二乙基亞硝胺誘導(dǎo)斑馬魚肝癌模型的探索與優(yōu)化

胡 光，李 丹，陳 陽，張云羅，肖袁媛，楊世洲，周 倩

(重慶理工大學(xué) 藥物化學(xué)與分子藥理學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400054)

0 引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡稱肝癌，為臨床常見惡性腫瘤。肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的首要原因，在我國的腫瘤死亡原因中僅次于肺癌。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)發(fā)布的全球癌癥發(fā)病率和死亡率2018 年評估報告顯示，2018 年肝癌成為全球第六大最常見的癌癥以及第四大癌癥死亡的原因，2018 年新增肝癌病例大約為84.1 萬例，新增肝癌死亡患者數(shù)量高達(dá)約78.2 萬;同時，在全球大多數(shù)地區(qū)，男性的肝癌患病率與死亡率相對更高，因此，肝癌在全球癌癥病例中排名第五，更在男性死亡數(shù)中排名并列第二［1］。根據(jù)國家癌癥中心腫瘤登記辦公室統(tǒng)計的2015 年中國癌癥數(shù)據(jù)，2015 年新發(fā)肝癌患者37.0萬，肝癌患者死亡數(shù)32.6 萬，在我國主要惡性腫瘤發(fā)病數(shù)目和死亡原因中，肝癌分別排在第4 位和第2 位［2］。因此，對肝癌進(jìn)行更深入的機理研究，以對疾病進(jìn)行治療已刻不容緩。

斑馬魚作為繼大鼠、小鼠后的世界第三大模式動物，其基因測序已基本完成，正被廣泛地應(yīng)用于各種體內(nèi)實驗的研究。斑馬魚的基因與人類同源性為87%，在遺傳水平上與人類有高度相似性;此外，斑馬魚作為一種有脊椎骨的動物，在其消化系統(tǒng)(肝腸組織)和心血管系統(tǒng)等部分的生長發(fā)育的機制和人體非常相似［3］，因此以斑馬魚為基礎(chǔ)建立的疾病模型也能在一定程度上反應(yīng)人類疾病的相應(yīng)情況［4］。斑馬魚作為新型的整體實驗動物模型，具有體外受精、發(fā)育迅速、繁殖能力強，以及適合于實驗室飼養(yǎng)等特點;與傳統(tǒng)的細(xì)胞、大鼠、小鼠模型相比，斑馬魚還兼有體內(nèi)、體外2 種模型的優(yōu)點:胚胎及幼魚期體積很小、魚體透明，可以在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行實時檢測觀察內(nèi)部器官、組織的變化;成年以后繁殖速度快，短期內(nèi)能為實驗提供大量的樣本;給藥方式簡單、周期短、成本低，適于大規(guī)模藥物的高通量篩選等。

二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)是一種常見的癌癥誘導(dǎo)劑，其經(jīng)過DNA 上的微端粒體在體內(nèi)轉(zhuǎn)化后，可導(dǎo)致諸如核酸、蛋白質(zhì)等類型的大分子物質(zhì)被甲基化修飾，從而引起肝細(xì)胞損傷甚至壞死;還可以通過刺激肝臟細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌的方式，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展，進(jìn)而促進(jìn)肝臟腫瘤的形成［5］。除此之外，DEN 水溶性較好且物理化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，適合使用直接浸泡的方式對斑馬魚進(jìn)行暴露處理［6］，這些因素都使得在斑馬魚身上建立肝癌模型的實驗?zāi)康淖兊酶拥暮唵?、可行?/p>

近年來，斑馬魚在肝臟疾病研究中的應(yīng)用日益增多:2006 年，Mizgireuv 等［7-8］第一次使用DEN成功誘導(dǎo)了斑馬魚形成肝臟腫瘤;隨后，F(xiàn)ujisawa等［9］也選用DEN 誘導(dǎo)并成功構(gòu)建斑馬魚肝臟腫瘤模型。2008 年，Rekha［10］首次在HCV 轉(zhuǎn)基因斑馬魚體內(nèi)采用硫代乙酰胺誘導(dǎo)出了肝硬化和肝癌。2011 年，Nguyen 等［11］首次利用米非司酮誘導(dǎo)krasV12 轉(zhuǎn)基因斑馬魚使其發(fā)生肝臟腫瘤。到了2012 年，可以在肝臟內(nèi)特異表達(dá)HBX 和HCV 核心蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚被Liu 等成功構(gòu)建，在該模型上可以明顯地觀察到肝纖維化與膽管細(xì)胞癌［12］。

綜上所述，采用DEN 誘導(dǎo)斑馬魚肝癌的實驗?zāi)Ｐ徒⑹强尚械?，本課題組將通過縮短肝癌發(fā)生模型的試驗周期、增加肝癌發(fā)生的評價方法、完善該模型的評價指標(biāo)等方式，優(yōu)化、完善DEN 誘導(dǎo)斑馬魚肝癌的實驗方法，建立更加符合高通量篩選的肝癌評價平臺，為簡單、快速的藥物篩選提供研究基礎(chǔ)和支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8 月齡AB 品系野生型斑馬魚(上海費曦生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗室主要試劑及儀器

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(南京一樹梨花生物科技有限公司)，二甲苯(川東化工)，DEN(阿達(dá)瑪斯)，中性樹膠試劑(麥克林)，98%3-乙氧?；桨芳谆撬?阿拉丁)，4%多聚甲醛(白鯊生物)，光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯)。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚的飼養(yǎng)條件

斑馬魚在25～28 ℃環(huán)境中飼養(yǎng)，采用時間自動控制裝置保證每日14 h 光照和10 h 黑暗的循環(huán)。

1.2.2 斑馬魚成魚DEN 處理濃度篩選

初篩采用的誘導(dǎo)劑DEN 的濃度為0、100、150、200 μg/mL，將8 月齡斑馬魚隨機分組，以20條/組分別在不同的魚缸中喂養(yǎng)。實驗組暴露于相應(yīng)梯度濃度的DEN 溶液中，對照組暴露于等量的RO 水中，置于同一環(huán)境下飼養(yǎng)，持續(xù)觀察斑馬魚的生存情況。

1.2.3 肝腸指數(shù)檢測

肝腸指數(shù)的定義為:斑馬魚肝腸濕重量與斑馬魚整體濕重量的比值。將斑馬魚浸入98%的3-乙氧?；桨芳谆撬嶂新樽?，隨即用天平稱取斑馬魚的整體濕重量，而后在顯微鏡下將斑馬魚的肝腸組織分離開，再用天平稱量肝腸組織的濕重量，同時進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄，以評價DEN 處理組和對照組斑馬魚在造模期間肝腸臟形態(tài)學(xué)改變情況。

1.2.4 肝臟石蠟切片的制作

將斑馬魚肝臟用4%的多聚甲醛固定24 h，用PBS 沖洗2～3 次，每次2～3 min。而后，依次采用梯度酒精、二甲苯、65 ℃石蠟2 次浸泡肝臟組織，制備的石蠟標(biāo)本用石蠟切片機切取5 μm/片的石蠟切片。

1.2.5 HE 染色

石蠟切片以后，將切片用新鮮二甲苯2 次侵泡5 min 脫蠟處理;再用100%乙醇5 min、95%乙醇2 min、80%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸餾水2 min 進(jìn)行水化處理;用蘇木素浸染35 s，分化液30 s，自來水浸泡15 min，伊紅浸染3 min，自來水浸泡2 min;95%乙醇分別2 次沖洗4 s，100%乙醇沖洗4 s，100%乙醇浸泡1 min，新鮮二甲苯2 次浸泡1 min;最后用中性樹脂進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 血管新生評價

對各個濃度的斑馬魚進(jìn)行解剖，而后對其肝臟組織進(jìn)行外觀觀察，根據(jù)肝臟血管的增生數(shù)量以及血管密集程度按照正常、輕度、中度、重度、特重5 個等級評價，并計算各程度的發(fā)生率。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)劑DEN 濃度的篩選

在濃度篩選過程中，采用50、150、250 μg/mL的DEN 對斑馬魚進(jìn)行給藥處理。實驗結(jié)果顯示，相較于對照組，DEN 濃度為250 μg/mL 時，斑馬魚生存率最低且具有顯著性。在DEN 給藥處理到第4 周時，250 μg/mL DEN 處理組的斑馬魚已全部死亡。在DEN 誘導(dǎo)9 周后，150 μg/mL 實驗組斑馬魚生存率為10%，50 μg/mL 實驗組斑馬魚生存率為70%，因此，篩選出DEN 合適濃度范圍在0～150 μg/mL，選擇150 μg/mL 作為高濃度組、100 μg/mL 作為中濃度組、50 μg/mL 作為低濃度組建模給藥濃度。

圖1 DEN 給藥處理10 周期間斑馬魚生存率變化情況

2.2 DEN 誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的形態(tài)學(xué)結(jié)果

在造模給藥9 周后對斑馬魚進(jìn)行觀察記錄。整個實驗過程，對照組斑馬魚存活正常，DEN 處理的各組斑馬魚部分皆出現(xiàn)脊柱彎曲，腹腔膨大現(xiàn)象(圖2);對照組斑馬魚體表干凈，邊緣清晰;DEN處理的各組實驗組斑馬魚體表均出現(xiàn)一定程度的腐爛、黏膩。各組肝臟的形態(tài)觀察結(jié)果顯示:解剖后，相較于對照組斑馬魚，DEN 處理組斑馬魚腹腔出現(xiàn)腹水，且肝臟明顯膨大，肝臟上有明顯點狀、球狀腫瘤組織出現(xiàn)，膽囊變小且本色綠色變淺;對照組斑馬魚肝臟表面光滑，無結(jié)節(jié)形成，質(zhì)地柔軟且呈深紅色，但經(jīng)DEN 處理后，肝臟結(jié)節(jié)數(shù)量變多且形態(tài)大小不一，能夠觀察到較為明顯的腫瘤生長，肝臟出現(xiàn)高度纖維化趨勢，顏色為淡紅色或淡黃色(圖3)。圖3 中，紅圈標(biāo)注區(qū)域為斑馬魚的肝腸組織中有代表性變化的部分。與對照組相比，DEN 處理組肝臟血管密集，表面凹凸不平，進(jìn)一步證實肝臟腫瘤的形成(圖4)。

圖2 斑馬魚體表觀察實物圖

圖3 斑馬魚肝臟組織表面圖

圖4 斑馬魚肝腸組織血管生成實物圖

2.3 HE 染色結(jié)果

從HE 染色的結(jié)果(圖5)中可以看出，對照組斑馬魚的肝臟組織結(jié)構(gòu)一切正常，肝細(xì)胞排列整齊有序且細(xì)胞大小均一(圖5(a));DEN 處理組斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)在不同誘導(dǎo)劑濃度下出現(xiàn)不同程度的破壞，細(xì)胞排列紊亂且大小不一，出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞異常分裂，細(xì)胞增多，膽管增生，纖維化等現(xiàn)象(圖5(b)-5(d))。

圖5 對照組斑馬魚肝組織HE 染色觀察圖

2.4 肝腸指數(shù)檢測結(jié)果

由肝腸指數(shù)可知，DEN 試劑會引起斑馬魚肝腸大小的變化。由于斑馬魚本身個體小的因素以及斑馬魚的肝臟包裹腸的特點，因此在實驗過程中，將斑馬魚的肝腸同時稱重并記錄。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著DEN 濃度的增加，肝腸指數(shù)有逐步增大的趨勢。經(jīng)過統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異計算，50 μg/mL 的DEN給藥組與對照組相比無顯著性差異;100 μg/mL和150 μg/mL 的DEN 都能顯著增大斑馬魚的肝腸指數(shù)，其中濃度為100 μg/mL 時，P＜0.05，濃度為150 μg/mL 時，P＜0.01。由此說明，DEN 在0～150 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，能夠呈濃度依賴性地誘導(dǎo)斑馬魚肝腸指數(shù)升高。建模后各實驗組斑馬魚肝腸指數(shù)直方圖見圖6。與對照組(0 μg/mL)相比，100 μg/mL 和150 μg/mL 的DEN 都能顯著增大斑馬魚的肝腸指數(shù)，其中150 μg/mL 時效果更好。圖6中，* 代表P＜0.05，＊＊代表P＜0.01。

圖6 建模后各實驗組斑馬魚肝腸指數(shù)直方圖

2.5 肝臟血管新生檢測結(jié)果

第10 周后，根據(jù)解剖后觀察斑馬魚肝臟的血管新生情況并記錄實驗數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)(表1)，對照組斑馬魚肝臟的血管未有增多現(xiàn)象，實驗組斑馬魚肝臟的血管產(chǎn)生了不同程度的血管增生，且血管新生的嚴(yán)重程度隨著誘導(dǎo)劑DEN 的濃度增大而加劇。

表1 斑馬魚肝臟血管新生程度 %

3 討論

DEN 作為經(jīng)典的肝癌造模誘導(dǎo)劑，將斑馬魚長期飼養(yǎng)于含DEN 試劑的溶液中會導(dǎo)致斑馬魚產(chǎn)生肝纖維化，從而發(fā)生癌變［13］。Mizgireuv 采用DEN 誘導(dǎo)8 周并清水喂養(yǎng)9 個月(共11 個月)產(chǎn)生腫瘤［7］;Fujisawa 等采用同種藥物誘導(dǎo)2 個月并清水喂養(yǎng)4 個月(共6 個月)成功構(gòu)建斑馬魚肝臟腫瘤模型［9］。經(jīng)過查閱大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其他同類斑馬魚肝癌模型的建立時間均較長，本研究將斑馬魚直接浸泡于含DEN 藥物的溶液中，DEN 誘導(dǎo)9 周并清水喂養(yǎng)1～2 周，即可觀察到較為明顯的肝臟腫瘤，并能夠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。與現(xiàn)有的研究相比，誘導(dǎo)周期短且效果明顯，極大地縮短了實驗時間，提高了實驗效率，為肝癌藥物的快速篩選提供理論參考。

肝癌的高死亡率迫使人類對其研究不斷深入，以便得到最佳的治療方法，但目前尚無臨床療效肯定的直接抗肝癌的藥物。此外，小鼠類實驗動物的藥物篩選相對繁瑣且費時費力。因此，建立穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟的肝癌動物模型具有重要意義。斑馬魚作為模式動物具有高通量的特點，對用藥量需求少，給藥方式簡單且價格便宜。更重要的是，相較于采用肝臟轉(zhuǎn)基因斑馬魚等模型［14］，實驗使用野生型AB 系斑馬魚，成本降低至轉(zhuǎn)基因斑馬魚的幾十分之一，經(jīng)濟性更明顯。此外，斑馬魚本身個體小，全身血量少，不容易采用常規(guī)方法檢測。本項目優(yōu)化出斑馬魚肝癌的檢測手段，與之前多數(shù)研究的評價方式相比，采用斑馬魚體表和肝臟外觀肉眼觀察、肝腸指數(shù)檢測、石蠟切片HE 染色、肝臟血管新生率等方法，多維度評價斑馬魚肝癌的發(fā)生，可使評價方法更加完善和客觀。

由實驗數(shù)據(jù)可知，在DEN 暴露處理第3～4 周開始，實驗組斑馬魚體重變輕，游動減緩，但在大體外觀上與對照組斑馬魚無顯著差異，通過石蠟切片并進(jìn)行HE 染色發(fā)現(xiàn)，實驗組斑馬魚肝臟細(xì)胞數(shù)量有增多現(xiàn)象;DEN 處理5～8 周時，觀察到實驗組部分斑馬魚出現(xiàn)脊柱彎曲現(xiàn)象，解剖時發(fā)現(xiàn)實驗組斑馬魚腹部出現(xiàn)油狀腹水且腹水情況隨著濃度的增大而加重，此外，肝臟顏色變淺，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象;DEN 處理9 周開始，實驗組斑馬魚魚鰭附近以及腹部存在腐爛情況，體表黏膩，魚鱗易脫落，部分個體有體表出血等現(xiàn)象，解剖時發(fā)現(xiàn)實驗組斑馬魚肝臟組織有明顯的變大變重，肝臟表面出現(xiàn)明顯的血管新生的現(xiàn)象，并且肝臟顏色變?yōu)榈S色，與對照組斑馬魚肝臟的暗紅色相比有顯著差異。由于DEN 的強致癌性，毒性較大，實驗過程中會不斷有斑馬魚無法耐受而死亡。在斑馬魚肝臟模型的檢測中，受限于個體特征，斑馬魚本身的血流量較少，無法利用常規(guī)的肝癌檢測方法準(zhǔn)確檢測，只能通過組織形態(tài)學(xué)與病理切片觀察。肝癌模型對肝組織進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察可以明顯看到組織產(chǎn)生腫瘤，顆粒狀囊腫，整個肝臟邊緣模糊化，伴有一定的油狀腹水;HE 染色檢測結(jié)果顯示，對照組斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞大小均一，肝細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常，未見明顯空泡。而DEN 給藥組肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的破裂空洞的現(xiàn)象，肝細(xì)胞排列松散凌亂，大小不一。

此外，實驗中把肝臟血管新生的程度作為評價肝癌模型構(gòu)建的指標(biāo)之一，主要是考慮到腫瘤的產(chǎn)生過程中，需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子和氧氣等支持細(xì)胞不斷增殖，而血管是運輸這些物質(zhì)的主要載體。為獲取這些必需物質(zhì)，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移、侵入、管形成等過程，因此，從血管新生的數(shù)量及程度可以間接評估出腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展［15］。

4 結(jié)論

采用DEN 作為肝癌誘導(dǎo)劑，在9 周內(nèi)成功建立了斑馬魚肝臟癌癥模型，并在誘導(dǎo)過程中優(yōu)化了誘導(dǎo)時間與給藥濃度，證明了DEN 在0～150 μg/mL 濃度范圍內(nèi)能夠呈濃度依賴性地誘導(dǎo)斑馬魚肝腸指數(shù)的增加，促進(jìn)肝臟的血管新生以及誘導(dǎo)斑馬魚肝臟的癌變過程。與傳統(tǒng)的動物模型相比，優(yōu)化后的實驗?zāi)Ｐ途哂薪?jīng)濟、高效、評價手段完善的特點，為進(jìn)一步研究肝癌的發(fā)病機制及治療藥物的篩選提供了評價手段。