細(xì)胞壞死抑制劑TAK-632治療急性胰腺炎的療效及分子機(jī)制

沙如拉, 秦瑞海, 王熠偉, 達(dá)胡拉巴藝?yán)?/p>

(1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科, 內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010017;2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院 內(nèi)科, 內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010010)

急性胰腺炎(AP)是多種病因引起的胰酶激活從而引起胰腺組織的自身消化、水腫、出血，甚至壞死，繼而導(dǎo)致胰腺局部炎癥反應(yīng)[1-2]。胰腺組織的壞死程度決定了AP患者的預(yù)后。細(xì)胞程序性壞死是由腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族以及Toll樣受體(TLR)家族、DNA依賴性干擾素調(diào)節(jié)因子激活因子(DAI)等與其對(duì)應(yīng)的配體結(jié)合誘發(fā)的細(xì)胞死亡[3-4]。研究[5-6]顯示，細(xì)胞程序性壞死與AP發(fā)生密切相關(guān)，參與了AP的進(jìn)展過(guò)程，能夠有效阻斷細(xì)胞程序性壞死路徑，有助于減慢患者AP進(jìn)程。TAK-632是強(qiáng)效泛Raf抑制劑，目前研究[7]顯示, TAK-632可作用于細(xì)胞程序性壞死過(guò)程中受體相互作用蛋白 (RIP) 1和RIP3，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性壞死。本研究探討TAK-632對(duì)AP的治療作用機(jī)制，為臨床治療AP提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

60只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠(體質(zhì)量約200 g)購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬)2015-0005, 倫理審批號(hào)為HP2019-029; HE染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司; ?；撬崮懰徕c購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司; 血清淀粉酶試劑盒購(gòu)自上海仁捷生物有限公司; RIP3、混合譜系激酶結(jié)構(gòu)區(qū)域樣蛋白(MLKL)、磷酸化RIP3、磷酸化MLKL兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自上海生工生物有限公司。

1.2 分組、動(dòng)物模型建立及治療

將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和TAK-632組，每組20只，模型組和TAK-632組大鼠經(jīng)腹腔注射0.3%的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，備皮消毒。在上腹劍突下做切口進(jìn)入腹腔，暴露十二指腸和胰膽管，并在胰膽管遠(yuǎn)端按鈕膽管靠近肝門(mén)處用血管夾夾閉，于十二指腸乳頭附近將0.45 mm頭皮針經(jīng)十二指腸穿入腸腔，逆行插入胰腺并用血管夾固定。微量泵推注5.00%牛膽酸鈉溶液，結(jié)束后觀察5 min, 待周圍組織出現(xiàn)棕紅色后拔出頭皮針，取下血管夾，使十二指腸復(fù)位，關(guān)閉腹腔。對(duì)照組手術(shù)時(shí)不泵入牛黃膽酸鈉。建模后24 h后對(duì)照組和模型組大鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水, TAK-632組大鼠經(jīng)腹腔注射25 mg/kg TAK-632。

1.3 大鼠血清淀粉酶檢測(cè)

對(duì)照組、模型組和TAK-632組大鼠治療72 h后，采集靜脈血，分離血清，測(cè)定血清淀粉酶的活性。

1.4 HE染色及評(píng)分

3組大鼠麻醉處死后，采用10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成厚度6 μm的切片。采用二甲苯脫蠟，梯度無(wú)水乙醇水化后，蘇木精染色5 min, 流水沖洗。5.00%乙酸分化1 min, 流水沖洗，分化后顏色成為藍(lán)色。伊紅染色1 min, 流水沖洗。再采用70.00%、80.00%、90.00%、100.00%酒精處理各10 s, 二甲苯處理1 min, 中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察胰腺組織病理學(xué)改變，采用Spormann標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。

1.5 ELISA檢測(cè)血清炎癥因子

采用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠外周血清TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞因子表達(dá)水平，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行操作步驟。構(gòu)建TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞因子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到吸光值。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)

對(duì)照組、模型組和TAK-632組大鼠處理后，取胰腺組織，加入組織裂解液，充分勻漿后, 15 000 轉(zhuǎn)/min離心30 min, 收集細(xì)胞上清液，采用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE, 并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h, 采用RIP3、MLKL、磷酸化RIP3、磷酸化MLKL在4 ℃下孵育12 h, 次日采用聚對(duì)苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯(PBST)洗滌3次，每次5 min; 然后采用羊抗兔二抗室溫封閉1 h, 采用發(fā)光液顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠存活率比較

對(duì)照組大鼠生存狀態(tài)良好，全部存活，存活率為100.00%。模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、動(dòng)作遲緩、運(yùn)動(dòng)能力下降、顫抖等癥狀，其中5只大鼠死亡，存活率75.00%。TAK-632組大鼠活動(dòng)能增強(qiáng)，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，大鼠全部存活，存活率為100.00%。與對(duì)照組和TAK-632組大鼠存活率比較，模型組大鼠存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 3組大鼠胰腺組織病理學(xué)比較

對(duì)照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織充血、水腫、紋理紊亂等癥狀。模型組大鼠胰腺組織細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有大量凋亡壞死、充血和水腫癥狀。經(jīng)TAK-632治療后，大鼠胰腺組織紋理、水腫、充血等癥狀明顯緩解。模型組大鼠胰腺組織病理學(xué)評(píng)分高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。TAK-632組大鼠病理學(xué)評(píng)分低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

A: 對(duì)照組; B: 模型組; C: TAK-632組。圖1 對(duì)照組、模型組和TAK-632組大鼠胰腺組織病理學(xué)結(jié)果(放大200倍)

表1 對(duì)照組、模型組和TAK-632組大鼠胰腺組織病理評(píng)分和血清淀粉酶比較

2.3 3組大鼠血清淀粉酶比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清淀粉酶活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TAK-632組大鼠血清淀粉酶活性高于對(duì)照組，但低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 3組大鼠血清炎癥因子比較

ELISA結(jié)果顯示，模型組外周血TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TAK-632組外周血TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于模型組，但高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

pg/mL

2.5 3組大鼠程序性壞死通路蛋白水平比較

Western blot結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組和TAK-632組大鼠胰腺組織總RIP3和MLKL蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠胰腺組織磷酸化RIP3和磷酸化MLKL水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TAK-632組大鼠胰腺組織中磷酸化RIP3和磷酸化MLKL水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照組、模型組和TAK-632組大鼠胰腺組織程序性壞死通路蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

AP是一種以胰腺腺泡細(xì)胞壞死為主要特征的危重疾病[8]。細(xì)胞壞死伴隨于AP的整個(gè)過(guò)程，主要由炎癥因子所介導(dǎo)[9-10], 細(xì)胞壞死過(guò)程是一種依賴于RIPK1和RIPK3激酶活性的細(xì)胞死亡方式，死亡信號(hào)誘導(dǎo)RIPK3激酶的激活，進(jìn)而磷酸化細(xì)胞壞死的特異性執(zhí)行蛋白MLKL[11]。磷酸化的MLKL發(fā)生寡聚化并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上，導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜破壞，以致細(xì)胞死亡和胞內(nèi)物質(zhì)外漏[12]。本研究采用牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)大鼠發(fā)生AP, 可見(jiàn)大鼠胰腺組織出現(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有大量凋亡壞死細(xì)胞，并出現(xiàn)充血和水腫癥狀。與對(duì)照組大鼠比較，建模后大鼠血清炎癥因子、TNF-α、IL-1β和IL-6水平、病理學(xué)評(píng)分和血清淀粉酶等指標(biāo)顯著增高。磷酸化RIP3和MLKL水平顯著上調(diào)，提示AP大鼠胰腺組織出現(xiàn)了明顯壞死等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。

TAK-632是細(xì)胞程序性壞死的抑制劑，細(xì)胞水平可作用于RIPK1和RIPK3激酶，影響激酶活性，進(jìn)而影響細(xì)胞程序性壞死[13-14]。本研究結(jié)果顯示, TAK-632處理AP后可顯著緩解AP臨床癥狀，降低胰腺組織病理學(xué)評(píng)分以及血清淀粉酶等指標(biāo)，說(shuō)明TAK-632對(duì)AP具有治療作用。

作用機(jī)制分析結(jié)果顯示, TAK-632可顯著下調(diào)AP大鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥水平。炎癥因子所致的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是造成胰腺組織凋亡和壞死的主要因素，可加速AP的發(fā)病和進(jìn)程，其中TNF-α是細(xì)胞程序性壞死的主要誘導(dǎo)因子，可與胰腺細(xì)胞表面的TNFR結(jié)合，促進(jìn)蛋白激酶RIP1和RIP3傳導(dǎo)死亡信號(hào)并形成壞死復(fù)合體，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死[15-16]。RIP3和MLKL是細(xì)胞程序性壞死過(guò)程中的核心蛋白，其磷酸化可激活細(xì)胞程序性壞死。本研究發(fā)現(xiàn), TAK-632并不影響AP組織中RIP3和MLKL蛋白表達(dá)水平，但可顯著下調(diào)磷酸化RIP3和MLKL水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞程序性壞死。

綜上所述, TAK-632可顯著下調(diào)AP大鼠炎癥水平，抑制細(xì)胞程序性壞死信號(hào)通路，進(jìn)而緩解AP, 降低AP大鼠的病死率。