益生元對(duì)益生菌生長(zhǎng)代謝的研究

王 新，王 利，王青云，王占東，張居典

（北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150078）

隨著人們生活水平及健康意識(shí)的提高，益生菌及益生元越來(lái)越多的被用于酸奶發(fā)酵。益生菌是一類可定植于腸道，可改善人體微生態(tài)平衡，發(fā)揮有益作用并且具有生物活性的微生物總稱。益生菌具有改善腸胃、防治腹瀉、增強(qiáng)人體免疫力等功效[1]。益生元不被宿主消化吸收，但可被益生菌利用發(fā)酵，從而促進(jìn)腸道益生菌的繁殖和新陳代謝，是一類可以改善宿主健康的功能物質(zhì)。目前常用的益生元是功能性低聚糖，一般由2～10個(gè)單糖分子組成，具有一定功能特性，屬于寡糖類物質(zhì)[2-3]。將益生元應(yīng)用在益生菌酸奶中，具有協(xié)同增效的作用。益生元作為益生菌的養(yǎng)料，選擇性刺激益生菌繁殖、促進(jìn)代謝，賦予益生菌在菌群中的優(yōu)勢(shì)，從而有益宿主健康[4]。本研究選取低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉6種益生元成分，選取復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）為益生菌，益生元單獨(dú)與復(fù)合益生菌組合制備益生菌酸奶，通過(guò)測(cè)定益生菌酸奶的活菌數(shù)、胞外多糖產(chǎn)量、產(chǎn)酸能力和風(fēng)味物質(zhì)雙乙酰含量等指標(biāo)，為益生元在益生菌酸奶中的研究與應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低聚果糖；低聚半乳糖；低聚異麥芽糖；低聚木糖；聚葡萄糖；抗性糊精；菊粉；復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）；液體MRS培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

天平、pH計(jì)、生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、離心機(jī)、燒杯、稱量勺和溫度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

（1）液體MRS培養(yǎng)基（葡萄糖培養(yǎng)基）的制備。葡萄糖20 g、牛肉浸粉10 g、蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、CH3COONa·3H2O 5 g、檸檬酸三銨2 g、吐溫-80 1 mL、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、Mn-SO4·4H2O 0.05 g，定溶于1 L去離子水中，115 ℃滅菌20 min[5]。

（2）益生元培養(yǎng)基的制備。益生元培養(yǎng)基不添加葡萄糖，其他成分相同，葡萄糖分別用20 g/L低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉替代，添加的益生元均經(jīng)過(guò)0.22 μm水相過(guò)濾器過(guò)濾。

1.3.2 菌種活化

將冷凍保藏的0.1 g復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）凍干粉接入活化培養(yǎng)基，振蕩使菌體混合均勻，37 ℃，厭氧條件下振蕩培養(yǎng)24 h。所得菌液按體積分?jǐn)?shù)10%接入新的活化培養(yǎng)基，37 ℃，厭氧條件下培養(yǎng)24 h，制得菌種母液[6]。

1.3.3 乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

葡萄糖培養(yǎng)基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養(yǎng)基，接種量為1%，置于37 ℃，厭氧培養(yǎng)48 h后測(cè)乳酸菌活菌數(shù)。乳酸菌菌落總數(shù)測(cè)定參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》 （GB 4789.35—2016），分析發(fā)酵過(guò)程中益生元對(duì)益生菌促增殖能力的影響。

1.3.4 產(chǎn)酸能力測(cè)定

葡萄糖培養(yǎng)基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養(yǎng)基，接種量為1%，置于37 ℃中，厭氧培養(yǎng)48 h后，使用pH計(jì)對(duì)酸度進(jìn)行測(cè)定，分析發(fā)酵過(guò)程中益生元對(duì)益生菌促產(chǎn)酸能力的影響。

1.3.5 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定

葡萄糖培養(yǎng)基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養(yǎng)基，接種量為1%，置于37 ℃中，厭氧培養(yǎng)48 h后，取10 mL發(fā)酵液，離心處理（4 000 r/min， 15 min），取上清液，用濃度為1 mol/L的NaOH將上清液調(diào)整pH至7.5，加入1/10體積的胰蛋白酶液（質(zhì)量濃度為3 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用），40 ℃水浴酶解 2.5 h。加入1/3體積Sevag液（氯仿∶正丁醇=3∶1，體積比），振搖30 min，離心（4 000 r/min，15 min），除去沉淀，重復(fù)1次。加入3～5倍體積的乙醇（體積分?jǐn)?shù)為95%），充分振蕩（多糖呈絮狀沉淀析出），離心（4 000 r/min，15 min），得沉淀。將沉淀用丙酮洗滌脫水2次，干燥得白色粉末即為多糖,采用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖的質(zhì)量濃度[7-8]。

1.3.6 雙乙酰產(chǎn)量測(cè)定

葡萄糖培養(yǎng)基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養(yǎng)基，接種量為1%，置于37 ℃中，厭氧培養(yǎng)48 h后測(cè)定樣本中的雙乙酰含量，選擇鄰苯二胺比色法測(cè)定雙乙酰含量，鄰苯二胺和雙乙酰反應(yīng)合成2,3-二甲喹喔啉，該化合物在335 nm下具有最大吸收峰[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

由表1可知，低聚木糖培養(yǎng)基中的乳酸菌活菌數(shù)含量最高，為2.2×109CFU/g，然后依次為低聚半乳糖、低聚果糖、抗性糊精、菊粉、低聚異麥芽糖、聚葡萄糖和葡萄糖，整體看來(lái)與葡萄糖碳源比較，7種益生元均對(duì)益生菌有增殖作用。益生元可促進(jìn)益生菌繁殖，原理是菌體通過(guò)分泌相關(guān)酶作用于益生元，將其分解為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)菌體代謝與繁殖[11]。益生菌酸奶的功能性主要取決于活菌數(shù)的多少，若要酸奶中的益生菌定植于腸道并發(fā)揮作用，攝入量是關(guān)鍵。

表1 不同益生元對(duì)益生菌活菌數(shù)的影響

2.2 產(chǎn)酸能力測(cè)定

由圖1可知，低聚木糖培養(yǎng)基pH值最低為3.71，pH值由低到高依次為低聚木糖、低聚半乳糖、低聚果糖、抗性糊精、菊粉、低聚異麥芽糖、聚葡萄糖和葡萄糖，pH越低說(shuō)明產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，益生元促進(jìn)益生菌的產(chǎn)酸能力與益生元促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)呈正相關(guān)。益生菌在益生元的作用下快速繁殖，此過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸，可有效降低pH值。在人體腸道中，適宜的pH值有利于維持益生菌的黏附能力，促進(jìn)其生長(zhǎng)和定殖，腸道pH值降低可有效抑制有害菌的繁殖，促進(jìn)益生菌的繁殖[12]。

圖1 不同益生元對(duì)益生菌產(chǎn)酸能力的影響

2.3 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定不同培養(yǎng)基胞外多糖產(chǎn)量，如圖2所示?？剐院囵B(yǎng)基胞外多糖產(chǎn)量最高，然后依次為聚葡萄糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖和葡萄糖。胞外多糖是乳酸菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到胞外、具有獨(dú)特理化性質(zhì)和生理功能的一類高分子糖類化合物，屬于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物。胞外多糖除了具有增稠、保濕、乳化和穩(wěn)定等常規(guī)理化特性外，還具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低膽固醇以及調(diào)節(jié)胃腸道等多種生理功能[13-14]。

圖2 不同益生元對(duì)益生菌胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.4 雙乙酰產(chǎn)量測(cè)定

采用鄰苯二胺比色法測(cè)定不同培養(yǎng)基雙乙酰產(chǎn)量，如圖3所示。低聚果糖培養(yǎng)基雙乙酰產(chǎn)量最高，然后依次為抗性糊精、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖、低聚木糖、葡萄糖和聚葡萄糖。在發(fā)酵乳制品的風(fēng)味中,雙乙酰被認(rèn)為是重要的風(fēng)味物質(zhì),它可以賦予產(chǎn)品以獨(dú)特的芳香風(fēng)味[15]。研究雙乙酰的生成途徑、生成條件及代謝方式，有助于改善發(fā)酵乳制品的風(fēng)味品質(zhì)。

圖3 不同益生元對(duì)益生菌雙乙酰產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

益生菌和益生元對(duì)維持腸道運(yùn)轉(zhuǎn)穩(wěn)定和人體微生態(tài)健康具有重要意義。益生菌與益生元組合使用，具有協(xié)同增效的優(yōu)勢(shì)，益生元是益生菌的養(yǎng)料，并且具有選擇刺激益生菌生長(zhǎng)、激活益生菌代謝，賦予益生菌優(yōu)勢(shì)性能。根據(jù)上述試驗(yàn)探究得到，益生元的使用可增加益生菌單獨(dú)使用的功效，提高其活菌數(shù)以及產(chǎn)酸能力，促進(jìn)其代謝產(chǎn)物的增加。低聚木糖可有效促進(jìn)復(fù)合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）的增殖，提高其產(chǎn)酸能力；抗性糊精可顯著提高胞外多糖的生成；低聚果糖對(duì)代謝過(guò)程雙乙酰的生成具有明顯作用。以上研究對(duì)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義，對(duì)后期復(fù)合益生元的研究提供了一定基礎(chǔ)。