平喘方對哮喘小鼠NLRP3炎癥小體信號通路表達的影響①

徐萬超 虞堅爾 薛 征⑤ 樸 香 楊 艷 胡逸中

（上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院兒科，上海 200137）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）簡稱哮喘，是一種以氣道慢性炎癥為特征的臨床常見疾病，主要表現(xiàn)為喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀，影響全世界超過3 億人口，嚴重威脅全球人類的健康［1］。哮喘發(fā)作是由于氣道吸入塵螨、煙霧、病原體、致敏顆粒等物質(zhì)，進而刺激初始T 細胞（na?ve T cell，Tn）向輔助型 T 細胞（T helper cell，Th）2 分化，導致 Th1/Th2 免疫失衡并分泌促炎因子，最終引起氣道炎癥。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體是細胞內(nèi)的免疫復合物，由NLRP3、凋亡相關(guān)點樣蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing a CARD domain，ASC）、前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（pro-caspase-1）三部分構(gòu)成，可識別吸入氣道的多種物質(zhì)引起Th2分化，與哮喘發(fā)病密切相關(guān)［2］。

平喘方是海派中醫(yī)徐氏兒科治療哮喘經(jīng)典方，前期研究發(fā)現(xiàn)平喘方可干預哮喘小鼠樹突狀細胞分化，增加吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO）、T 盒子轉(zhuǎn)錄因子（T-box expressed in T cells，T-bet）表達，減少腫瘤壞死因子配體超家族成員 4［tumor necrosis factor（ligand）superfamily，member 4，TNFSF4］、轉(zhuǎn)錄因子 GATA 結(jié)合蛋白3（transcription factors GATA binding protein-3，GATA-3）表達，調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫平衡，減輕哮喘氣道炎癥［3-4］，故推測平喘方可能對NLRP3 信號通路發(fā)揮干預作用。本研究運用現(xiàn)代分子生物學方法，觀察平喘方干預哮喘模型小鼠NLRP3 炎癥信號通路相關(guān)因子的表達，為中醫(yī)藥臨床治療哮喘提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 5~6 周齡 SPF 級雄性 BALB/c 小鼠共40 只，體質(zhì)量18~22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院動物房，飼養(yǎng)環(huán)境為：室溫24 ℃、濕度50%~70%，12 h 日光燈模擬晝夜更替，各組小鼠可自由飲水與進食。

1.1.2 藥物 中藥材購于上海市藥材公司，平喘方原方組成為炙麻黃6 g、苦杏仁9 g、紫蘇子9 g、萊菔子9 g、桃仁6 g、地龍9 g、花椒目9 g、炙甘草6 g，藥物煎煮時按照1∶1.5∶1.5∶1.5∶1∶1.5∶1.5∶1 的比例組方。中藥平喘方煎煮方法參考李儀奎主編《中藥藥理實驗方法學》［5］，將草藥混合后加13 倍水，頭煎武火煮沸后文火煮30 min，用紗布將藥液濾出，二煎加11 倍水煮沸后文火煮30 min，頭煎二煎混合后濃縮。醋酸地塞米松片產(chǎn)于上海上藥信誼藥廠，國藥準字：HB102079。平喘方濃縮后根據(jù)人每天服藥劑量進行公式換算，計算公式為：dB=dA×KB/KA［設算系數(shù)為K，dA為A種動物的劑量（mg/只），dB 為B 種動物的劑量（mg/只），其中70 kg 人與20 g小鼠的KB/KA=0.002 5）］，計算小鼠每天服藥劑量，經(jīng)計算平喘方灌胃濃度為含生藥量5.33 g/ml。

1.1.3 主要試劑與儀器 卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）（Sigma，貨號：A5503，25 g）；鎂鋁佐劑（Thermo，貨號：77161）；NLRP3抗體（BIOSS，貨號：bs-6655R）；caspase-1抗體（Abcam，貨號：ab138483）；IL-1β ELISA試劑盒（X-Y Biotechnology，貨號：E20533）；IL-18 ELISA 試劑盒（X-Y Biotechnology，貨號：E11385）；Trizol（Invitrogen，貨號：1596-026）；SYBR Green PCR試劑盒（Thermo，貨號：K0223）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，貨號：K1622）；石蠟（上海國藥集團，貨號：69018961）；DAB 濃縮型試劑盒（上海長島生物技術(shù)有限公司，貨號：FL-6001）；蘇木素（BASO，貨號：714094）；伊紅（BASO，貨號：BA4099）。

Real-time PCR 檢測儀（ABI 公司，型號：ABI-7300）；低溫冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，型號：TG-16M）；旋渦振蕩器（青浦瀘西儀器廠，型號：K30）；電動勻漿機（FLUKO，型號：PRO200）；移液器（吉爾森P 型移液，型號：Pipetman）；水浴鍋（Leica，型號：HI1210）；石蠟切片機（徠克公司，型號：SQ2125）；顯微圖像分析系統(tǒng)（NIKON公司，型號：DS-Ri2）；正置顯微鏡（Olympus 公司，型號：CX41）；超聲霧化器（PARI GmbH，型號：PARI BOY N）；霧化箱（自制，40 cm×30 cm×25 cm泡沫箱）。

1.2 方法

1.2.1 哮喘小鼠模型制備 將40 只雄性BALB/c小鼠按1∶3 分為空白對照組（Control）10 只、哮喘模型組（Model）30 只。小鼠適應性喂養(yǎng)3 d 后開始造模，哮喘模型小鼠分別于第1 天、第14 天腹腔注射0.5 ml 致敏液（0.375 ml 生理鹽水+50 mg OVA+0.125 ml鋁鎂佐劑），空白對照組以等量生理鹽水腹腔注射；第21~27天將小鼠置于密閉霧化箱中，模型組小鼠以5%OVA 霧化30 min，空白對照組小鼠以等劑量生理鹽水霧化30 min，1次/d，共7 d。

1.2.2 動物分組及給藥 哮喘小鼠致敏完畢后，將哮喘模型組的30 只小鼠按照《醫(yī)學統(tǒng)計學》［6］中隨機數(shù)字表分為3 組，即哮喘模型（Model）組、地塞米松（DEX）組、平喘方（PCF）組，10 只/組。各組小鼠于當日霧化激發(fā)1 h 后灌胃給藥治療，每只小鼠以0.5 ml（/次·d）灌胃，DEX 組用蒸餾水配制成濃度為0.075 mg/ml的地塞米松溶液，空白組和模型組小鼠以等量蒸餾水灌胃。

1.2.3 檢測指標及方法

1.2.3.1 HE 染色觀察各組小鼠肺組織病理改變情況 處死小鼠后打開小鼠胸腔，用剪刀將小鼠右側(cè)中葉肺剪下，放入提前準備的10%甲醛溶液中以備石蠟包埋做病理染色切片。將由甲醛固定的肺組織放入包埋盒中，分別置于流水及不同濃度的乙醇中脫水，于二甲苯中脫蠟后包埋肺組織。將包埋好的組織蠟塊切至每片4~7μm，脫蠟水化后經(jīng)蘇木精、伊紅染色，樹脂封片，運用光學顯微鏡在200 倍鏡下觀察。

1.2.3.2 免疫組化檢測NLRP3、caspase-1 在肺組織中陽性表達 取石蠟包埋好的肺組織樣本切片置于玻片，經(jīng)脫蠟、水化后，采用檬酸鈉緩沖溶液抗原修復 15 min，而后 PBS 沖洗 3 次，3 min/次。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，然后按照最佳稀釋比例滴加一抗，室溫下孵育1 h 后PBS 沖洗3 次，加入二抗孵育30 min 后，DAB 及蘇木精染色，最終置于二甲苯中透明并封片。顯微鏡拍照后分析相關(guān)部位，并用Image J軟件計算陽性面積。

1.2.3.3 Western blot 檢測肺組織 NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達 取小鼠左側(cè)肺組織，剪成細小的碎片，每20 mg 組織加入150~250 μl 裂解液的比例加入裂解液，待勻漿組織完全裂解后離心取上清，進行蛋白質(zhì)定量及膠的制備。80 V 電泳后進行120 V 轉(zhuǎn)膜，然后用電轉(zhuǎn)緩沖液浸濕，將膠直接置于電轉(zhuǎn)儀的正負極之間。轉(zhuǎn)膜后將膜放入TBST 清洗1 次，再置于麗春紅染色工作液中，室溫下?lián)u動染色5 min，水洗膜直至水變清無色、蛋白條帶清晰后進行封閉及抗原孵育，抗體根據(jù)說明書稀釋。一抗孵育過夜后，TBST洗膜3次，5 min/次，隨后加入HRP 標記的二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h 后配制ECL 發(fā)光液，取ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面暗室避光5 min 后棄顯色液，并蓋上透明紙，將其放入成像系統(tǒng)中成像，調(diào)整感光時間達到理想結(jié)果。以灰度值計算Western blot結(jié)果。

1.2.3.4 實時PCR（real-time PCR）法檢測肺組織中NLRP3、caspase-1 mRNA 表達水平 取小塊待測肺組織，加入裂解液進行裂解，Trizol 試劑提取小鼠不同組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，上機后通過PCR 儀檢測記錄各反應管中產(chǎn)生的熒光信號制作擴增曲線，并通過記錄擴增次數(shù)記錄循環(huán)數(shù)，最終得到每個樣本的Ct值，使用2-ΔCt測出各組的組織中待測基因表達水平，并附引物序列（表1）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3.5 ELISA 檢測肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中 IL-1β、IL-18 表達水平 小鼠脫頸椎處死后，打開胸腔，剪開主氣管，用線結(jié)扎右側(cè)支氣管，將1 ml 注射器針頭與剪斷的主氣管相連，將1 ml生理鹽水打入小鼠左肺灌洗2~3次，最終取得灌洗液約0.6 ml，放入凍存管中凍存待測。常溫下解凍后離心取上清，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作，按照濃度梯度將每孔加入標準品，并按說明書將肺泡灌洗液稀釋后加入其他孔內(nèi)，37 ℃溫育30 min，配液洗滌、加酶等操作后，加入A、B 兩種顯色劑各50μl 顯色30 min，在450 nm 處測吸光度值，而后根據(jù)繪制的標準曲線計算肺泡灌洗液中IL-1β、IL-18的實際濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以表示，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性及方差齊性則采用單因素方差分析，并用LSD、SNK法進行組間兩兩比較；若不符合正態(tài)性及方差齊性數(shù)據(jù)則采用秩和檢驗比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 造模及給藥干預后各組小鼠一般行為情況模型組小鼠造模后易激惹躁動，上肢搔抓口鼻，腹肌抽動，毛發(fā)豎立，霧化期間二便明顯增多；與哮喘模型組相比，地塞米松組及平喘方組小鼠精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好，呼吸較模型組平穩(wěn)，毛發(fā)平順，反應靈敏，二便逐漸恢復正常。

2.2 HE 染色觀察各組小鼠肺組織形態(tài)學結(jié)果空白對照組小鼠氣管、支氣管黏膜上皮完整，管腔通暢無滲出，管壁肌層及管周組織為無炎癥細胞浸潤，肺泡及周圍組織結(jié)構(gòu)完好，無紅細胞及炎癥物質(zhì)滲出。哮喘模型組小鼠支氣管周圍可見充血，伴有大量炎癥細胞浸潤，氣道管腔狹窄，基底膜增厚，氣道上皮細胞遭到破壞，肺泡組織可見炎癥細胞浸潤及炎癥物質(zhì)滲出。與哮喘模型組相比，DEX 組和PCF組均可有效改善氣道及肺泡組織炎癥性物質(zhì)滲出及炎癥細胞浸潤，減輕氣道炎癥。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理HE染色觀察（×200）Fig.1 Pathological observation of lung tissue of mice in each group by HE staining（×200）

2.3 Western blot 檢測各組小鼠肺組織中NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達

2.3.1 各組NLRP3 蛋白表達 與空白組相比，各組 NLRP3 表達均升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX組和PCF組表達均降低（P＜0.05）；與DEX組相比，PCF組NLRP3蛋白表達升高（P＞0.05）。見表2、圖2。

2.3.2 各組caspase-1 蛋白表達 與空白組相比，模型組、DEX 組、PCF 組 caspase-1 表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX 組和 PCF 組表達均降低（P＜0.05）；與 DEX 組相比，PCF 組 caspase-1 蛋白表達增多（P＞0.05）。見表2、圖2。

2.3.3 各組ASC 蛋白表達 與空白組相比，模型組 ASC 表達升高（P＜0.05），DEX 組、PCF 組表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，DEX 組、PCF 組表達均降低（P＜0.05）；與 DEX 組相比，PCF組ASC 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

圖2 Western blot 檢測肺組織中NLRP3、caspase-1和ASC蛋白表達Fig.2 Expressions of NLRP3，caspase-1 and ASC protein in lung tissue detected by Western blot

表2 各組 NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表達比較（，n=10）Tab.2 Comparison of expressions of NLRP3，ASC and caspase-1 proteins in each group（，n=10）

表2 各組 NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表達比較（，n=10）Tab.2 Comparison of expressions of NLRP3，ASC and caspase-1 proteins in each group（，n=10）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05；compared with DEX group，3）P＜0.05.

ASC/GAPDH 0.32±0.12 0.82±0.181）0.41±0.092）0.52±0.132）Groups Control Model DEX PCF NLRP3/GAPDH 0.18±0.12 0.88±0.121）0.33±0.131）2）0.63±0.121）2）3）caspase-1/GAPDH 0.11±0.03 1.04±0.111）0.41±0.121）2）0.62±0.241）2）3）

2.4 免疫組化檢測各組小鼠肺組織中NLRP3、caspase-1 陽性表達面積 與空白組相比，模型組、PCF組 NLRP3、caspase-1 陽性面積增多（P＜0.05），DEX組表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，DEX 組、PCF 組表達均減少（P＜0.05）；與DEX 組相比，PCF 組 NLRP3、caspase-1 蛋白陽性面積增多（P＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 免疫組化檢測肺組織中NLRP3、caspase-1 蛋白表達（×200）Fig.3 Expressions of NLRP3 and caspase-1 proteins in lung tissue detected by immunohistochemistry（×200）

表3 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 蛋白陽性面積比較（，n=10）Tab.3 Comparison of positive area of NLRP3 and caspase-1 protein in each group（，n=10）

表3 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 蛋白陽性面積比較（，n=10）Tab.3 Comparison of positive area of NLRP3 and caspase-1 protein in each group（，n=10）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05；compared with DEX group，3）P＜0.05.

caspase-1 295.4±42.45 914.8±202.221）431.2±80.242）661.2±100.151）2）3）Groups Control Model DEX PCF NLRP3 199.0±47.56 626.6±68.921）216.2±44.842）404.4±85.481）2）3）

2.5 RT-PCR 檢測各組肺組織中NLRP3、caspase-1 mRNA 表達 與空白組相比，模型組、PCF 組NLRP3、caspase-1 mRNA 表達升高（P＜0.05），DEX組表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，DEX 組、PCF 組 NLRP3、caspase-1 mRNA 表達降低（P＜0.05）；與DEX組相比，PCF組NLRP3、caspase-1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表4）。

表4 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA 表達比較（，n=10）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of NLRP3 and caspase-1 of mice in each group（，n=10）

表4 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA 表達比較（，n=10）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of NLRP3 and caspase-1 of mice in each group（，n=10）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05.

caspase-1 0.007±0.002 0.020±0.0041）0.010±0.0022）0.014±0.0041）2）Control Model DEX PCF 0.006±0.002 0.018±0.0041）0.009±0.0032）0.012±0.0031）2）GroupsNLRP3

2.6 ELISA法檢測平喘方對哮喘小鼠BALF中炎癥因子影響

2.6.1 各組IL-1β 的因子表達 與空白組相比，模型組IL-1β 表達升高（P＜0.05），DEX 組、PCF 組表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，DEX組、PCF 組IL-1β 因子表達均降低（P＜0.05）；與DEX組相比，PCF 組 IL-1β 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表5。

2.6.2 各組IL-18的因子表達 與空白組相比，各組IL-18表達均升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX組和PCF 組表達均降低（P＜0.05）；與DEX 組相比，PCF組IL-18表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠 BALF 中 IL-1β、IL-18 因子表達比較（，n=10，pg/ml）Tab.5 Comparison of BALF expressions of IL-1β and IL-18 in each group（，n=10，pg/ml）

表5 各組小鼠 BALF 中 IL-1β、IL-18 因子表達比較（，n=10，pg/ml）Tab.5 Comparison of BALF expressions of IL-1β and IL-18 in each group（，n=10，pg/ml）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05.

IL-18 90.82±24.50 185.62±30.951）134.29±28.311）2）150.52±17.721）2）Groups Control Model DEX PCF IL-1β 65.19±6.80 120.83±22.951）79.84±21.292）81.40±15.772）

3 討論

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，發(fā)作時Th2相關(guān)的IL-4、IL-5、IL-13 等炎癥因子分泌增加，促進嗜酸性粒細胞增多、氣道黏液分泌過剩，伴隨氣道高反應性等情況出現(xiàn)［7］。哮喘中的NLRP3炎癥小體可通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）激活，識別病原體、各類毒素、微生物及代謝物的刺激［8］。在經(jīng)典的激活途徑下，NLRP3可在激酶NEK7（NIMA-related kinase 7）的作用下分離出caspase-1，而后在 NF-κB 的參與下，令 proIL-1β 和 proIL-18 中的前體分離，并最終生成IL-1β與IL-18炎癥因子［9］。IL-1β 在哮喘中可誘導 Th2、Th17 導致氣道炎癥［10］，還能調(diào)控NF-κB 通路，并進一步上調(diào)趨化因子、黏附分子、補體系統(tǒng)等的表達［11］。NLRP3 還可能是治療類固醇耐受型的中性粒細胞哮喘的關(guān)鍵靶點，給予哮喘小鼠外源性的IL-1β 會加重小鼠對類固醇的耐受，但NLRP3 炎癥小體加重此類哮喘的機制研究仍待完善［12］。

哮喘屬于中醫(yī)“哮病”“喘證”的范疇。中醫(yī)認為小兒哮喘的病因病機在于肺、脾、腎常不足，痰阻氣道，機體受外界刺激后引動伏痰而發(fā)?！疤怠睘橄l(fā)病的主要病理因素，中醫(yī)理論中“痰”不僅包括氣道黏液等分泌物，還可將哮喘相關(guān)炎癥細胞、炎癥因子等致病因素納入“無形之痰”的范疇［13］，因此中醫(yī)治療哮喘常選用化痰平喘藥物。同時，導師虞堅爾教授認為“血瘀”是哮喘發(fā)病的另一病理因素，患兒先天稟賦不足、肺脾氣虛，血行不暢，肺中內(nèi)生瘀血，與“痰”相合作用產(chǎn)生痰瘀互結(jié)之象，令哮喘遷延難愈。相關(guān)研究認為，中醫(yī)“血瘀”可將現(xiàn)代醫(yī)學中炎癥反應包含在內(nèi)，如臨床在運用激素治療哮喘時常伴有血液黏稠度增高、血栓素B2 升高，進而影響血小板和血流變的指標，加重肺部瘀血及氣道炎癥，當歸可通過抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB 炎癥通路緩解氣道炎癥和血瘀狀態(tài)，達到治療哮喘的目的［14］。本實驗中平喘方是海派徐氏兒科治哮經(jīng)典方，具有宣肺平喘、化痰祛瘀之功。全方以炙麻黃為君、苦杏仁為臣，功可宣肺平喘，紫蘇子、萊菔子、花椒目可降氣化痰，桃仁、地龍可活血祛瘀，共同治療哮喘“痰瘀互結(jié)”病機與病理產(chǎn)物。

本次研究通過HE 病理觀察發(fā)現(xiàn)，平喘方可改善哮喘小鼠氣道管壁狹窄，減輕氣道周圍及肺泡組織炎性物質(zhì)滲出，減少炎癥細胞浸潤，免疫組化顯示平喘方可減少氣道及肺泡上皮細胞NLRP3、caspase-1 陽性表達。經(jīng)平喘方干預后，哮喘小鼠肺中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白及相關(guān)基因表達降低，BALF 中 IL-1β、IL-18 炎癥因子的分泌減少，療效優(yōu)于哮喘模型組，與陽性對照藥地塞米松組比較，平喘方在降低 IL-1β、IL-18 分泌及 NLRP3、caspase-1 mRNA 表達等方面療效差異無統(tǒng)計學意義，NLRP3、caspase-1 蛋白表達略高于地塞米松治療組。研究結(jié)果顯示平喘方可通過減少NLRP3 的活化抑制caspase-1表達，進而減少IL-1β、IL-18炎癥因子的分泌，改善哮喘小鼠氣道炎癥情況。

綜上，平喘方可改善哮喘小鼠的氣道炎癥情況，其作用可能是通過抑制NLRP3 炎癥小體信號通路的活化，減少IL-1β、IL-18 炎癥因子的分泌，最終緩解哮喘氣道炎癥。然而，本研究中的平喘方為復方中藥，具體干預NLRP3 炎癥小體活化的分子化合物仍不明確，未來針對中醫(yī)藥復方的作用靶點與機制的研究仍在進一步探索中，中醫(yī)藥復方由多種中藥材組成，下一階段可根據(jù)網(wǎng)絡藥理學預測及指紋圖譜篩選等方法對平喘方的主要作用單體進行篩選并研究，以期為中醫(yī)藥臨床治療哮喘提供一定的參考。