姜黃素納米微粒的制備及其對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞周期的影響

鄭海生, 藍(lán)育青, 鐘興武, 周懷勝, 徐家窈

(1. 中山大學(xué)中山眼科中心海南眼科醫(yī)院/海南省眼科醫(yī)院/海南省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 眼科,海南 ?？? 570311; 2. 中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 眼科, 廣東 廣州, 510120;3. 廣東省佛山市第二人民醫(yī)院 眼科, 廣東 佛山, 528000)

姜黃素是從姜科和天南星科一些植物的根莖中提取的一種二酮類化合物，化學(xué)式為C21H20O6, 其具有抗新生血管、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種療效[1-3]。但姜黃素難溶于水，體內(nèi)半衰期短，目前姜黃素藥物多以片劑或膠囊等劑型存在，且需要長(zhǎng)期、反復(fù)用藥，研制姜黃素的新劑型具有重要的臨床意義。納米藥物相對(duì)于傳統(tǒng)藥物具有較多優(yōu)勢(shì)[4-7]: 藥物的溶解度增大; 更容易通過血-視網(wǎng)膜屏障; 具有緩釋性、靶向性; 減少副作用等。本研究應(yīng)用納米技術(shù)將姜黃素包載到殼聚糖脫氧膽酸納米微粒中，制作成姜黃素殼聚糖脫氧膽酸納米微粒，希望此納米微粒具有緩慢釋放姜黃素的功能，減少姜黃素的不良反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間維持有效濃度，減少因反復(fù)給藥對(duì)患者造成的傷害。

姜黃素在防治眼底新生血管性病變中可以發(fā)揮其抗新生血管的藥理作用[8]。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞無論在體內(nèi)或體外，缺氧均可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，從而促進(jìn)眼內(nèi)血管新生[9]。因此尋找能有效抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖，且毒副作用較小的防治方法尤為重要。本研究觀察姜黃素殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞周期的作用，探討其對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與主要儀器設(shè)備

姜黃素(購(gòu)自SIGMA公司)、胎牛血清(Biological Industries公司)、人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(中山眼科中心醫(yī)院提供，選第3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn))。光學(xué)倒置顯微鏡(德國(guó) Leica MPS-30)、熒光顯微鏡Axioplan2 imaging(德國(guó) Zeiss)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 姜黃素納米微粒合成: 將20 mg殼聚糖脫氧膽酸放入5 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH值6.2)中，不斷攪拌使殼聚糖脫氧膽酸膨脹溶解; 稱量10 mg姜黃素，并用四氫呋喃將其溶解; 將溶解了姜黃素的四氫呋喃溶液緩慢滴加入殼聚糖脫氧膽酸溶液中，接著緩慢滴加蒸餾水，邊攪拌邊升高溫度至40 ℃超過24 h, 以便殘存四氫呋喃揮發(fā); 最后將溶液離心15 min, 下層沉淀為未負(fù)載的藥物，上清液即為殼聚糖脫氧膽酸負(fù)載的姜黃素納米微粒(此方法已申請(qǐng)國(guó)家專利: 201010138 683.9)。

1.2.2 姜黃素納米微粒負(fù)載效率與載藥量的測(cè)定: 上述液體離心后的下層沉淀為未負(fù)載的藥物，將其溶于20.0%乙醇的PBS(pH值6.2)中，采用紫外分光光度法(波長(zhǎng)433.0 nm)測(cè)定其含量。計(jì)算姜黃素納米微粒的負(fù)載效率與載藥量的公式: 負(fù)載效率=(加入的姜黃素總量-未負(fù)載的姜黃素量)/加入的姜黃素總量×100%。載藥量=(加入的姜黃素總量-未負(fù)載的姜黃素量)/投入的殼聚糖脫氧膽酸總量×100%, 未負(fù)載的姜黃素量為液體離心沉淀干燥后所得。

1.2.3 姜黃素檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇: 稱1.0 mg姜黃素，溶解于100.0 mL 20%乙醇的PBS中，配成10.0 μg/mL的溶液, 20%乙醇的PBS為空白對(duì)照，用紫外-可見光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描(波長(zhǎng)范圍200.0～600.0 nm), 并將數(shù)據(jù)用Origin7.0分析，從而確定姜黃素的最大吸收波長(zhǎng)在433.0 nm(圖1), 所以姜黃素的檢測(cè)波長(zhǎng)為433.0 nm。

圖1 姜黃素光譜掃描曲線(波峰為433.0 nm)

1.2.4 姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線: 準(zhǔn)確稱取2.0 mg姜黃素，用20.0%乙醇的PBS溶于100.0 mL容量瓶中，定容后分別量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL, 在10.0 mL容量瓶中用上述溶液定容。于433.0 nm波長(zhǎng)處測(cè)量紫外光吸光度值(空白對(duì)照: 含20%乙醇的PBS), 并用Origin7.0分析，得出姜黃素在含20.0%乙醇的PBS(濃度: 1.0～10.0 μg/mL)中的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 姜黃素納米微粒的體外釋放: 考察姜黃素納米微粒在含20.0%乙醇PBS中的釋放特征(動(dòng)態(tài)透析法)。在透析袋中裝入3.8 mL姜黃素納米微粒溶液，將透析袋放于196.2 mL透析介質(zhì)中(37.0 ℃, 100轉(zhuǎn)/min), 每間隔一段時(shí)間取透析介質(zhì)溶液1.0 mL, 同時(shí)補(bǔ)充1.0 mL介質(zhì)溶液。采用紫外分光光度法測(cè)定藥物的釋放量，藥物釋放率=(藥物釋放量/藥物總量)×100%。

1.2.6 透射電鏡觀察納米微粒形態(tài): 取少量殼聚糖脫氧膽酸納米微粒和姜黃素納米微粒溶液分別滴至銅網(wǎng)支持膜上，用濾紙將多余的液體吸除，待自然干燥后用2%磷鎢酸染色，晾干后在透射電鏡下觀察二者的形態(tài)。

1.3 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)[10]

1.3.1 CCK-8法檢測(cè)殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的影響: 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，用含10.0%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基制備為細(xì)胞懸液(2 500.0個(gè)/mL), 在5塊96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100.0 μL的細(xì)胞懸液進(jìn)行貼壁培養(yǎng)24 h，直至細(xì)胞長(zhǎng)為單層后，分別在每塊培養(yǎng)板中加入不同濃度的100.0 μL殼聚糖脫氧膽酸納米微粒溶液(濃度為5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL), 同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)液)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔; 再將96孔培養(yǎng)板分別培養(yǎng)24、48 h后，向每孔中加入10.0 μL CCK-8試劑和100.0 μL含胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基后，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3 h; 酶標(biāo)儀檢測(cè)450.0 nm處各孔光密度(OD)值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定姜黃素納米微粒和姜黃素原藥對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞周期時(shí)相的影響: 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3～6代細(xì)胞，接種于25.0 mL培養(yǎng)瓶中(密度5.0×105個(gè)/mL), 24 h后加含10.0%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h, 再分別加入姜黃素和姜黃素納米微粒(濃度5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL), 對(duì)照組只加培養(yǎng)液, 72 h后收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)，完成細(xì)胞周期分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素納米微粒合成及其負(fù)載效率和載藥量的測(cè)定

所合成的姜黃素納米微粒溶液為淡黃色，并可見Tyndall現(xiàn)象(圖2)。經(jīng)紫外-可見光譜法測(cè)定所合成的姜黃素納米微粒的負(fù)載率為55.0%, 載藥量為27.5%。

A: 合成的淡黃色姜黃素納米微粒溶液; B: 納米微粒溶液的Tyndall現(xiàn)象。

2.2 姜黃素在20.0%乙醇PBS中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用Origin 7.0進(jìn)行分析，得出在濃度為1.0～10.0 μg/mL的20.0%乙醇PBS中姜黃素的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下:Y= 0.007 67+0.032 62×X(X的范圍是1.0～10.0 μg/mL;R=0.994 94)。

2.3 姜黃素納米微粒的體外釋放

姜黃素納米微粒在溶液中的釋放行為見圖3。藥物從納米微粒中的釋放在96 h后可達(dá)到平衡，藥物的累積釋放量為31.6%。

圖3 姜黃素納米微粒的體外釋放

2.4 透射電鏡觀察納米微粒形態(tài)

透射電鏡下可見未負(fù)載姜黃素藥物的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒呈類球形或球形，粒徑30～50 nm, 大小較為均一(圖4A); 而負(fù)載姜黃素藥物的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒的粒徑則明顯增大為70～100 nm (圖4B)。

A: 未負(fù)載姜黃素藥物的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒，粒徑30.0～50.0 nm; B: 負(fù)載姜黃素的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒，載藥量27.5%, 粒徑70.0～100.0 nm。

2.5 CCK-8法檢測(cè)殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的殼聚糖脫氧膽酸納米微粒作用于人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞24、48 h后的OD值與對(duì)照組(只加培養(yǎng)液)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.381、0.281,P>0.05)。見表1。光鏡下s觀察細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化，提示單純殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞無毒性，安全性良好。見圖5。

A: 24 h; B: 48 h; C: 殼聚糖脫氧膽酸納米微粒作用于人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞前細(xì)胞形態(tài)。圖5 殼聚糖脫氧膽酸納米微粒作用于人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)(放大倍數(shù)100倍)

表1 不同濃度殼聚糖脫氧膽酸納米微粒作用于人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞24、48 h OD值

2.6 流式細(xì)胞儀測(cè)定姜黃素及姜黃素納米微粒對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期影響

在5.0～40.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，姜黃素及姜黃素納米微粒作用于人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞均出現(xiàn)S期細(xì)胞百分比下降，而G0～G1期細(xì)胞百分比上升，說明人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖期減少。見圖6。

A: 對(duì)照; B: 姜黃素納米微粒5.0 μg/mL; C: 姜黃素納米微粒10.0 μg/mL; D: 姜黃素納米微粒20.0 μg/mL; E: 姜黃素納米微粒40.0 μg/mL; F: 姜黃素 5.0 μg/mL; G: 姜黃素 10.0 μg/mL; H: 姜黃素 20.0 μg/mL; I: 姜黃素40.0 μg/mL。圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)姜黃素納米微粒及姜黃素對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞周期的影響結(jié)果

3 討 論

高分子化合物是制備納米控釋系統(tǒng)的主要載體材料，常以天然的大分子體系和合成的可生物降解的聚合物體系為主。本研究中所用的殼聚糖是一種天然高分子聚合物，其具有良好的黏附性、生物相容性及可降解性[11-12]。本研究所合成的姜黃素殼聚糖脫氧膽酸納米微粒選用了殼聚糖脫氧膽酸作為姜黃素的載體，該聚合物在水溶液中可形成納米微粒[13]。本研究通過CCK-8法比較對(duì)照組和不同濃度殼聚糖脫氧膽酸納米微粒組的細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果得出各濃度殼聚糖脫氧膽酸納米微粒組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 同時(shí)在倒置顯微鏡下觀察人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的形態(tài)未發(fā)生變化，說明殼聚糖脫氧膽酸納米微粒對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)無影響，提示殼聚糖脫氧膽酸對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞無毒性，可作為本研究的藥物納米載體。研究[14]發(fā)現(xiàn)，包載姜黃素的殼聚糖/聚己內(nèi)酯納米微粒在人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞和人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞OCM-1細(xì)胞中的細(xì)胞毒性與游離姜黃素?zé)o顯著差異。納米藥物的緩釋機(jī)制有[15]: ① 吸附或連接于粒子表面的藥物與納米粒脫離; ② 納米膠束內(nèi)的藥物不斷向外擴(kuò)散; ③ 納米膠束本身不斷被降解，藥物不斷從膠束內(nèi)部被釋放出來。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素納米微粒的載藥量為27.5%, 與LI J J等[16]采用脫絨法制備的姜黃素白蛋白納米顆粒載藥量24.0%較為接近。藥物從納米微粒中的釋放在96 h后可達(dá)到平衡，藥物的累積釋放量為31.6%。體外擴(kuò)散釋放實(shí)驗(yàn)證明，本研究所合成的姜黃素殼聚糖脫氧膽酸納米微粒具有緩慢釋放功能。

目前，姜黃素已被作為一種抗癌新藥[17]。同時(shí)已有學(xué)者[18-19]對(duì)姜黃素的藥物代謝動(dòng)力學(xué)及癌癥治療的生物有效劑量進(jìn)行了相關(guān)研究。姜黃素在眼科的應(yīng)用研究主要集中于其抗新生血管的作用，可能對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變和角膜堿燒傷等疾病發(fā)揮重要的治療作用[8, 20]。龔凌等[21]、SHUKLA S等[22]發(fā)現(xiàn)姜黃素可顯著抑制人胚胎視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖。凋亡是抑制細(xì)胞增殖的重要原因[22-24], 本研究結(jié)果顯示，在5.0～40.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，姜黃素及姜黃素納米微粒作用于人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞均出現(xiàn)G0～G1期細(xì)胞百分比上升, S期細(xì)胞百分比下降，提示人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖期減少，姜黃素可以阻滯人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞周期于S期，可能是姜黃素抑制細(xì)胞增殖的重要原因之一[25], 而姜黃素納米微粒可以提高其阻滯能力。李松霖等[26]將相同濃度的姜黃素納米微粒和姜黃素作用于Lewis肺癌細(xì)胞24 h后，姜黃素納米微粒組、姜黃素組和陰性對(duì)照組Lewis肺癌細(xì)胞的凋亡率分別為67.69%、7.43%和4.94%, 同時(shí)發(fā)現(xiàn)姜黃素可以阻滯Lewis肺癌細(xì)胞周期于S期，與本研究結(jié)果一致。但本研究?jī)H研究了殼聚糖脫氧膽酸納米微粒與細(xì)胞在不同時(shí)間內(nèi)的相互作用的關(guān)系，及姜黃素納米微粒對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞周期的影響; 殼聚糖脫氧膽酸及姜黃素納米微粒與人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的相互作用關(guān)系，及對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖的影響還需開展更深入的研究進(jìn)行明確。

綜上所述，殼聚糖脫氧膽酸包載的姜黃素納米微粒能持續(xù)釋放出姜黃素，具有較好的緩釋功能，載藥材料殼聚糖脫氧膽酸對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的安全性及生物相容性較好。本研究為進(jìn)一步探討姜黃素納米微粒對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的影響提供了依據(jù)。