免疫親和柱-高效液相色譜法測定食品中 玉米赤霉烯酮的含量

王 燕，林明娥

（貴港市公共檢驗檢測中心，廣西貴港 537100）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）又稱為F-2毒素，主要是由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌和雪腐鐮刀菌等產生的有毒代謝產物，主要存在于易受真菌污染的玉米、小麥、高粱和大米等谷物中[1]。目前，檢測玉米赤霉烯酮的方法有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、高效液相色譜-質譜聯(lián) 用 法（High Perfomance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、熒光光度法（Fluorescence Spectrophotometry，F(xiàn)S）、薄層層析法（Thin Layer Chromatography，TLC）和免疫學檢測法等。其中，免疫學檢測方法方便、實用，但可能會出現(xiàn)假陽性，適合于大規(guī)模樣品的快速檢測[2]；高效液相色譜法和高效液相色譜-質譜聯(lián)用法具有準確度高、靈敏性強、可微量測定等優(yōu)點?！妒称钒踩珖覙藴?食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209—2016）第一法液相色譜法，該法通過免疫親和柱凈化后用熒光檢測器檢測，適用于糧食和糧食制品、酒類、醬油、醋、醬及醬制品、大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的測定，樣品適用范圍廣，靈敏度高[3]。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品為2021年貴港市食品監(jiān)督抽檢樣品及委托檢驗樣品。樣品共7份，種類包括面條、面包、玉米粉、面粉、醬油、花生油和葡萄酒等。

1.2 儀器與試劑

1260B高效液相色譜儀配熒光檢測器（美國安捷倫公司）；Simplicity純水系統(tǒng)（Millipore公司）；Quintix2102-1CN電子天平[賽多利斯儀器（北京）系統(tǒng)有限公司]；可調移液器（芬蘭百得公司）；Proline Prospenser瓶口分液器（芬蘭百得公司）；自動渦旋儀（逗點生物有限公司）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速離心機（Sigma Laborzentrifugen GmgH）；固相萃取儀（上海喬躍電子有限公司）；玉米赤霉烯酮免疫親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司）。

玉米赤霉烯酮標準溶液（Pribolab Pte.Ltd.Singapore.）；甲醇、乙腈（色譜純，上海安譜）；試驗用水均為超純水（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

所有樣品經粉碎及混勻后，用電子天平稱取 10 g（精確至0.01 g）置于50 mL聚氟乙烯具塞離心管中，加入1 g氯化鈉和20.00 mL乙腈-水（9+1，V/V）提取液，擰緊瓶蓋，于自動渦旋儀渦旋5 min，超聲30 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液1.00 mL加入4.00 mL水渦旋混合，6 000 r/min離心5 min，取上清液2.50 mL自然重力緩慢過免疫親和柱，用40 mL超純水分次淋洗，棄去全部流出液后，抽取真空至無液體流出，用5 mL甲醇分次進行洗脫，50 ℃下氮氣吹干，用1.00 mL乙腈-甲醇-水（46∶46∶8，V/V/V）復溶，待漩渦混合均勻后，過0.45 μm有機相微孔過濾膜，上機分析。

1.3.2 儀器條件

色 譜 柱：Eclipse plus C18（100 mm×4.6 mm， 3.5 μm）；柱箱溫度：30.0 ℃；柱流量：0.80 mL/min；進樣體積：20.00 μL；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長λ=274 nm，發(fā)射波長λ=440 nm；流動相：乙腈-甲醇-水（46∶46∶8，V/V/V）等度洗脫。保留時間定性，外標法定量。

1.3.3 標準曲線和精密度試驗

準確吸取濃度為100.1 μg/mL的玉米赤霉烯酮標準溶液1.00 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈-甲醇-水（46∶46∶8，V/V/V）流動相定容至100 mL，搖勻，即得1.001 μg/mL的玉米赤霉烯酮標準儲備液。用流動相稀釋配制5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、15.00 ng/mL、20.00 ng/mL、30.00 ng/mL和50.00 ng/mL的標準使用系列溶液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。計算結果時需扣除空白值，檢測結果以2次測定值的算術平均值表示。所有樣品按雙平行測定，以重復性條件下獲得的2次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%，考查檢測方法的精密度。試樣中玉米赤霉烯酮含量的計算公式如下：

式中：X為試樣中玉米赤霉烯酮的含量，μg/kg；m為試樣的質量，g；ρ為試樣測定液中玉米赤霉烯酮的濃度，ng/mL；V1為試樣提取液體積，mL；V2為過柱凈化試樣提取液體積，mL；V3為測定液最終定容體積，mL；1 000為單位換算常數(shù)。

1.3.4 添加回收率試驗和檢出限

加標樣品處理方法為在樣品中分別加入1.00 mL和2.00 mL的1.001 μg/mL的標準儲備液，兩個濃度水平進行水平行加標，按照樣品處理方法制備。分別做平行測定，考查測定方法的準確性。以3倍信噪比，考慮稱樣量及體積計算實際檢出限。檢出限計算公式如下：

式中：LOD為檢出限，μg/kg；ρ為標準溶液濃度，ng/mL；m為試樣的質量，g；f為稀釋倍數(shù)；S/N為儀器測定的信噪比。

2 結果與分析

2.1 條件優(yōu)化

本試驗采用免疫親和前處理技術提取食品中的玉米赤霉烯酮，與《食品安全國家標準 食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209—2016）檢測方法相比，本方法檢測糧食樣品質量由40 g降低為10 g，提取容器采用的是50 mL具塞離心管，便于離心分離，采用離心方式進行固液分離，而非濾紙過濾分離也縮短了分離時間，提高了檢測效率，適合大批量樣品同時進行提取。

2.2 標準曲線及線性關系

試驗結果顯示，該方法檢測玉米赤霉烯酮保留時間在5.809 min，在5.00～50.00 ng/mL具有良好的線性關系，y=0.021 33x+0.002 95，標準曲線的相關系數(shù)為0.999 91，具體見圖1、圖2。

圖1 標準曲線及線性關系結果

圖2 標準品的色譜圖

2.3 檢出限

該方法的實際檢出限為3.89 μg/kg。標準方法中對糧食和糧食制品中玉米赤霉烯酮的檢出限為 5 μg/kg，定量限為17 μg/kg；酒類中玉米赤霉烯酮的檢出限為20 μg/kg，定量限為66 μg/kg；醬油、醋、醬及醬制品中玉米赤霉烯酮的檢出限為50 μg/kg，定量限為165 μg/kg；大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的檢出限為10 μg/kg，定量限33 μg/kg。該方法的檢出限均小于標準方法中的檢出限。

2.4 樣品檢測結果

本次抽檢的7份樣品中，按低于檢出限為未檢出，樣品均未檢出玉米赤霉烯酮。

2.5 加標回收率及精密度

在樣品中按100.1 ng/kg及200.2 ng/kg的水平加入玉米赤霉烯酮標準溶液，計算該方法的回收率，均進行平行測定。結果顯示，該方法的樣品回收率為83.9%～95.9%，相對標準偏差為0.2%～8.7%，表明該方法準確度高，精密度好。結果見表1。

表1 樣品檢測結果及加標回收試驗結果

3 結論

本研究優(yōu)化了各類食品中玉米赤霉烯酮的免疫親和-高效液相色譜檢測方法。該方法標準曲線線性良好，濃度范圍寬，靈敏度高，樣品適用范圍廣，具有較高的精密度和準確度，檢出限較低，檢測效率高，能同時處理大批量樣品，對大部分檢測實驗室均適用。隨著檢測技術的不斷提升，氣相色譜質譜聯(lián)用、液相色譜質譜聯(lián)用技術可實現(xiàn)多種毒素的同時檢測，檢測的靈敏度、結果穩(wěn)定性、重現(xiàn)性進一步提高，但檢測儀器價格昂貴。因此，應根據(jù)實際需求選擇合理的檢測方法[4-5]。