基于NF-κB信號通路探討鼻淵合劑對急性鼻竇炎的作用機制

肖佳寧,薛珊珊,倪平敏,王卓,吳擁軍

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

急性鼻竇炎(Acute sinusitis,ARS)是由炎癥浸潤改變和(或)破壞鼻腔鼻竇局部和(或)整體免疫功能導致的上呼吸道感染性疾病[1],其炎癥浸潤多為病原菌感染引起,常見的潛在致病菌包括金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌等[2]。鼻淵合劑是國醫(yī)大師干祖望教授在經(jīng)典名方“蒼耳子散”和“葦莖湯”基礎上加減化裁而成的臨床經(jīng)驗方,采用現(xiàn)代提取工藝制備而成的江蘇省中醫(yī)院院內制劑,組成包括白芷、蒼耳子、桔梗、蘆根、桑葉、辛夷、魚腥草。

前期臨床研究證實[3]，鼻淵合劑能顯著降低ARS患者外周血中性粒細胞/淋巴細胞比值,改善鼻塞和頭面部脹痛,具有良好的臨床療效。進一步在體動物實驗研究[4]發(fā)現(xiàn),其機制可能與促進IL-10分泌、抑制IL-9和p38 MAPK通路、調控免疫平衡相關。另外,據(jù)報道p38 MAPK可磷酸化IκBα,使IκBα與NF-κB解聚,激活NF-κB,調控IL-9等多種細胞因子產生[5]。因此,本文將利用網(wǎng)絡藥理學研究方法,從藥物有效活性成分、疾病靶點、關鍵基因、代謝通路、生物功能等多層面探討鼻淵合劑治療ARS的作用機制,并通過建立ARS大鼠模型,對網(wǎng)絡藥理學篩選出的信號通路進行實驗驗證。

1 材料

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌-標準菌種,購自上海魯微科技有限公司。

1.1.2 動物 SD大鼠36只,體質量200～240 g,雌雄各半,由浙江省實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK (浙)2019-0002。

1.1.3 藥物 鼻淵合劑水煎液(批號：1708024,生藥量:0.7 g·mL-1);阿莫西林克拉維酸鉀分散片(7∶1)(魯南貝特制藥有限公司生產,批號:H20050586，規(guī)格：0.228 5 g×24粒)、桉檸蒎腸溶軟膠囊(北京九和藥業(yè)有限公司,批號:20170612,規(guī)格:0.3 g×12粒)等。

1.1.4 試劑 吸收性明膠海綿 (江西省祥恩醫(yī)療科技有限公司)、PBS緩沖液、5×蛋白上樣緩沖液、顯影液、BSA、甲醇、異丙醇等其他實驗室常規(guī)材料。IL-8試劑盒(上海紀寧生物公司,貨號:1617168302685997265),IL-1β試劑盒(武漢華美生物公司,貨號:CSB-E08055r),IL-6試劑盒(武漢華美生物公司,貨號:CSB-E04640r),TNF-α試劑盒(武漢華美生物公司,貨號:CSB-E11987r)。

2 方法

2.1 鼻淵合劑活性成分篩選及靶點預測

以白芷、桑葉、蘆根、桔梗、蒼耳子、辛夷、魚腥草等中藥為關鍵詞,通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php)提取鼻淵合劑中各藥味成分,以口服生物利用度(OB)>30%和類藥性(DL)>0.18為標準篩選獲得有效活性成分和相應的靶基因,并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)對靶基因進行標準化處理。

2.2 ARS相關基因的收集

以“acute sinusitis”為關鍵詞,通過GeneCards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫提取獲得ARS相關靶基因信息,并應用Venny繪制與鼻淵合劑作用靶基因交集的靶基因,最終獲得鼻淵合劑治療ARS的靶基因。

2.3 構建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡

將上述鼻淵合劑中藥、活性成分、與疾病相關基因導入Cytoscape軟件(Version 3.7.2),構建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡,并計算節(jié)點的網(wǎng)絡度(degree),度值越大對應的節(jié)點面積越大,則表示該節(jié)點的生物功能越廣泛。

2.4 構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡

將篩選出的藥物基因與疾病基因分別輸入Cytoscape上的插件“Bisogenet”中,選擇基因識別和蛋白互作,同樣將蛋白種類設置為 “Homo sapiens”,其他參數(shù)保持默認。使用Network工具得出兩者的交集后行拓撲分析,以明確作用的主要靶基因。

2.5 GO分析和KEGG通路分析

將藥物基因與疾病基因的交集基因導入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html/main/step1),物種設置為“Homo sapiens”,而后自定義選擇中依次設置“KEGG Pathway”和“GO Molecular Function(MF)”,其余選項均為默認值不變,進行計算。

2.6 金黃色葡萄球菌菌液制備

常規(guī)復蘇金黃色葡萄球菌-標準菌種,需氧環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)24 h后,挑取小部分菌落于無菌試管中保存,菌液調至4麥氏濁度,即每管中金葡菌菌液濃度為1.2×109CFU·mL-1。

2.7 中藥水煎液制備

鼻淵合劑水煎液由南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院)制劑室,按照國家標準制劑工藝制成4倍濃縮藥液,濃縮液生藥含量為2.8 g·mL-1,同時與生理鹽水以1∶1配成2倍濃縮藥液,含量為1.4 g·mL-1,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.8 ARS大鼠模型制備

隨機挑選32只SD大鼠,按100 g大鼠腹腔注射0.3 mL 10%水合氯醛溶液進行全身麻醉。大鼠固定后,將吸收性明膠海綿裁剪成2 mm×5 mm×10 mm大小塞入大鼠右側鼻腔內,再向鼻腔內滴入0.5 mL 1.2×109U·mL-1金黃色葡萄球菌。

2.9 動物分組及給藥

根據(jù)鼻竇炎癥狀評分標準[4],選取評分≥6分的大鼠,即造模成功的ARS大鼠,隨機分為:模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組和西藥組,每組各6只,雌雄各半。空白組6只,雌雄各半。

每日給藥:空白組不給藥,其余各組藥液均以5 mL·kg-1·d-1灌胃。模型組:生理鹽水灌胃;高劑量組、中劑量組、低劑量組分別以鼻淵合劑4倍、2倍、1倍濃度水煎液灌胃；西藥組:阿莫西林克拉維酸鉀和桉檸蒎腸溶膠囊，參照臨床用藥與動物實驗換算標準,每日以相當于臨床成人劑量的6.25倍溶入生理鹽水灌胃,即阿莫西林克拉維酸鉀給藥量為95.2 mg·kg-1、桉檸蒎腸溶膠囊給藥量為62.5 mg·kg-1。每日1次,持續(xù)給藥1周。末次給藥24 h后麻醉取股動脈血5 mL,離心提取血清,于-80 ℃存放。取血后處死大鼠,沿大鼠鼻中隔切開1.5 cm,取出大鼠右側鼻竇黏膜,一分為二置于2個2 mL離心管中,一半標本經(jīng)4%中性甲醛液固定后于4 ℃保存,另一半直接置于-80 ℃冰箱存放。

2.10 觀察指標

2.10.1 大鼠鼻部癥狀評分標準 在造模完成后第1天和造模完成后第7天,根據(jù)ARS癥狀評分標準記錄大鼠癥狀評分,見表1。造模成功標準:模型大鼠活動量較正常大鼠明顯減少,出現(xiàn)清涕或濁涕,鼻前庭潮紅等癥狀評分≥6分。

表1 ARS癥狀評分標準Table 1 Symptom scoring criteria of ARS

2.10.2 血清IL-1β、IL-6、IL-8及鼻竇黏膜組織TNF-α表達檢測 取大鼠血清、部分鼻竇黏膜,采用ELISA試劑盒檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-8及鼻竇黏膜中TNF-α水平,檢測使用Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾科技公司)，具體步驟嚴格按照試劑盒說明執(zhí)行。

2.10.3 鼻竇黏膜中NF-κBp50和NF-κBp65檢測 取出鼻竇黏膜組織,加入預冷的玻璃研磨器中,充分研磨后冰水裂解,離心后去上清移至新的EP管中。將0.5 mg·mL-1BSA(牛血清白蛋白)標準品按梯度稀釋加到96孔板的標準品孔中,同時加入染色液。室溫放置后,用酶標儀測定A595(595/630 nm)的吸光度,根據(jù)標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品中的蛋白濃度。在蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液,水浴加熱。將樣本冷卻到室溫后,進行上樣、電泳、封閉,先后行一抗、二抗孵育,最后將蛋白曝光、顯影。

2.11 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行處理,符合正態(tài)分布及方差齊使用t檢驗,方差不齊使用校正t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。蛋白條帶應用Quantity One、Gel pro analyzer、Image J等軟件對各條帶進行定量分析。

3 結果

3.1 鼻淵合劑有效成分和靶基因

經(jīng)篩選去重獲得鼻淵合劑處方中66個有效活性成分,并根據(jù)“Related Targets”,篩選去重得靶基因239個,見表2。

表2 藥物有效活性成分數(shù)及作用基因數(shù)Table 2 Drugs and active ingredients and their oral bioavailability and drug like properties

3.2 獲取ARS關鍵基因

GeneCards檢索獲得2 236個ARS相關基因,然后取其與上述鼻淵合劑去重后藥物靶基因的交集,得到141個交集基因,為鼻淵合劑治療ARS的關鍵基因,見圖1。

圖1 中藥復方鼻淵合劑與ARS共有靶點圖Fig.1 Common target of BYHJ and ARS

3.3 構建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡

將各數(shù)據(jù)導入Cytoscape中并繪制圖形,建立“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡,見圖2。同時由網(wǎng)絡計算出的“Degree”值前五位:槲皮素 (Quercetin)為146、山柰酚(Kaempferol)為60、β-谷甾醇(β-Sitosterol)為38、氧血根堿 (Oxysanguinarine)為38、豆甾醇(Stigmasterol)為34。

圖2 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖Fig.2 Network diagram of "Drug-Active ingredient-Target"

3.4 構建PPI 網(wǎng)絡

下載分析所得數(shù)據(jù),截取出大于“Degree”兩倍中位數(shù)48的值。而后重新計算再截取出同時大于介數(shù)(Betweenness)中位數(shù)801.812、貼進度(Closeness)中位數(shù)0.476、度值(Degree)中位數(shù)81的數(shù)據(jù),建立PPI網(wǎng)絡,見圖3。前5位分別為淀粉樣β前體蛋白2 134、高親和力神經(jīng)生長因子受體1 574、泛素連接酶947、細胞腫瘤抗原946、表皮生長因子受體931。

圖3 PPI網(wǎng)絡分析Fig.3 PPI network

3.5 GO MF分子富集分析

選擇前20個作條形圖展示,見圖4。鼻淵合劑主要參與的生物過程包括對炎癥反應的調節(jié)、對傷害的反應、對細胞外刺激的反應、對脂多糖的反應、對生長因子的反應、對腫瘤壞死因子的反應等。

圖4 GO分子功能富集分析Fig.4 GO MF enrichment analysis

3.6 KEGG通路富集分析

截取出前20個相關通路作條形圖展示,見圖5,可見鼻淵合劑治療ARS的信號通路包括NF-κB信號通路、癌癥的途徑、鈣信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

鑒于網(wǎng)絡藥理學研究顯示NF-κB信號通路與ARS具有高相關性,實驗相關通路圖如圖6,標藍為此次動物實驗中檢測指標。

圖6 NF-κB信號通路圖Fig.6 NF-κB signaling pathway diagram

3.7 血清、黏膜各指標檢測結果

模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8及鼻竇黏膜內TNF-α表達量較空白組顯著上升(P<0.01),給藥后西藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組表達量均下降(P<0.01),見表3;與空白組比較,模型組鼻竇黏膜中NF-κBp50、NF-κBp65蛋白含量水平升高,各給藥組均較模型組下降(P<0.01),BYHJ高劑量組與西藥組下降程度接近,見圖7。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8及鼻竇黏膜內TNF-α表達量比較Table 3 Expression comparison of IL-1β、IL-6、IL-8 and TNF-α in each

注：與空白組比較，**P<0.01;與模型組比較，圖7 Western blot法檢測鼻竇黏膜中NF-κBp50、NF-κBp65蛋白水平Fig.7 The expression of NF-κBp50、NF-κBp65 protein in each group

4 討論

ARS屬于中醫(yī)鼻淵范疇,《素問·氣厥論》對鼻淵的論述奠定中醫(yī)對鼻淵病機的基本認識[6]。干祖望教授根據(jù)長期臨床經(jīng)驗,總結出鼻淵由外感風寒,入里化肺熱,內蘊竇腔,腐蝕肌膜,醞釀成膿所致,認為“風寒化肺熱”為中醫(yī)病因病機實質,治擬疏風清熱、通竅排膿[7],以鼻淵要藥白芷、辛夷、蒼耳子宣通鼻竅、消腫排膿,合桑葉、桔梗、魚腥草清熱排膿,再添千金葦莖湯中的蘆根,旨在清肺熱,增強排膿之效,方用鼻淵合劑。已有研究報道[8]白芷可顯著降低潰瘍性結腸炎大鼠體內IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平以及調節(jié)NF-κB信號通路,從而改善大鼠癥狀。桔梗中桔?？傇碥湛梢种芅F-κB信號通路的激活,促進組織修復,從而減輕炎癥反應[9]。研究[10]還證實大鼠胎盤經(jīng)桑葉中桑葉總黃酮干預后,組織中NF-κB蛋白表達量顯著降低,發(fā)揮抗炎和抗氧化應激作用,同時魚腥草中新魚腥草素鈉[11]也有降低NF-κB蛋白表達量的作用。根據(jù)研究顯示[12],前炎癥因子IL-1β作為ARS的重要炎癥遞質,IL-1β增加不僅會磷酸化 p38 MAPK,還能激活NF-κB信號轉導通路,引發(fā)白細胞募集,同時誘導巨噬細胞活化,造成組織細胞凋亡,并向核區(qū)轉位,翻譯和轉錄炎癥因子,促進IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子的產生[13-15],加劇局部炎癥反應和氣道重塑[16]。

本實驗中動物實驗結果顯示,與空白組相比,模型組血清中IL-1β、IL-6、IL-8含量水平顯著升高,同時鼻竇黏膜中NF-κBp50、NF-κBp65蛋白、TNF-α的表達水平也有所升高。與模型組相比,中西藥各組表達水平均有所下降,且高劑量組各數(shù)據(jù)水平與西藥組基本接近。表明鼻淵合劑能顯著降低ARS模型大鼠體內NF-κB信號通絡相關炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平,同時通過調控NF-κBp50、NF-κBp65含量,起到抗炎作用,與網(wǎng)絡藥理學分析結果呈一致性。

綜上所述,網(wǎng)絡藥理學分析結果顯示鼻淵合劑通過NF-κB信號等通路治療ARS，而動物實驗進一步驗證了鼻淵合劑對于炎癥的抑制作用。本課題組后續(xù)將對NF-κB信號通路中的其他上、下游調控因子以及網(wǎng)絡藥理學挖掘的其他可能作用機制等深入研究,進一步揭示鼻淵合劑對ARS的作用機制。