老年科鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及外排泵基因研究

侯盼飛, 余九峰, 周素芹

(南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬漣水人民醫(yī)院, 1. 檢驗(yàn)科, 2. 藥劑科, 江蘇 漣水, 223400)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種需氧、非發(fā)酵乳糖的革蘭陰性菌，為條件致病菌，易定植在人的皮膚、呼吸道及醫(yī)院環(huán)境中[1]。老年科患者因患有基礎(chǔ)疾病、長(zhǎng)期服用抗菌藥物、免疫功能低下等問(wèn)題，是醫(yī)院感染的高發(fā)人群[2]。近年來(lái)，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，因而探討老年科患者鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性及耐藥機(jī)制具有重要意義。多種菌株耐藥與外排泵系統(tǒng)過(guò)度表達(dá)有關(guān)。本研究分析老年科臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性及外排泵基因攜帶情況，以期為醫(yī)院感染防控和臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株: 臨床菌株為2020年1—12月南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬漣水人民醫(yī)院老年科分離的鮑曼不動(dòng)桿菌85株; 質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2 材料: 藥敏紙片為OXOID公司生產(chǎn)，培養(yǎng)基購(gòu)自安圖生物工程股份有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物有限公司。

1.1.3 儀器: Vitek2 compact細(xì)菌鑒定儀購(gòu)自生物梅里埃公司, SLAN-96P熒光定量PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司，凝膠成像儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性檢測(cè): 用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)85株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常用的15種抗菌藥物的敏感性。具體方法及結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)性能標(biāo)準(zhǔn)(2020年版, M100-S30)[3]。

1.2.2 外排泵基因檢測(cè): 采用煮沸法提取基因組DNA。adeB-P1引物序列(5′-3′)為TTCGGTATGGTGCTTGCCAT, P2為TCTTGGCTGCCATTGCCATA, 產(chǎn)物916 bp;adeG-P1引物序列(5′-3′)為TGTTCGGGATGGTACTTGCC, P2為CAGGAACGAAACCACCTGGA, 產(chǎn)物528 bp;adeJ-P1引物序列(5′-3′)為TGGTGTTAGCCGCATGCTTA, P2為CCAATACCCGCGTTTTGACC, 產(chǎn)物291 bp。采用25 μL反應(yīng)體系。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察特異性擴(kuò)增條帶，挑選部分陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，采用卡方檢驗(yàn)對(duì)多重耐藥菌和非多重耐藥菌的基因陽(yáng)性率進(jìn)行比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多黏菌素B的敏感率為100.0%, 對(duì)米諾環(huán)素(29.4%)、頭孢哌酮-舒巴坦(35.3%)、阿米卡星(38.8%)和慶大霉素(41.2%)耐藥率較低，對(duì)其他檢測(cè)藥物的耐藥率均超過(guò)50.0%, 見(jiàn)表1。本研究共檢出多重耐藥菌49株，占57.6%。

2.2 外排泵基因檢測(cè)

依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，將85株菌株分為多重耐藥組49株和非多重耐藥組36株。49株多重耐藥菌中,adeB、adeG和adeJ外排泵基因的陽(yáng)性率分別為73.5%、77.6%和71.4%, 非多重耐藥菌對(duì)應(yīng)基因陽(yáng)性率分別為41.7%、52.8%和52.8%, 2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表2。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)中的基因序列比對(duì)，同源性為99%。部分代表菌株adeB、adeG、adeJ基因電泳圖見(jiàn)圖1。

M: 標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物; 1～3: adeB; 4～6: adeJ; 7: 陰性對(duì)照; 8～10: adeG。圖1 adeB、adeG和adeJ基因PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種重要的醫(yī)院感染病原菌，已被發(fā)現(xiàn)廣泛分布于重癥監(jiān)護(hù)病房、呼吸科、神經(jīng)外科等科室，但目前針對(duì)老年科鮑曼不動(dòng)桿菌的相關(guān)研究[4]尚較少見(jiàn)。陳亞男等[5]對(duì)老年患者呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎合并耐藥菌感染情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出率最高，達(dá)51.15%。全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)[6]監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，近年來(lái)老年患者鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率均居前4位，且該菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率均波動(dòng)在60%左右。本研究結(jié)果顯示，南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬漣水人民醫(yī)院老年科臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為54.1%和55.3%, 除頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、慶大霉素、米諾環(huán)素外，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)其他檢測(cè)藥物的耐藥率均高于50.0%, 與全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)結(jié)果[6-7]基本一致。本研究中，所有鮑曼不動(dòng)桿菌均對(duì)多黏菌素B敏感，但該藥物毒副作用大，故很少被應(yīng)用于老年科患者中[8]。本研究還發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素的敏感性也較高，故阿米卡星、慶大霉素可作為替代用藥。

相關(guān)研究[9]表明，鮑曼不動(dòng)桿菌一旦對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，常表現(xiàn)為多重耐藥甚至泛耐藥。已有研究[10-11]證實(shí)，外排泵過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的重要機(jī)制，目前在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的外排泵主要包括AdeABC、AdeIJK和AdeFGH等。本研究依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果將85株鮑曼不動(dòng)桿菌分為多重耐藥組和非多重耐藥組并進(jìn)行外排泵基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，多重耐藥組菌株的adeB、adeJ、adeG基因陽(yáng)性率均高于非多重耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此表明, AdeABC、AdeIJK和AdeFGH外排泵均是導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥的重要原因。但外排泵種類繁多，機(jī)制復(fù)雜，且多種外排泵之間還可能存在相互作用[12], 未來(lái)有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，老年科鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥形勢(shì)較嚴(yán)峻，其多重耐藥與攜帶adeB、adeG和adeJ外排泵基因密切有關(guān)。進(jìn)一步探索外排泵的作用機(jī)制，開(kāi)發(fā)有效的外排泵抑制劑，研發(fā)新的抗菌藥物劑型，或可為多重耐藥菌的治療提供新的方向。