凝血酶抑制劑亭扎肝素對(duì)肺癌血管生成的抑制作用及分子機(jī)制研究

付文娜, 吳 瓊, 王慧莉

(1. 遼寧省盤錦遼油寶石花醫(yī)院, 遼寧 盤錦, 124010;2. 中國人民武裝警察部隊(duì)遼寧省總隊(duì)大連支隊(duì)勤務(wù)保障大隊(duì)衛(wèi)生隊(duì), 遼寧 大連, 116011)

目前，肺癌的發(fā)生率和病死率均較高，大多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)展至晚期或轉(zhuǎn)移期[1]。血管生成對(duì)腫瘤的生長和發(fā)展至關(guān)重要，可為腫瘤提供氧氣和營養(yǎng)，浸潤腫瘤細(xì)胞，并為其轉(zhuǎn)移提供途徑[2]。血管生成過程高度復(fù)雜，并受多種促血管生成和抗血管生成因子的調(diào)控，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和生長停滯特異性蛋白 6(Gas6)等[3-4]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占原發(fā)性肺癌的85%, 血管生成阻斷或可成為其有效的治療策略[5]。VEGF及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(VEGFR2)被認(rèn)為是癌癥抗血管生成治療最重要的靶點(diǎn)之一，許多靶向VEGF/VEGFR2的單克隆抗體和抑制劑已被開發(fā)并應(yīng)用于NSCLC的治療中，但效果不夠理想，患者5年生存率仍然很低[6]。凝血酶會(huì)影響VEGF的合成分泌，還會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，使其功能紊亂。亭扎肝素是一種低分子量肝素(LMWH), 屬于凝血酶抑制劑，可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞激活，從而抑制腫瘤生長，使患者存活率升高[7]。亭扎肝素還可調(diào)節(jié)黑色素瘤中VEGF和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表達(dá)，從而抑制血管生成[8]。本研究探討亭扎肝素對(duì)肺癌血管生成的抑制作用及分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6周齡健康雄性裸鼠(BALB/cA-nu)30只購自廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均飼養(yǎng)于恒定濕度、溫度的無菌條件下。根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告指南(ARRIVE指南)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞系培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購于Sciencell公司，人肺癌細(xì)胞系HCC827購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。HUVEC于含5%胎牛血清(FBS)和1%內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充劑的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)試劑盒中培養(yǎng)。HCC827于含10%FBS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并向培養(yǎng)基中加入100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素。所有細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)，并分為對(duì)照組(不加亭扎肝素)和10 U/L亭扎肝素組、20 U/L亭扎肝素組、50 U/L亭扎肝素組、100 U/L亭扎肝素組。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

亭扎肝素購自Selleck公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購自 Beyotime公司。蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、VEGF、凝血酶和β-actin購自Cell Signaling Technology公司。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、CD31、Ki-67和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔/小鼠IgG抗體購自ABclonal Technology公司。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，將細(xì)胞置于96孔板上, 37 ℃培養(yǎng)過夜，與不同濃度藥物孵育72 h。加入CCK-8試劑，并將混合物在 37 ℃下孵育0.5～4.0 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(OD)值。與對(duì)照組相比評(píng)價(jià)細(xì)胞生長速率，并使用GraphPad Prism 7.0軟件計(jì)算50%抑制濃度(IC50)值。

1.5 內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

亭扎肝素對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移的影響使用Transwell小室進(jìn)行評(píng)估。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，將無血清ECM的HUVEC懸浮后以2×104個(gè)/孔密度接種于板中，底部腔室充滿0.6 mL新鮮ECM。HUVEC細(xì)胞于37 ℃培養(yǎng)24 h。用棉簽除去膜表面的非遷移細(xì)胞后，用4%多聚甲醛固定, 0.1%結(jié)晶紫染色遷移至下膜表面的HUVEC。通過EVOS XL Core細(xì)胞成像系統(tǒng)拍照得到圖像，每個(gè)孔中隨機(jī)選擇3個(gè)視野，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析遷移細(xì)胞。

1.6 體外試管形成試驗(yàn)

體外血管生成研究中，根據(jù)制造商(ibidi, 德國)說明書使用ibidi載玻片進(jìn)行體外試管形成試驗(yàn)。將200 000個(gè)HUVEC懸浮在1 mL M199培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充有指定濃度的亭扎肝素。將細(xì)胞懸液(50 μL)加至每個(gè)載玻片孔中，并于37 ℃加濕室中孵育。在細(xì)胞接種后0、0.5、3、6、9 h, 以10倍放大率對(duì)管形成情況進(jìn)行成像。9 h后，采用ImageJ軟件定量總管長。

1.7 網(wǎng)絡(luò)形成分析

在存在或不存在亭扎肝素的情況下，將HUVEC以2×104個(gè)/孔密度接種于96孔板。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下孵育6 h。使用EVOS XL Core細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察和捕獲網(wǎng)絡(luò)，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量和分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定

通過主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定結(jié)果確定亭扎肝素的抗血管生成作用。從BALB/c小鼠中分離胸主動(dòng)脈并在磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗。切除纖維脂肪組織后，將胸主動(dòng)脈切成1.0～1.5 mm長的環(huán)，并將環(huán)接種在預(yù)涂Matrigel的96孔板中，再鋪上 80 μL Matrigel。溫育2 h后，將主動(dòng)脈環(huán)用含亭扎肝素的新鮮ECM處理6 d。使用EVOS XL Core細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察并拍攝發(fā)芽的微血管，使用ImageJ軟件對(duì)MVD進(jìn)行量化。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.9 絨毛尿囊膜(CAM)檢測(cè)

對(duì)受精雞蛋進(jìn)行CAM檢測(cè)，雞蛋已在 37 ℃下于濕度60%～65%的加濕孵化器中孵化5 d, 在毒氣室一側(cè)的蛋殼處切開1個(gè)約1 cm2的小窗口以開發(fā)人造毒氣室。分離殼和殼膜，以暴露 CAM。將CAM隨機(jī)分為對(duì)照組和亭扎肝素 0.2 mg/kg組，每組8個(gè)雞蛋。用透明膠帶密封窗口后，再將雞蛋孵化48 h。使用Olympus SZX18解剖顯微鏡觀察和捕獲CAM中的血管，并應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)微血管進(jìn)行量化。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分析

使用RIPA緩沖液裂解用或未用亭扎肝素處理的HUVEC和HCC827細(xì)胞，獲得全細(xì)胞提取物。使用NE-PERTM核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)分離細(xì)胞質(zhì)和核蛋白，并使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)測(cè)定總蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(美國Millipore公司)。將膜與抗體一起孵育并使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，采用ImageJ 軟件測(cè)量定量數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.11 體內(nèi)小鼠異種移植試驗(yàn)

將懸浮在100 μL Matrigel中的HCC827細(xì)胞(1×106個(gè))接種到4～6周齡雄性裸鼠(BALB/cA-nu)右側(cè)皮下。當(dāng)腫瘤長至100 mm3時(shí)，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只。各組小鼠分別腹腔注射賦形劑、亭扎肝素60 IU/kg。根據(jù)公式(0.5×寬度2×長度)用卡尺進(jìn)行2次垂直測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，切除腫瘤，稱重并拍照。將腫瘤用4%多聚甲醛固定，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。采用免疫組化方法檢測(cè)腫瘤組織中Ki-67、CD31和VEGFA表達(dá)情況。采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 亭扎肝素對(duì)HUVEC增殖和遷移的影響

本研究采用增殖和遷移試驗(yàn)評(píng)估亭扎肝素對(duì)HUVEC的抗血管生成作用，其中細(xì)胞活力測(cè)定可為進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)提供合適的濃度。Tranwell遷移試驗(yàn)顯示, 20、50、100 U/L亭扎肝素均可有效抑制HUVEC遷移，其細(xì)胞遷移距離與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1A; CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，亭扎肝素以劑量依賴性方式降低HUVEC細(xì)胞活力，不同濃度亭扎肝素組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1B。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 20 U/L亭扎肝素具有有效的抗血管生成作用。

A: 各組HUVEC細(xì)胞遷移距離比較; B: 各組HUVEC細(xì)胞活力比較。與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與20 U/L亭扎肝素組比較,#P<0.05; 與50 U/L亭扎肝素組比較, △P<0.05。

2.2 亭扎肝素對(duì)體外和體內(nèi)血管生成的影響

本研究采用網(wǎng)絡(luò)形成試驗(yàn)和主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證亭扎肝素的抗血管生成作用。網(wǎng)絡(luò)形成試驗(yàn)顯示，相較于對(duì)照組, 20 U/L亭扎肝素可有效抑制HUVEC的管形成，管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量減少且管狀結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組, 20 U/L亭扎肝素減少了血管生成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相較于對(duì)照組, 20 U/L亭扎肝素抑制了CAM模型中的新血管形成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

A: 2組HUVEC管形成的網(wǎng)絡(luò)形成試驗(yàn)結(jié)果(放大倍數(shù)400倍); B: 2組相對(duì)管型長度比較; C: 主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定HUVEC血管生成結(jié)果(放大倍數(shù)400倍); D: 2組HUVEC微血管數(shù)量比較; E: CAM模型中的新血管形成結(jié)果(放大倍數(shù)400倍); F: 2組CAM模型中微血管數(shù)量比較。與對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01。圖2 亭扎肝素對(duì)體外和體內(nèi)血管生成的影響

2.3 亭扎肝素對(duì)VEGF和AKT的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示, HUVEC和HCC827細(xì)胞中, 20 U/L亭扎肝素組的凝血酶含量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); HCC827細(xì)胞中, 20 U/L亭扎肝素組的VEGF、p-Akt和Akt蛋白含量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

A、B: HUVEC凝血酶含量的Western blot檢測(cè)結(jié)果; C～G: HCC827細(xì)胞中VEGF、凝血酶、p-Akt、Akt蛋白含量的Western blot檢測(cè)結(jié)果。與對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01。圖3 亭扎肝素抑制VEGF和AKT的激活

2.4 亭扎肝素對(duì)HCC827異種移植物中腫瘤

生長和腫瘤血管生成的影響

本研究通過HCC827異種移植物進(jìn)一步驗(yàn)證亭扎肝素的抗腫瘤和抗血管生成作用，發(fā)現(xiàn)20 U/L亭扎肝素組的腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積均小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 表明亭扎肝素顯著抑制了腫瘤生長。進(jìn)一步評(píng)估亭扎肝素對(duì)腫瘤增殖、細(xì)胞凋亡和血管生成的影響(采用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，將Ki-67作為增殖標(biāo)志物，將CD31和VEGFA作為血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較, 20 U/L亭扎肝素可抑制腫瘤增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制血管生成。見圖4。

A: 2組小鼠腫瘤質(zhì)量比較; B: 不同給藥時(shí)間2組小鼠腫瘤體積比較; C: 2組小鼠腫瘤圖; D: Ki-67、凋亡細(xì)胞(TUNEL方法)、CD31和VEGFA的免疫組化檢測(cè)結(jié)果。與對(duì)照組比較, **P<0.01。圖4 亭扎肝素抑制HCC827異種移植物中的腫瘤生長和腫瘤血管生成

3 討 論

目前，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類的生命健康。血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[9-11], 而VEGF/VEGFR是參與血管生成的關(guān)鍵信號(hào)通路[6]。亭扎肝素是一種凝血酶抑制劑，可抑制凝血酶表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，亭扎肝素不僅可抑制血管生成過程中HUVEC細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(增殖、遷移和管形成)，還具有抗血管生成和抗腫瘤活性，而在腫瘤異種移植模型中，亭扎肝素也對(duì)腫瘤生長具有抑制作用。

細(xì)胞增殖和抵抗細(xì)胞凋亡是癌癥的兩大標(biāo)志[12], 癌細(xì)胞通過自身產(chǎn)生生長因子或刺激正常細(xì)胞提供各種生長因子來促進(jìn)增殖[13]。細(xì)胞凋亡是癌癥發(fā)展的天然屏障，但癌細(xì)胞已進(jìn)化出多種方法來限制細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，亭扎肝素治療對(duì)體外和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖均具有抑制作用并可顯著誘導(dǎo)其凋亡。血管生成是癌癥的另一個(gè)重要標(biāo)志，血管生成對(duì)其生理和病理生理過程至關(guān)重要，目前已有一些血管生成抑制劑被應(yīng)用于臨床[15]。相關(guān)研究[16]在肺癌模型中研究抗凝血酶對(duì)腫瘤生長的抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗凝血酶的裂解構(gòu)象具有強(qiáng)大的抗血管生成和抗腫瘤活性，完整抗凝血酶的穩(wěn)定鎖定和潛伏形式的構(gòu)象與分子的裂解形式基本相似，也在體內(nèi)抑制血管生成和腫瘤生長，并選擇性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤血管系統(tǒng)。研究[17]顯示，凝血酶活性可促進(jìn)血管生成，誘導(dǎo)血小板釋放VEGF, 并增加VEGF及其受體的表達(dá)，驅(qū)動(dòng)腫瘤血管生成。本研究發(fā)現(xiàn)，亭扎肝素可抑制VEGF蛋白表達(dá)和體內(nèi)體外的血管生成，且亭扎肝素可通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制血管生成來抑制腫瘤生長。

Akt是VEGFR的重要下游信號(hào)分子，參與腫瘤細(xì)胞增殖、存活和血管生成[18]。本研究結(jié)果表明，亭扎肝素可顯著抑制Akt的磷酸化。本研究還發(fā)現(xiàn)，在HCC827異種移植模型中，亭扎肝素抑制了增殖標(biāo)志物Ki-67, 增加了細(xì)胞凋亡，且亭扎肝素可抑制腫瘤生長，使血管標(biāo)志物CD31顯著下降和VEGFA顯著減少，表明亭扎肝素可抑制HCC827異種移植物中的腫瘤生長和腫瘤血管生成。

綜上所述，凝血酶抑制劑亭扎肝素可抑制細(xì)胞增殖和血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，明顯抑制HCC827異種移植物中的腫瘤血管生成和腫瘤生長，其抗血管生成作用與Akt及其下游信號(hào)通路的失活有關(guān)，為進(jìn)一步研究凝血酶抑制劑對(duì)肺癌血管生成的抑制作用提供了有力證據(jù)。