細胞系中呈低表達。

圖1 CRC組織和HCT116細胞中PTENP1呈低表達Fig.1 Expression of PTENP1 was down-regulated in both CRC tissues and HCT116 cells

2.2 過表達PTENP1 抑制HCT116 細胞增殖、遷移和侵襲 采用RT-qPCR 檢測轉(zhuǎn)染效率發(fā)現(xiàn)，過表達PTENP1 后，HCT116 細胞中 PTENP1 表達水平明顯高于對照組（P＜0.01，圖2A）；CCK-8 檢測轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組HCT116 細胞增殖活力，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTENP1 后HCT116 細胞增殖活力明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01，圖2B）；Transwell 檢測轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組HCT116 細胞遷移和侵襲能力發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達PTENP1顯著下調(diào)HCT116細胞遷移和侵襲能力（P＜0.001 或P＜0.01，圖2C、D）。由此可知，過表達PTENP1 可抑制HCT116 細胞增殖、遷移和侵襲。

圖2 過表達PTENP1 抑制HCT116 細胞增殖、遷移和侵襲（×200）Fig.2 Over-expression of PTENP1 repressed proliferation，migration and invasion of HCT116 cells（×200）

2.3 miR-142-5p 與 PTENP1 和 PTEN 具有靶向關(guān)系 PTENP1 和 PTEN 與 miR-142-5p 的結(jié)合序列，如圖3A所示。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，與對照組相比，將 PTENP1-WT 或 PTEN-WT 與 miR-142-5p mimics 共轉(zhuǎn)293T 細胞后熒光素酶活性明顯下降（P＜0.01，圖 3B）；但將 PTENP1-MUT 和 PTEN-MUT與miR-142-5p mimics 共轉(zhuǎn)293T 細胞后熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。在HCT116 細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTENP1后，RT-qPCR檢測miR-142-5p的表達水平，結(jié)果顯示過表達PTENP1 顯著下調(diào)miR-142-5p 的表達水平（P＜0.05，圖 3C）；同時Western blot結(jié)果顯示，PTEN的表達水平明顯增加（P＜0.001，圖3D）；在HCT116 細胞中轉(zhuǎn)染miR-142-5p inhibitor后，Western blot 結(jié)果顯示，PTEN 的表達水平也明顯增加（P＜0.01，圖3E）。由此說明，miR-142-5p 靶向結(jié)合 PTEN 或 PTENP1 的 3′UTR；PTENP1 可 能與PTEN競爭性結(jié)合miR-142-5p的作用位點。

圖3 miR-142-5p與PTENP1和PTEN具有靶向關(guān)系Fig.3 miR-142-5p has a targeting relationship with PTENP1 and PTEN

2.4 PTENP1 與 PTEN 競爭性結(jié)合 miR-142-5p 抑制HCT116 細胞增殖、遷移和侵襲 采用RT-qPCR 檢測各組的轉(zhuǎn)染效率發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-142-5p inhibitor 顯著下調(diào)HCT116 細胞miR-142-5p的表達水平（P＜0.01，圖4A），但共轉(zhuǎn)染sh-PTENP1+miR-142-5p inhibitor、sh-PTEN+miR-142-5p inhibitor、sh-PTENP1+pcDNA3.1-PTEN時，miR-142-5p的表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CCK-8 檢測各組HCT116 細胞增殖活力發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-142-5p inhibitor 顯著抑制HCT116 細胞增殖活力（P＜0.05，圖 2B）；Transwell 檢測各組 HCT116 細胞遷移和侵襲發(fā)現(xiàn)，沉默miR-142-5p 顯著抑制HCT116細胞遷移和侵襲能力（P＜0.05，圖2C）；而共轉(zhuǎn) sh-PTENP1+miR-142-5p inhibitor、sh-PTEN+miR-142-5p inhibitor、sh-PTENP1+pcDNA3.1-PTEN 能夠下調(diào)敲降miR-142-5p對HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01，圖2D）。結(jié)果表明PTENP1與PTEN 競爭性結(jié)合miR-142-5p，進而抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲。

圖4 PTENP1 與 PTEN 競 爭 性 結(jié) 合 miR-142-5p 抑 制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲（×200）Fig.4 PTENP1 competitively binds to miR-142-5p with PTEN and inhibited proliferation，migration and invasion of HCT116 cells（×200）

3 討論

越來越多的研究證明，lncRNA 在細胞增殖、侵襲和遷移等多種癌癥相關(guān)生物學(xué)異常行為中發(fā)揮重要調(diào)控作用［9-10］。例如，lncRNA CASC2 抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)行為［11］；lncRNA KAT7 在 CRC 組織中呈低表達，具有抑制腫瘤細胞增殖和遷移作用［12］。文獻報道，PTENP1 在子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、食管鱗狀細胞癌等多種癌癥中均能夠抑制癌細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為［13-15］。例如，過表達PTENP1 能夠抑制體外膠質(zhì)瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移［16］；在肝癌中，PTENP1 呈低表達，其可通過 miR-193a-3p/PTEN 通路抑制肝癌細胞遷移和侵襲［4］。本研究發(fā)現(xiàn)PTENP1 在CRC 組織和HCT116 細胞中呈低表達，過表達PTENP1能夠顯著抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲。

研究表明，ceRNAs在細胞癌變和癌癥發(fā)展等多種生物過程中發(fā)揮重要作用［17］。PTENP1 作為PTEN 的假基因，由于其與PTEN 具有高度同源性，被認為是理想的ceRNA，且能夠共享PTEN 上游miRNAs 的作用位點［18］。研究證實，PTENP1 能夠通過PTENP1-miRNAs-PTEN ceRNA 機制調(diào)控PTEN的表達，從而在多種惡性腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制功能［19］。例如，PTENP1 通過海綿吸附 miR-21 調(diào)控PTEN 的表達，抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖［20］。PTENP1 通過海綿吸附 miR-193a-3p 調(diào)控 PTEN 的表達，抑制肝癌細胞遷移和侵襲［4］。另外，研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-5p 在包括CRC 在內(nèi)的多種腫瘤中異常表達［7，21-23］。例如，miR-142-5p 通過 ERK1/2 信號通路靶向PLA2G16，抑制人骨肉瘤細胞增殖，促進其凋亡［24］；miR-142-5p 通過靶向下調(diào) SDHB 促進 CRC 的發(fā)生［21］。此外，大量文獻報道，PTEN 在腫瘤發(fā)展過程中扮演重要角色，例如，過表達YAP1 通過下調(diào)PTEN 誘導(dǎo)乳腺癌細胞生長［25］。同時有研究證實，miR-142-5p 可以通過調(diào)控PTEN 的表達影響腫瘤的發(fā)展［8，26］。本研究發(fā)現(xiàn) PTENP1 與 PTEN 競爭性結(jié)合miR-142-5p 的作用位點；過表達PTENP1 顯著下調(diào)miR-142-5p 的表達水平，且同時上調(diào)PTEN 的表達水平。本實驗證實PTENP1 通過靶向下調(diào)miR-142-5p 對 PTEN 的抑制作用，進而抑制 HCT116 細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，lncRNA PTENP1 可以作為CRC 診斷的分子靶標(biāo)，通過ceRNA機制海綿吸附miR-142-5p，上調(diào)PTEN 的表達水平，進而抑制HCT116 細胞增殖、侵襲和遷移。