檢測實驗室參加畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留能力驗證 質(zhì)量控制探索

滕 爽，呂青骎，包月紅，錢 行，王 瑋

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（南京），江蘇南京 210095）

能力驗證（Proficiency Testing，PT）是利用實驗室間比對，按照預(yù)先制定的準則評價參加者的能 力[1-4]。對于食品檢驗機構(gòu)來說，能力驗證是重要的外部質(zhì)量評價活動和實驗室質(zhì)量監(jiān)控的重要手段，是實驗室認可機構(gòu)和實驗室用戶評定食品檢測實驗室檢測能力的主要依據(jù)之一，也是食品檢測實驗室進行自我評定的重要尺度[5-8]。食品檢驗機構(gòu)通過參加能力驗證，可以全面檢驗實驗室的各方面工作，提升檢驗人員的檢測能力和質(zhì)量體系的管理水平，為實驗室提供評價其出具數(shù)據(jù)可靠性和有效性的客觀證 據(jù)[9-14]。檢測實驗室每年制定質(zhì)量控制計劃，定期參加能力驗證，是保證檢測能力水平的重要手段，也是資質(zhì)認定和機構(gòu)考核的必須要求。

隨著國民經(jīng)濟水平的提高，人們對畜禽產(chǎn)品的需求日益增多，在促進我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的同時，因用藥不當?shù)纫蛩兀F藥殘留嚴重危害我國畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全，并對消費者的身體健康和生命安全造成了嚴重的危害[15-17]。獸藥主要包括抗生素類、驅(qū)腸蟲藥類、生長促進劑類、抗原蟲藥類、滅錐蟲藥類、鎮(zhèn)靜劑類和β-腎上腺素能受體阻斷劑等七大類[18]?；前奉悾⊿ulfonamides，SAs）和氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）藥物，作為廣譜抗菌藥，因其具有抗菌譜廣、抗菌能力強、價格低廉等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中[19-22]。飼養(yǎng)過程中濫用抗菌藥物，會在動物體內(nèi)造成藥物殘留，經(jīng)食物鏈進入人體后，對人的身體健康造成嚴重危害，并導(dǎo)致許多細菌產(chǎn)生耐藥性[23-27]。我國2019年發(fā)布的《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中明確規(guī)定在動物性食品中的磺胺類、氟喹諾酮類獸藥最大殘留限量（Maximum Residue Limits，MRLs）[28]。目 前 檢 測 動 物 源 性食品中的氟喹諾酮和磺胺的標準方法主要為液相 色 譜 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLCMS/MS），而HPLC法是目前常用的比較經(jīng)濟實用的檢測手段，既可滿足動物性食品中獸藥殘留的準確定性、定量檢測，也由于價格因素配置普遍，更適用于各類基層檢驗檢測實驗室[29-36]。

為提升和強化檢測實驗室對畜禽產(chǎn)品中的獸藥殘留檢測能力，本實驗室連續(xù)多年參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管司組織的畜禽產(chǎn)品中的獸藥殘留能力驗證?？己隧椖堪u肉中的恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、沙 拉 沙 星（Sarafloxacin，SAR）和 達 氟 沙 星（Danofloxacin，DAN），豬 肉中 的 磺 胺 二 甲 基 嘧 啶（Sulfamethazine，SM2）、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺 胺 甲 噁 唑（Sulfamethoxazole，SMZ）、磺 胺 二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）和磺胺喹噁啉（Sulfamethoxazole，SQ）。本文就2020—2021年參加畜禽產(chǎn)品中的獸藥殘留能力驗證過程、結(jié)果進行分析，討論檢測過程中質(zhì)量控制的關(guān)鍵點，總結(jié)能力驗證過程中把握關(guān)鍵點獲得滿意結(jié)果的經(jīng)驗，以期為各級各類農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測實驗室通過能力驗證和提升檢測質(zhì)量提供一定的路徑與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉（含磺胺類藥物）能力驗證樣品、雞肉（含氟喹諾酮類藥物）能力驗證樣品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；磺胺類藥物陰性生鮮豬肉和氟喹諾酮類藥物陰性生鮮雞肉均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（南京）提供。

標準物質(zhì)：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、鹽酸沙拉沙星、甲磺酸達氟沙星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉（德國Dr. Ehrenstofer公司）。

乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，美國Fisher公司）；磷酸（H3PO4）、氫氧化鈉（NaOH）、三乙胺（C6H15N）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、冰乙酸（CH3COOH）、正丙醇（C3H7OH）和無水硫酸鈉（Na2SO4）（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水均為一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀（配2489紫外檢測器、2475熒光檢測器）、堿性氧化鋁固相萃取柱 （2 g/6 mL，美 國Waters公 司）；XS105電 子 天平（感 量0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo公司）；PRACTUM612-1CN電 子 天 平（感 量0.01 g）、advance EDI& pro VF純水儀、D-16C臺式冷凍離心機（德國Sartorious公司）；VORTEX GENIUS3渦旋混勻器、HS 501數(shù)顯型混勻器（德國IKA公司）；STAR A221 pH測定儀、Syncronis C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm， 5 μm）（美國Thermo公司）；Bond Elut C18固相萃取柱（200 mg/3 mL，美國Agilent公司）。

1.3 實驗方法

根據(jù)能力驗證文件規(guī)定，各單位可自行選擇現(xiàn)行有效，且有檢測限和（或）定量限以及回收率規(guī)定的方法。因此，本實驗室分別采用農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測 高效液相色譜法》和農(nóng)質(zhì)發(fā)〔2014〕5號文附件8《磺胺類藥物在動物可食性組織中殘留的高效液相色譜檢測方法》，進行雞肉中氟喹諾酮類獸藥殘留和豬肉中磺胺類獸藥殘留考核。

1.3.1 氟喹諾酮類藥物殘留檢測前處理

稱取2.00 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL離心管中（能力驗證樣品使用領(lǐng)樣的離心管，無需轉(zhuǎn)移，以免損失和污染），加10.0 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=7），渦旋振蕩1 min，使肉樣完全分散，超聲萃取5 min后，280 r/min中速振蕩20 min， 4 ℃下10 000 r/min離心5 min，取上清液于另一新的 50 mL離心管中。殘渣中加入10.0 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7），渦旋1 min，280 r/min中速振蕩10 min，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，合并2次上清液，混勻，備用。

取5.00 mL上清液，經(jīng)過依次用2 mL甲醇、 2 mL磷酸鹽緩沖溶液預(yù)洗的Bond Elut C18固相萃取柱；用1 mL一級水淋洗，擠干；再用2.00 mL 0.05 mol/L磷酸溶液∶三乙胺-乙腈（82∶18，v∶v）洗脫，擠干，收集洗脫液；經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后作為試樣溶液。

1.3.2 磺胺類藥物殘留檢測前處理

稱取5.00 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL離心管中（能力驗證樣品使用領(lǐng)樣的離心管，無需轉(zhuǎn)移，以免損失和污染），加入4 g無水硫酸鈉，15 mL乙腈，渦旋1 min，使肉樣完全分散，混勻器上280 r/min振蕩20 min，4 ℃下8 000 r/min速度離心5 min，將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，下層殘渣加15 mL乙腈，渦旋混勻1 min，4 ℃下8 000 r/min速度離心 5 min，合并2次上清液于同一離心管中，加入10 mL 正己烷，280 r/min振蕩5 min，4 ℃下8 000 r/min速度離心5 min，取下層液體，加入5 mL正丙醇， 50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加3 mL 95%乙腈溶液，渦旋混合1 min，超聲2 min，作為備用液。

將上述備用液全部經(jīng)過3 mL 95%乙腈溶液活化的堿性氧化鋁小柱，用5 mL 95%乙腈溶液洗滌雞心瓶后過柱，擠干；用10 mL 70%乙腈溶液洗脫，收集洗脫液；加入5 mL正丙醇，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入2.00 mL乙腈∶甲醇∶水∶冰醋酸（2.0∶2.0∶9.0∶0.2，v∶v∶v∶v）溶解，渦旋混合1 min，過0.45 μm濾膜后，采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定。

1.3.3 標準溶液的配制

（1）氟喹諾酮標準儲備液。精密稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、鹽酸沙拉沙星各50 mg（精確至0.01 mg），甲磺酸達氟沙星10 mg（精確至0.1 mg）于50 mL容量瓶中，用0.03 mol/L NaOH溶液溶解并稀釋定容，分別得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星和質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的達氟沙星的單支標準儲備液。

（2）氟喹諾酮混合標準工作液。準確移取質(zhì)量濃度為1 mg/mL的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星和質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的達氟沙星的標準儲備液各100 μL于100 mL容量瓶中，乙腈稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星和質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL的達氟沙星的氟喹諾酮混合標準工作液。

（3）磺胺標準儲備液。精密稱取磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉各10 mg（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容，分別得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的5種磺胺單支標準儲備液。

（4）磺胺混合標準工作液。準確移取5種磺胺儲備液100 μL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋并定容，得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的磺胺混合標準 工作液。

1.3.4 色譜條件方法建立

（1）氟喹諾酮類獸藥殘留的測定。流動相A： 0.05 mol/L磷酸溶液-三乙胺∶乙腈（82∶18，v∶v）；流速：0.8 mL/min；熒光檢測器：激發(fā)波長280 nm；發(fā)射波長450 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

（2）磺胺類獸藥殘留的測定。流動相B：乙腈∶甲醇∶水∶冰醋酸（2.0∶2.0∶9.0∶0.2，v∶v∶v∶v）；流速：1 mL/min；紫外檢測器：檢測波長270 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.5 標準曲線的制定

（1）氟喹諾酮標準曲線。準確量取1.3.3中配制的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星和達氟沙星混合標準工作液，用流動相A將恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星稀釋成質(zhì)量濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、 20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL和達氟沙星質(zhì)量濃 度 為1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL和 20 ng/mL系列混合標準溶液。

（2）磺胺標準曲線。準確量取1.3.3中配制的適量磺胺混合標準工作液，用流動相B稀釋成質(zhì)量 濃 度 為0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、 1.00 μg/mL和5.00 μg/mL系列混合標準溶液。

以上溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，以峰面積為縱坐標，對應(yīng)的標準溶液濃度為橫坐標，Empower軟件繪制標準曲線。

1.3.6 精密度和加標回收實驗

（1）精密度。畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留能力驗證考核樣品均為平行雙樣，在同等條件下進行樣品處理，每個樣品重復(fù)測定3次，計算平均值，并根據(jù)平行樣品的檢測結(jié)果計算精密度。

（2）加標回收實驗。在空白雞肉中分別添加 40 μg/kg、100 μg/kg共2個水平的氟喹諾酮類獸藥混合標準品，在空白豬肉中分別添加50 μg/kg、100 μg/kg 2個水平的磺胺類獸藥混合標準品，每個濃度設(shè)3個平行，以平均回收率（Recovery）評價本批次試驗的準確度，并根據(jù)平行樣品的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）評價精密度。

1.3.7 結(jié)果計算

根據(jù)保留時間定性，外標法定量。試樣中氟喹諾酮類含量按式（1）計算：

式中：X為氟喹諾酮類殘留量，μg/kg；c為經(jīng)標準曲線計算氟喹諾酮殘留的濃度，ng/mL；m為樣品質(zhì)量，g。

試樣中磺胺類含量按式（2）計算：

式中：X為磺胺類殘留量，μg/kg；c為經(jīng)標準曲線計算磺胺殘留的濃度，μg/mL；m為樣品質(zhì)量，g。

計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 能力驗證樣品測定

能力驗證樣品經(jīng)前處理后上機檢測，按照1.3.5繪制標準曲線，氟喹諾酮類獸藥在5～100 ng/mL（其中達氟沙星1～20 ng/mL）、磺胺類獸藥在0.05～5.00 μg/mL，所有獸藥目標物標準曲線相關(guān)系數(shù)（Correlation Coefficient，R）均達到0.999，能夠準確地進行外標法定量。由表1和表2可知，雞肉能力驗證樣品中分別檢出恩諾沙星（60.0 μg/kg）和環(huán)丙沙星（70.0 μg/kg），RSD≤4.040%；豬肉能力驗證樣品中分別檢出磺胺二甲氧嘧啶（110.0 μg/kg）和磺胺喹噁啉（105.0 μg/kg），RSD≤1.540%。

表1 雞肉中氟喹諾酮能力驗證的檢測結(jié)果

表2 豬肉中磺胺能力驗證的檢測結(jié)果

2.2 加標回收實驗

為驗證能力驗證試驗的準確度和精密度，檢測考核樣時同批次進行2個濃度水平的陽性添加試驗。由表3和表4可知，雞肉中恩諾沙星回收率為85.0%～92.0%，RSD≤2.620%；環(huán)丙沙星回收率為84.0%～90.0%，RSD≤1.580%。豬肉中磺胺二甲氧嘧啶回收率為80.4%～92.0%，RSD≤3.810%；磺胺喹噁啉回收率為80.8%～91.8%，RSD≤4.460%。本試驗獸藥殘留檢出的回收率均高于80%，RSD小于7.000%，滿足HPLC法檢測獸藥殘留的準確度和精密度要求，檢測過程中準確度較高。

表3 空白雞肉中四種氟喹諾酮類藥物添加回收率及精密度（n=3）

表4 空白豬肉中五種磺胺類藥物添加回收率及精密度（n=3）

3 討論與結(jié)論

3.1 質(zhì)量控制措施

為確保能力驗證檢測結(jié)果的準確性，實驗室在試驗準備、實施過程、結(jié)果報送中分別按照以下7個方面進行質(zhì)量控制。

3.1.1 人員

實驗室人員需經(jīng)過培訓(xùn)和考核后方可上崗工作，并通過各類培訓(xùn)、內(nèi)部考核、質(zhì)量監(jiān)督等方式持續(xù)提高和考核其業(yè)務(wù)能力。實驗室在多年能力驗證的考核中采用骨干引領(lǐng)和以老帶新模式，不斷為實驗室的持續(xù)發(fā)展培養(yǎng)人才。

3.1.2 儀器與耗材

能力驗證試驗中使用的液相色譜儀、電子天平、移液器等儀器，對于檢測結(jié)果有重要影響，必須在檢定校準有效期內(nèi)，可以正常使用。除常規(guī)儀器外，色譜柱作為HPLC法分離的核心，其型號的選擇也十分重要，有助于提高實驗室分析效率。實驗室在本項能力驗證中選用Syncronis C18色譜柱（美國Thermo Fisher公司），其保留時間和峰面積的重現(xiàn)性優(yōu)異，能滿足HPLC法測定畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測要求。此外，為保證能力驗證中色譜柱的分離選擇性能，實驗室的色譜柱專項專用。

3.1.3 樣品

能力驗證考核樣品應(yīng)置于低溫、密封條件下保存。若收到樣品無法立即進行檢測時，應(yīng)將其置于 -20 ℃下儲存。試驗中質(zhì)量控制需要進行空白對照和陽性添加，實驗室需準備空白樣品作為空白基質(zhì)。實驗室在能力驗證實驗前應(yīng)對準備的新鮮雞肉、豬肉空白基質(zhì)進行儀器確證為陰性，同時還要確保試劑、環(huán)境、儀器設(shè)備對檢測結(jié)果無干擾，以確保能力驗證工作的順利開展。

3.1.4 標準物質(zhì)

實驗室為確保出具數(shù)據(jù)的準確性、公正性和權(quán)威性，應(yīng)使用有證標準物質(zhì)進行分析測定，可以量值溯源到國家基準。實驗室從保存期和穩(wěn)定性角度考慮，首選固體標準物質(zhì)，待使用時將其配制成標準儲備溶液，再逐步稀釋成標準工作溶液，以便獲得準確的定量結(jié)果。此外，實驗室在計算固體標準物質(zhì)配制成標準儲備液的質(zhì)量濃度時，需以折鹽和含量后的藥物單體計算。

3.1.5 方法

實驗室采用的檢測方法應(yīng)同時滿足適應(yīng)能力驗證要求和本實驗室實際情況。實驗室在能力驗證中為獲得穩(wěn)定和準確的定量結(jié)果，在HPLC-MS/MS和HPLC方法中，選擇了可避免基質(zhì)效應(yīng)的HPLC法。

3.1.6 平行試驗

平行試驗結(jié)果是判斷檢測結(jié)果準確性的重要依據(jù)之一。本能力驗證考核組織單位提供2個平行樣品，每個樣品經(jīng)前處理后上機測定，需重復(fù)測定3次，以獲得該樣品的檢測值，并計算RSD，以考察其精密度是否滿足檢測要求。

3.1.7 加標回收

加標回收檢測結(jié)果是判斷同批次其他樣品檢測質(zhì)量的依據(jù)。加標回收試驗一般在空白樣品中進行添加，添加量為定量限（Limit of Quantitation，LOQ）1～5倍質(zhì)量濃度。實驗室綜合考慮方法LOQ、MRLs和檢測線性范圍，雞肉中氟喹諾酮能力驗證考核選擇2倍LOQ和MRLs進行陽性添加，而豬肉中磺胺能力驗證考核選擇1倍LOQ和MRLs進行陽性添加。陽性添加樣品與考核樣品和空白對照樣品應(yīng)同時測定，其中空白對照可避免試驗過程中的污染和干擾，而陽性添加可確保本批次試驗的準確度和精密度。

3.2 結(jié)論

實驗室參加能力驗證是一項綜合性考核工作，實驗室在多年的能力驗證工作中，通過梳理質(zhì)量控制的關(guān)鍵因素，并在實踐中予以驗證，有效提升了實驗室的質(zhì)量體系管理水平和檢測質(zhì)量，為實驗室順利通過能力驗證提供了正確路徑。本實驗室自2015年來參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管司組織的畜禽產(chǎn)品中的獸藥殘留能力驗證，以人員、儀器與耗材、樣品、標準物質(zhì)、方法、平行試驗和加標回收檢測7個方面為抓手，在提高實驗室的檢測質(zhì)量的同時，其能力驗證也均獲得了滿意結(jié)果。