儋州雞雞冠形態(tài)差異與BMP2、CHADL蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性分析

曹婷 姬孟瑤,2 施力光 荀文娟,2 楊德智 侯冠彧

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南?？?571101；2.海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 海南海口 570228；3 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

儋州雞屬于小型土雞品種，是肉用型地方優(yōu)良品種，又稱儋州小種雞、儋州小種肉雞和儋州北岸小種雞，在儋州市各鄉(xiāng)鎮(zhèn)皆有養(yǎng)殖。因其肉質(zhì)鮮嫩，肉香濃郁，屠體皮膚薄，蛋白含量高，肌內(nèi)脂肪、皮下脂肪含量低等優(yōu)勢(shì)，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1-2]。

雞冠是雞頭部的皮膚衍生物，起源于喙的上方[3-4]。雞冠是優(yōu)質(zhì)肉雞的一項(xiàng)重要包裝性狀，是消費(fèi)者選購(gòu)禽肉產(chǎn)品的重要參考因素[5-7]。雞冠發(fā)育與雞的生長(zhǎng)發(fā)育有密切關(guān)聯(lián)，遺傳力也較高[8-9]。因此，雞冠的發(fā)育已經(jīng)成為優(yōu)質(zhì)肉雞選育的重要目標(biāo)性狀之一。雞中最為常見的冠型為單冠，就遺傳學(xué)研究而言，單冠是野生型性狀，其余則為突變性狀[10-12]。突變的雞冠性狀包括玫瑰冠、豆冠、胡桃冠、雙冠、三叉冠、多冠和無冠，其中不同突變型內(nèi)又分為若干表型。

雞冠的形態(tài)差異受多因子控制。BMP2(Bone morphogenetic protein 2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白) 基因和CHADL(Chondroadherin-like protein，軟骨蛋白樣蛋白)基因都是被轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定為參與雞冠發(fā)育的候選基因[13-15]。BMP2和CHADL這2個(gè)基因位于雞冠QTL上[16]。其中BMP2屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的一員，它能影響骨的生理機(jī)能（繁殖力）和增加骨沉積，刺激成骨細(xì)胞增殖和分化，刺激骨的形成，被認(rèn)為是活性最強(qiáng)的唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子[17]。關(guān)于雞BMP2和CHADL基因的研究甚少，尚不確定其在雞冠發(fā)育和分化過程中起到的具體調(diào)控作用，可以作為調(diào)節(jié)雞冠發(fā)育的候選基因重點(diǎn)研究，為探索雞冠發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)理提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

為了進(jìn)一步探索BMP2和CHADL基因在儋州雞雞冠發(fā)育過程中發(fā)揮的作用，采用免疫印跡（Western Blot）試驗(yàn)方法，對(duì)儋州雞保種選育基地儋州雞主要雞冠形態(tài)（單冠和玫瑰冠）、不同月齡（2月齡至青年期，4月齡至性成熟啟動(dòng)期，6月齡至性成熟完全期）、不同性別等的雞冠組織進(jìn)行BMP2、CHADL蛋白水平的表達(dá)測(cè)定和關(guān)聯(lián)性分析；并對(duì)性成熟中期（5月齡）儋州雞公雞、母雞不同冠型進(jìn)行以上 2個(gè)蛋白的表達(dá)比較分析。為揭示雞冠發(fā)育調(diào)控機(jī)制和分子選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材儋州雞群體均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所儋州雞選育基地提供，出殼后在相同的營(yíng)養(yǎng)水平和管理?xiàng)l件下養(yǎng)殖，待到雞冠長(zhǎng)到可分辨形態(tài)類型時(shí)按照單冠組和玫瑰冠冠組群進(jìn)行篩選分群，挑選健康單冠、玫瑰冠組群各 150只（公母比例 4∶1），繼續(xù)同條件養(yǎng)殖，準(zhǔn)備在2、4、5、6月齡時(shí)分別進(jìn)行雞冠組織樣本采集。

1.1.2 主要試劑儀器一抗：BMP2（博奧森bs-10696R）、CHADL（博奧森 bs-13885R）、β-Actin（博士德 BM0627），二抗：HRP-羊抗兔 IgG+HRP-羊抗小鼠IgG，博士德BA1056，RIPA裂解液，抗體稀釋液，蛋白抑制劑，PBS，電泳液，PVDF膜等。

勻漿機(jī)，電泳儀，培養(yǎng)箱，玻璃皿等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物樣本采集待試驗(yàn)雞生長(zhǎng)到2月齡（青年期）、4月齡（性成熟啟動(dòng)期）、6月齡（性成熟完全期）時(shí)，屠宰并快速采集儋州雞公雞單冠和玫瑰冠雞冠組織（各5只樣本重復(fù)）；并在5月齡時(shí)（性成熟中期）屠宰并快速采集各5只儋州雞公雞單冠和玫瑰冠、儋州雞母雞單冠和玫瑰冠雞冠中間部分組織。存放于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)采用免疫印跡（Western Blot）試驗(yàn)方法，對(duì)2月齡（青年期）、4月齡（性成熟啟動(dòng)期）、6月齡（性成熟完全期）儋州雞公雞單冠和玫瑰冠組織進(jìn)行BMP2、CHADL蛋白表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)；并對(duì)性成熟中期（5月齡）儋州雞公雞、母雞單冠、玫瑰冠組織進(jìn)行BMP2、CHADL蛋白表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)。具體操作如下：

蛋白樣品制備（40 mg左右冷凍雞冠組織樣品勻漿提取蛋白質(zhì)，含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液作為勻漿介質(zhì)）→蛋白定量（使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并用PBS將每組蛋白稀釋定量，確保每組的蛋白濃度在同一水平）→上樣電泳（將變性后的蛋白以 50 μg總蛋白的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳）→轉(zhuǎn)膜（電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上）→封閉（在室溫下用封閉緩沖液封閉膜 1 h，然后將膜在TBST中洗滌3次）→一抗孵育（與一抗孵育1.5 h或過夜）→二抗孵育（TBST洗滌 3次并與二抗孵育1小時(shí)）→顯影曝光（在膜上均勻滴上ECL發(fā)光液—Biosharp，用發(fā)光圖像分析儀 Champ Chemi系統(tǒng)拍攝照片）。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析灰度值分析：通過Image J軟件進(jìn)行量化分析（目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值），SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冠型、月齡儋州雞公雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因蛋白水平表達(dá)分析

蛋白水平表達(dá)分析結(jié)果顯示：儋州雞公雞的單冠和玫瑰冠組織中BMP2蛋白表達(dá)水平在2、4、6月齡的表達(dá)趨勢(shì)均為由高到低再到高，且在 4到6月齡均差異顯著（p＜0.05，下同）；而CHADL蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，但差異不顯著（p＞0.05，下同）；2月齡公雞單冠組中BMP2蛋白表達(dá)水平低于玫瑰冠，差異不顯著；4、6月齡公雞單冠組織中 BMP2蛋白表達(dá)水平高于玫瑰冠，差異也不顯著；2、6月齡公雞單冠組織中CHADL蛋白表達(dá)水平低于玫瑰冠，而 4月齡公雞單冠組織中 CHADL蛋白表達(dá)水平高于玫瑰冠，差異均不顯著。表達(dá)分析結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 不同冠型、月齡儋州雞公雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因蛋白水平表達(dá)（WB顯色）

圖2 不同冠型、月齡儋州雞雞冠組織中BMP2、CHADL蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（灰度值）

2.2 性成熟中期不同冠型、性別儋州雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因蛋白水平表達(dá)分析

蛋白水平表達(dá)分析結(jié)果顯示：性成熟中期（5月齡）儋州雞公雞和母雞單冠組織中 BMP2、CHADL蛋白表達(dá)水平均高于其在玫瑰冠組，且BMP2蛋白在公雞2冠型組織間的表達(dá)差異顯著，2種蛋白表達(dá)在母雞 2冠型組織間差異不顯著；性成熟中期玫瑰冠型雞冠組織中公雞的BMP2蛋白表達(dá)水平均顯著低于母雞，不同性別和冠型雞冠組織中的CHADL蛋白表達(dá)水平差異不顯著表達(dá)分析結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 性成熟中期（5月齡）不同冠型、性別儋州雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因蛋白水平表達(dá)（WB顯色）

圖4 性成熟中期（5月齡）不同冠型、性別儋州雞雞冠組織中BMP2、CHADL蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（灰度值）

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

雞冠是雞的第二性征中最重要、最明顯的特征，其發(fā)育是成長(zhǎng)和性成熟程度的參考指標(biāo)，也是決定銷售等級(jí)和價(jià)格的關(guān)鍵因素[18]。所以，雞冠的類型和發(fā)育一直是養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和雞群繁殖育種關(guān)注的重點(diǎn)，雞冠的發(fā)育和篩選也已成為優(yōu)質(zhì)肉雞選育的重要目標(biāo)性狀之一[8,19]。但仍有很多因素制約著雞冠性狀的選育進(jìn)展，如世代間隔較長(zhǎng)等問題。從分子水平對(duì)復(fù)雜性狀的遺傳機(jī)制進(jìn)行解析，尋找關(guān)鍵的分子標(biāo)記用于輔助選擇，已經(jīng)成為提高動(dòng)物育種進(jìn)展的重要方法之一。雞冠的形態(tài)差異受多因子控制，但目前在分子水平進(jìn)行雞冠性狀的研究較少。

BMP2和CHADL基因是參與骨骼和軟骨組織合成的作用基因，也是近年來被轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定為參與雞冠發(fā)育的候選基因[13-15]。其中有學(xué)者通過QTL定位發(fā)現(xiàn)BMP2可共同參與雞冠發(fā)育調(diào)控作用[20]；也有研究證實(shí)，BMP2基因通過鈣質(zhì)分配參與雞冠發(fā)育過程[21]；近期有研究發(fā)現(xiàn)，BMP2基因在雞冠發(fā)育中起到負(fù)調(diào)控作用[14]；同時(shí)也有相關(guān)研究人員研究得出，CHADL基因可能在雞冠發(fā)育過程中起到正調(diào)控作用，可以促進(jìn)雞冠發(fā)育[15]；近期有研究表明，CHADL基因也可能通過調(diào)控雞冠真皮層膠原纖維的合成作用來參與雞冠發(fā)育[14]。

由于BMP2和CHADL基因被挖掘?yàn)檎{(diào)控雞冠發(fā)育的候選基因較晚，且相關(guān)機(jī)制研究甚少，尚不確定其在雞冠發(fā)育和分化過程中起到的具體作用。近期，王琨等[13]對(duì)不同周齡公雞雞冠組織中BMP2、CHADL基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：BMP2基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在13周齡時(shí)表達(dá)量最高(p＜0.05)；而CHADL基因的表達(dá)量隨著雞冠發(fā)育逐漸升高(p＜0.05)。并得出BMP2和CHADL分別在雞冠發(fā)育過程中發(fā)揮了抑制/促進(jìn)雞冠發(fā)育的作用的結(jié)論[14]。本文通過對(duì)不同月齡的儋州雞公雞不同冠型中這2種基因蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，儋州雞公雞的單冠和玫瑰冠組織中BMP2的蛋白表達(dá)在2、4、6月齡的表達(dá)趨勢(shì)均為由高到低再到高，而 4月齡正是肉雞的性成熟啟動(dòng)期，該階段的雄性第二性征主要性狀——雞冠的發(fā)育可能是一個(gè)高峰階段，這個(gè)高峰階段的BMP2蛋白表達(dá)卻最低；且性成熟中期的雞冠大小排序?yàn)楣u玫瑰冠＞公雞單冠＞母雞單冠，這也與 BMP2的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，所以BMP2的蛋白水平的表達(dá)也可能對(duì)雞冠的發(fā)育、大小和冠型起到一定的抑制作用；從本研究結(jié)果還可以看出，BMP2的蛋白水平表達(dá)在性成熟中期公雞的單冠和玫瑰冠差異較顯著，說明BMP2蛋白對(duì)儋州雞公雞的冠型和性成熟中期的調(diào)控作用較大；而CHADL蛋白的表達(dá)量雖然在儋州雞公雞不同月齡和不同冠型的雞冠組織中表達(dá)差異不顯著，但呈一定的上升趨勢(shì)，這與前期王琨等[14]對(duì)該基因的表達(dá)趨勢(shì)一致，但是由于CHADL蛋白水平的表達(dá)差異并不顯著，所以本試驗(yàn)不能確定CHADL的蛋白表達(dá)是否對(duì)雞冠的表型和生長(zhǎng)發(fā)育存在調(diào)控關(guān)聯(lián)作用，還需要進(jìn)一步研究探索。

3.2 結(jié)論

儋州雞雞冠形態(tài)的差異和發(fā)育階段的不同與BMP2、CHADL基因蛋白水平的表達(dá)有一定的關(guān)聯(lián)性，其中BMP2較為明顯。BMP2基因的表達(dá)量與儋州雞雞冠冠型大小和生長(zhǎng)月齡呈負(fù)相關(guān)，可能在調(diào)控雞冠發(fā)育上存在抑制作用，其調(diào)控作用在性成熟期間較為顯著，并且主要體現(xiàn)在公雞群體中。