東海烏參皂苷提取工藝優(yōu)化與抗氧化研究

葉大天，陳 偉，林 琳，張雷芳，鄭 斌，聞?wù)?/p>

(浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022)

東海烏參Acaudina leucoprocta 是芋參目Molpadida、尻參科Caudinidae、海地瓜屬Acaudina 動物[1]。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)海地瓜不僅富含多種維生素、蛋白質(zhì)、微量元素，并且也含有海地瓜皂苷和多糖[2]。近年來，有學(xué)者對東海烏參蛋白肽進(jìn)行了研究，借助蛋白酶解和自溶的技術(shù)，從而獲得了高得率的蛋白肽[3]；也有學(xué)者對東海烏參多糖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析并對其抗凝血活性研究[4]，但對東海烏參皂苷的研究鮮有報(bào)道。天然存在的皂苷是類固醇、生物堿和三萜的糖苷，它廣泛分布在自然界中[5]。研究表明皂苷具有抗腫瘤、降血脂、改善非酒精性脂肪肝、抑制脂肪蓄積、抗炎等多種生物學(xué)特性[6-7]。此外皂苷還具有治療臨床抑郁癥的潛力[8]。海參皂苷存在于其體壁和居維氏小管中[9]，其在改善高脂飲食引起的肥胖、抗癌等方面發(fā)揮作用[10-11]。實(shí)驗(yàn)利用乙醇-水作為溶劑，對東海烏參皂苷進(jìn)行提取并優(yōu)化工藝條件，并對東海烏參總皂苷的抗氧化能力進(jìn)行研究，以期為東海烏參皂苷的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

東海烏參:東海烏參凍品，解凍后剪碎，置烘箱低溫烘干后，粉碎成粉末待用；人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品（源葉生物）；無水乙醇、香草醛、正丁醇、鹽酸、Tris-HCl（分析純AR，國藥集團(tuán)）；冰醋酸、濃硫酸、DPPH（分析純AR，阿拉?。?；鄰苯三酚（分析純AR，安耐吉）；硫酸亞鐵、水楊酸（分析純AR，麥克林）；H2O2（分析純AR，南京化學(xué)試劑）；維生素C（分析純AR，Sigma）。

1510 酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；N-1100 旋蒸儀（上海愛朗儀器有限公司）；B-260 水浴鍋（上海亞榮儀器有限公司）；JM-B1003 天平（上海數(shù)誼電子衡器有限公司）；BSA124S 分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 皂苷提取

稱取東海烏參粉末10 g，根據(jù)設(shè)定的乙醇濃度，加入一定料液比的乙醇水溶液，置入恒溫水浴鍋中，加熱提取一定時(shí)間后，過濾取上清，殘?jiān)貜?fù)之前的操作，提取3 次，合并上清液。上清旋蒸濃縮成膏狀，加入一定體積的蒸餾水充分溶解，得到待測溶液。

1.2.2 皂苷含量測定

精準(zhǔn)配制0.2 mg·mL-1的人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)溶液，將0、40、80、120、160、200 μg（分別相當(dāng)于吸取人參皂苷0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到玻璃試管中，置于水浴鍋中加熱蒸干，然后加入0.2 mL 的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL 的高氯酸，置于水浴鍋中60 ℃水浴15 min，接著冰浴5 min，然后加入5 mL 的冰醋酸，將溶液搖晃均勻后，靜置10 min，在548 nm 下測定其吸光度[12]。而后，以加入的人參皂苷的樣品量為橫坐標(biāo)，樣品的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of ginsenoside Re

吸取200 μL 待測樣品溶液于小試管內(nèi)，水浴蒸干，參照上述方法處理后在548 nm 下測定其吸光度，根據(jù)公式計(jì)算得到皂苷的得率。

式中:X 為測定的試樣中總皂苷的得率，%；m 為樣品加入的質(zhì)量，g；m1為通過吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得測定樣品的皂苷含量，g；V1為樣品提取液總體積，mL；V 為樣品提取液中用于測定的體積，mL。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定料液比為1：10 g·mL-1，提取時(shí)間為3 h，提取溫度為70 ℃，探究不同乙醇濃度（30%、45%、60%、75%、90%）對皂苷得率的影響；固定乙醇濃度為60%，提取時(shí)間為3 h，提取溫度為70 ℃，探究不同的料液比（1：4、1：7、1：10、1：13、1：16 g·mL-1）對皂苷得率的影響；固定乙醇濃度為60%，料液比為1：10 g·mL-1，提取溫度為70 ℃，探究不同提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對皂苷的得率的影響；固定乙醇濃度為60%，料液比為1：10，提取時(shí)間為3 h，探究不同的提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對皂苷得率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定各因素適宜的提取條件，通過實(shí)驗(yàn)的因素的個(gè)數(shù)和水平數(shù)來選取正確的正交試驗(yàn)表，實(shí)驗(yàn)選取正交表L9(34)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（表1），確定最佳的工藝條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels in orthogonal test

1.2.5 東海烏參總皂苷抗氧化活性研究

1.2.5.1 待測樣品處理

用優(yōu)化的工藝條件提取粗提液，旋蒸濃縮后，以1:1 比例用正丁醇萃取3 次，所得萃取液經(jīng)旋蒸后溶于水中，過HP20 大孔樹脂，首先用水和20%乙醇溶液洗脫多糖蛋白等雜質(zhì)，再用80%乙醇洗脫，最后用100%乙醇洗脫小極性的物質(zhì)，收集80%乙醇洗脫液，旋蒸濃縮凍干后得到東海烏參總皂苷以供測定。

1.2.5.2 東海烏參總皂苷清除超氧陰離子自由基能力的測定

配置濃度為2.0、4.0、6.0、8.0 以及10.0 mg·L-1總皂苷和維生素C 溶液。將2.25 mL 的Tris-HCl 溶液（0.1 mol·L-1，pH 8.2）加入試管內(nèi)，在25 ℃水浴20 min，加入500 μL 待測液與250 μL 鄰苯三酚溶液（25 mmol·L-1），在室溫下反應(yīng)5 min，然后加入0.5 mL 的HCl 溶液（8%）。靜置一段時(shí)間后取樣，在325 nm波長下測定其吸光度。其中樣品本底組需將等體積的去離子水替換為鄰苯三酚溶液（25 mmol·L-1），空白組則需要以等體積的去離子水替換樣品溶液。

式中:C 為清除率，%；P0為空白組吸光度，nm；PX為樣品組吸光度，nm；PX0為本底組吸光度，nm。

1.2.5.3 東海烏參總皂苷清除羥基自由基能力的測定

配置濃度為2.0、4.0、6.0、8.0 以及10.0 mg·mL-1總皂苷和維生素C 溶液。將500 μL 的樣品加入試管中，依次加入0.5 mL FeSO4溶液（6 mmol·mL-1）與1 mL 水楊酸乙醇溶液（6 mmol·mL-1）以及1 mL H2O2溶液（6 mmol·mL-1）混勻。將樣品置于37 ℃水浴反應(yīng)25 min，在510 nm 波長下測定其吸光度。其中樣品本底組需將等體積的去離子水替換為H2O2溶液（6 mmol·mL-1），空白組則需要以等體積的去離子水替換為樣品溶液。

1.2.5.4 東海烏參總皂苷清除DPPH 自由基能力的測定

配置濃度為2.0、4.0、6.0、8.0 以及10.0 mg·mL-1總皂苷和維生素C 溶液。以無水乙醇配制濃度為25 μg·mL-1DPPH 溶液，加入0.5 mL 于試管中，然后加入待測液0.5 mL 混勻，并于暗處反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后在517 nm 波長下測定其吸光度。其中樣品本底組需將等體積的無水乙醇替換為DPPH 溶液（25 μg·mL-1），空白組則需要以等體積的去離子水替換為樣品溶液。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理，利用GraphPad Prism8.0.1 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對皂苷得率的影響

由圖2 可知，隨著乙醇濃度的增大，皂苷的得率先平緩上升而后急劇下降，而在60%乙醇濃度時(shí)得率達(dá)到最大值，為0.238%。在30%～60%乙醇濃度時(shí)，皂苷的得率平緩上升，可能是由于在低乙醇濃度下東海烏參中的皂苷成分無法有效溶解于提取液中，而在75%～90%濃度下，皂苷得率開始下降，至90%出現(xiàn)驟跌，可能是東海烏參中水溶性皂苷無法有效溶解，從而導(dǎo)致提取總皂苷含量下降。

圖2 乙醇濃度對皂苷得率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the yield of saponin

2.2.2 提取溫度對皂苷得率的影響

由圖3 可知，隨著提取溫度的升高，皂苷的得率總體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，而在提取溫度為70 ℃時(shí)皂苷得率最高，達(dá)0.238%。當(dāng)提取溫度較低時(shí)，東海烏參中的皂苷無法有效溶解在浸提液內(nèi)，但隨著提取溫度逐漸升高后，其內(nèi)容物則開始明顯溶出。而當(dāng)提取溫度過高后，皂苷得率又開始下降，這可能是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致東海烏參中皂苷成分被破壞，使得皂苷的得率下降。

圖3 提取溫度對皂苷得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the yield of saponin

2.2.3 提取時(shí)間對皂苷得率的影響

由圖4 可知，皂苷的得率隨著提取時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而在提取時(shí)間為3 h 時(shí)得率達(dá)到最大值。因此，在提取時(shí)間為3 h 時(shí)，皂苷的溶解即達(dá)到了平衡，繼續(xù)延長加熱時(shí)間則會造成皂苷成分的破壞，從而減少了所提取皂苷的總量，造成得率下降。同時(shí)延長提取時(shí)間可能會造成大量的雜質(zhì)溶出，這會影響皂苷的純度，不利于后續(xù)純化。

圖4 提取時(shí)間對皂苷得率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the yield of saponin

2.2.4 料液比對皂苷得率的影響

由圖5 可知，當(dāng)料液比低于1：10 時(shí)，隨著料液比的不斷增大，皂苷得率呈現(xiàn)上升的趨勢，而后趨于平穩(wěn)?？赡茉蚴钱?dāng)料液比較小時(shí)，加入的提取液體積不足，在濃度飽和的情況下無法將樣品內(nèi)所含皂苷完全溶解，從而降低了提取效率。而當(dāng)提取溶劑足夠后，由于樣品所含皂苷量有限，繼續(xù)增大料液比無法提高得率。

圖5 料液比對皂苷得率的影響Fig.5 The effect of liquid to material ratio on the yield of saponin

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 正交試驗(yàn)結(jié)果可知，提取條件對東海烏參皂苷的得率影響由大到小依次為:料液比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度，依據(jù)圖中預(yù)測的最佳提取工藝條件為A2B1C2D3，即在乙醇濃度60%，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間3 h，料液比為1:13 的條件下提取東海烏參皂苷，在此條件下皂苷的得率為0.317%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental results

2.3 東海烏參總皂苷抗氧化能力測定結(jié)果

2.3.1 東海烏參總皂苷清除O2-·能力

根據(jù)圖6 結(jié)果可知，東海烏參總皂苷具有良好的O2-·清除能力，其清除能力隨著總皂苷的濃度增大總體趨于平穩(wěn)，清除率變化幅度在91.98%～97.20%之間，與維生素C對O2-·清除能力接近。但是在同等的質(zhì)量濃度下，東海烏參總皂苷清除O2-·的能力略低于維生素C。

圖6 東海烏參皂苷清除O2-·能力Fig.6 O2-·scavenging activity of saponin from A.leucoprocta

2.3.2 東海烏參總皂苷清除·OH 能力

根據(jù)圖7 結(jié)果可知，東海烏參總皂苷對·OH 的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)上升的趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1時(shí)，東海烏參總皂苷對·OH 的清除率達(dá)22.14%。而在2～10 mg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，維生素C 對·OH 的清除能力變化不大，維持在100%上下輕微波動，明顯優(yōu)于東海烏參總皂苷。

圖7 東海烏參皂苷清除·OH 能力Fig.7 ·OH scavenging activity of saponin from A.leucoprocta

2.3.3 東海烏參總皂苷清除DPPH·能力

根據(jù)圖8 結(jié)果可知，東海烏參總皂苷對DPPH·的清除能力呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)東海烏參總皂苷濃度為6 mg·mL-1時(shí)，其對DPPH·的清除能力為99.66%。維生素C 對DPPH·清除能力相對平穩(wěn)，濃度范圍內(nèi)的清除率波動為95.46%～97.19%，其清除率總體較高?？傮w來說，在2.0～6.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，維生素C 的DPPH 清除能力要高于東海烏參總皂苷，但在濃度為6.0～10.0 mg·mL-1時(shí)，兩者的清除能力大體一致。

圖8 東海烏參皂苷清除DPPH·能力Fig.8 DPPH·scavenging activity of saponin from A.leucoprocta

3 討論和總結(jié)

皂苷分為三萜和甾體糖苷兩大類，它們的結(jié)構(gòu)特征因連接在不同位置的糖單元數(shù)量而異[13]。根據(jù)它的結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，可用水或者甲醇作為溶劑進(jìn)行提取[14]，而大多數(shù)海參皂苷常用乙醇-水提取[15]。有學(xué)者用響應(yīng)面的方法優(yōu)化海地瓜皂苷的提取工藝，得到最佳工藝條件為乙醇濃度為79%，提取溫度為73.5 ℃，提取時(shí)間為2.75 h，料液比為1：1.7 g·mL-1，得率達(dá)0.378%[16]。對于提取出來的皂苷含量的檢測，分光光度法是常用的方法?？傇碥找卜Q為香草醛-硫酸測定，該方法的基本原理是氧化三萜皂苷與香草醛的反應(yīng)[17]。

另外，科學(xué)上發(fā)現(xiàn)皂苷具有抗氧化、抗癌等藥物特性[17-19]。因此皂苷是值得綜合開發(fā)與利用的集醫(yī)療、食品及飼料安全添加于一體的生物活性物質(zhì)[20]。研究采用單因素實(shí)驗(yàn)研究了乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比4 個(gè)因素對東海烏參皂苷得率的影響，并通過正交試驗(yàn)確定了東海烏參皂苷提取的最佳工藝條件，而在最佳工藝條件下，東海烏參皂苷得率達(dá)0.317%。同時(shí)，研究了東海烏參總皂苷的抗氧化能力，其具有良好的O2-·和DPPH·清除能力。而實(shí)驗(yàn)不足之處是只利用顯色法對東海烏參皂苷進(jìn)行了初步的判斷，對于皂苷的結(jié)構(gòu)還無法做出解析，因此后續(xù)可以進(jìn)一步進(jìn)行分離純化得到單體，對結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析以及進(jìn)一步的活性研究。