3種消毒劑對早期鹵蟲幼體的毒性研究

蔣湘，呂美霞，許樂樂，朱文燕，魏亦彤，王鋰韞，陳道海*

（1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048；2.廣東省粵西海鮮資源可持續(xù)利用工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524048）

鹵蟲（）又稱鹽水豐年蟲、豐年蝦、鹽蝦或鰓足蟲，為廣溫耐高鹽型甲殼動物，屬于節(jié)肢動物門，甲殼亞門，鰓足綱，無甲目，鹽水豐年蟲科，鹵蟲屬（）。其分布廣，世界各地沿海高鹽水域、海岸鹽田及內(nèi)陸鹽湖等均有分布。中國主要產(chǎn)地為長江以北沿海及內(nèi)陸等地，天津長蘆鹽場是最著名的鹵蟲產(chǎn)地。鹵蟲具有較高的經(jīng)濟(jì)價值與科研價值。鹵蟲生長迅速，繁殖周期短，幼體與成蟲富含蛋白質(zhì)、脂肪酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是海水養(yǎng)殖的優(yōu)良餌料和天然誘食劑。鹵蟲能濾食鹽田中的藻類和固體懸浮顆粒，改良水質(zhì)，提高產(chǎn)鹽質(zhì)量。鹵蟲因其生活習(xí)性和生理結(jié)構(gòu)，常用于環(huán)境污染物評價和生態(tài)毒理學(xué)研究，被列為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗生物。

無節(jié)幼體期的鹵蟲存活率較低，養(yǎng)殖過程中容易受水體中原生動物（纖毛蟲、輪蟲）及攜帶的細(xì)菌病毒等感染，餌料投喂前，需定期對其培養(yǎng)水體進(jìn)行消毒。高錳酸鉀（KMnO、甲醛（HCHO）和強(qiáng)氯精（TCCA）是一類常用的消毒劑，可以殺滅各種原生動物、病原微生物與細(xì)菌等，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，但是用量超過藥物安全濃度會導(dǎo)致養(yǎng)殖動物出現(xiàn)中毒甚至死亡。陳婕以美國舊金山大鹽湖品系為材料研究了HCHO對鹵蟲I期無節(jié)幼體的毒性，通過擬合回歸曲線計算出半致死濃度；劉淇等研究了TCCA等7種消毒劑對北方鹵蟲幼體的急性毒性；于利等研究了KMnO等4種消毒劑對山西兩性鹵蟲不同發(fā)育時期耐受力的影響；李玉全以河北鹽田鹵蟲為材料研究抗菌藥物恩諾沙星對鹵蟲無節(jié)幼體的急劇毒性等。以上研究多集中在中國內(nèi)陸地區(qū)，利用人工配置海水來開展毒理研究，而在廣東沿海地區(qū)利用鹵水（天然海水析出鹽晶過程中，濃縮形成的高濃度的海水）開展鹵蟲毒性研究的報告較少?，F(xiàn)開展3種消毒劑對鹵蟲早期幼體毒性的研究，利用概率單位法估算3種消毒劑的半致死濃度與安全濃度，以期為南方沿海鹵蟲養(yǎng)殖及海水增養(yǎng)殖中合理使用消毒劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點(diǎn)與材料

試驗地點(diǎn)位于湛江嶺南師范學(xué)院水生動物實(shí)訓(xùn)基地內(nèi)。所用鹵蟲休眠卵由湛江海神生物科技發(fā)展有限公司提供，鹵蟲卵化時間28～30 h，孵化溫度27℃，光照2 000 lx，鹽度3.0%，ρ（溶解氧）＞7 mg/L，孵化密度0.5 g/L，全程持續(xù)增氧。孵化鹵水來自湛江坡頭區(qū)南三島南三鹽場，鹵水鹽度5.8%，釋稀鹽度至3.0%使用。試驗用水進(jìn)行過濾、消毒、曝氣、沉淀、增氧處理。孵化前淡水浸泡30 min左右，08：00開始孵化，次日12：00于恒溫光照培養(yǎng)箱中開始毒理試驗。容器為直徑11 cm、高3 cm的圓柱形食品級塑料桶，有效水體積200 mL。試劑為KMnO分析純，有效含量99.9%）、HCHO（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%）、TCCA（三氯異氰脲酸粉TCCA，含有效氯30%）。溶液的配制方法為：用天平稱取一定質(zhì)量的KMnO、TCCA，用去離子純凈水配制KMnO母液質(zhì)量濃度1 g/L（現(xiàn)用現(xiàn)配）、TCCA母液質(zhì)量濃度1 g/L（現(xiàn)用現(xiàn)配），定容500 mL，HCHO溶液濃度直接配制。

1.2 試驗設(shè)計

按水生動物毒理學(xué)試驗方法開展預(yù)試驗。按等比間距設(shè)置濃度區(qū)間，找到3種消毒劑對鹵蟲的24 h全死亡濃度和48 h全存活濃度，再根據(jù)濃度區(qū)間上下限按等對數(shù)間距設(shè)置濃度梯度，開展正式試驗。KMnO濃度區(qū)間為1.00～256.00 mg/L，HCHO濃度區(qū)間為800.00～6 400.00 mg/L，TCCA濃度區(qū)間為16.00～128.00 mg/L。1個濃度梯度設(shè)置3個平行組，1種消毒劑設(shè)置3個對照組，每組放鹵蟲幼體30只。試驗開始后不充氣、不換水、不投喂。分別于6，12，24，48 h觀察幼蟲的存活狀態(tài)，統(tǒng)計死亡幼體數(shù)量并用吸管吸出死亡幼體，計算所有試驗組的平均死亡數(shù)。毒性試驗重復(fù)2次。死亡鹵蟲幼體判斷標(biāo)準(zhǔn)為幼體沉于底部，且碰觸其附肢10 s沒有反應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)，建立概率單位-質(zhì)量濃度的直線回歸方程，并繪制出根據(jù)模型擬合的毒性預(yù)測回歸曲線，估算KMnO、HCHO、TCCA對鹵蟲幼體的24和48 h半致死濃度值（LC及95%置信區(qū)間。試驗中對照組出現(xiàn)死亡的數(shù)據(jù)利用SPSS概率回歸分析中的校正功能進(jìn)行校正，做回歸直線擬合，在自然響應(yīng)頻率選項Value值中填入對照組死亡數(shù)。安全濃度（SC）計算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑對鹵蟲的毒性

試驗中發(fā)現(xiàn)鹵蟲對3種消毒劑的中毒癥狀不完全一致。鹵蟲接觸低濃度消毒劑6 h后，死亡數(shù)量很少，大部分個體活動正常，與對照組無明顯差異；12 h后，部分個體表現(xiàn)出游動緩慢，趨光性減弱，附肢擺動頻率變慢等現(xiàn)象；24 h后，部分個體沉入水底，附肢有微微擺動，少量個體已經(jīng)死亡。3種消毒劑對鹵蟲毒性試驗結(jié)果見表1。由表1可見，隨著消毒劑濃度的提高，鹵蟲死亡數(shù)量明顯上升，在試驗的起始濃度時，鹵蟲24和48 h均無死亡個體；在最終濃度時，鹵蟲24 h死亡率均達(dá)到100%。配對樣本雙側(cè)檢驗表明，每種消毒劑的24與48 h平均死亡數(shù)存在顯著差異（＜0.05）。

表1 3種消毒劑對鹵蟲毒性試驗結(jié)果

2.2 概率單位回歸分析

2.2.1 擬合回歸方程

用概率單位法分析擬合KMnO、HCHO和TCCA對鹵蟲急劇毒性影響的線性回歸方程如下?；貧w方程Pearson擬合優(yōu)度檢驗值均大于0.15，說明模型擬合較為理想。式中：PROBIT為對應(yīng)的概率單位應(yīng)變量值；lg（濃度）為對應(yīng)藥物濃度的對數(shù)。

2.2.2 LC和SC估算

通過以上擬合的回歸方程估算LC及濃度95%的置信區(qū)間，求得3種消毒劑的SC。LC通過SPSS分析中概率單位法計算得到。KMnO對鹵蟲幼體的24和48 h LC為21.333和9.003 mg/L；HCHO對鹵蟲幼體的24和48 h LC為2 698.019和1 671.508 mg/L；TCCA對鹵蟲幼體的24和48 h LC為45.217和33.788 mg/L；KMnO、HCHO和TCCA的SC分別為0.481，192.467和5.660 mg/L。根據(jù)SC大小來確定敏感的順序，SC越小，越敏感。鹵蟲幼體對3種消毒劑的敏感度從高到低依次為KMnO、TCCA、HCHO。

3 討論

本試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果，均符合水生生物急劇毒性試驗質(zhì)量控制要求，對照組死亡率≤10%；試驗組中有≤37%和≥67%組存在；試驗需設(shè)置至少5個及上的濃度梯度；用相同配制的溶液、相同的試劑、相同的操作方法得到的2次重復(fù)試驗結(jié)果之比小于2。

LC的計算方法較多，國內(nèi)普遍采用的方法有3種，即改良寇氏法、概率單位法（Bliss法）和線性回歸法。本試驗通過Bliss法研究3種消毒劑對鹵蟲的毒性效應(yīng)，擬合回歸直線求得LC與SC，進(jìn)一步提高試驗結(jié)論的準(zhǔn)確性與可信度。

3.1 KMnO4對早期鹵蟲幼體的急劇毒性效應(yīng)

KMnO為一種強(qiáng)氧化劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上應(yīng)用廣泛。KMnO通過與有機(jī)體接觸，快速氧化酶蛋白及其中的活性基團(tuán)（如-SH巰基團(tuán)等），因此常用來給有效水體殺菌、消毒，去除原生動物等，但高濃度的KMnO會導(dǎo)致水生動物死亡。目前，關(guān)于KMnO對水生動物的毒性研究報道較多，多種水生動物的KMnOSC已經(jīng)用于指導(dǎo)實(shí)踐。如凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦和中國龍蝦的KMnOSC分別為0.28，0.48和1.32 mg/L，雙齒圍沙蠶和中華絨螯蟹的SC分別為1.40和0.15 mg/L。于利等研究了KMnO等消毒劑對山西兩性鹵蟲不同發(fā)育時期的影響，表明鹵蟲對KMnO的SC≤1 mg/L。本研究得到KMnO對鹵蟲幼體的24和48 h LC分別為21.333和9.003 mg/L，KMnOSC為0.481 mg/L，與于利等及其他水生動物指導(dǎo)SC相近。

3.2 HCHO對早期鹵蟲幼體的急劇毒性效應(yīng)

HCHO是一種廣譜殺菌消毒劑，主要是通過烷基化反應(yīng)使蛋白質(zhì)變性，從而來殺滅病原微生物，對細(xì)菌、芽孢、真菌及原生動物均有較強(qiáng)的殺滅作用，持續(xù)時間較其他消毒劑長，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常應(yīng)用于受精卵、幼體、蝦苗及鹵蟲無節(jié)幼體等的消毒，育苗水處理以及原生動物等寄生蟲病害的防治等，對凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦仔蝦的SC為2.62和3.56 mg/L。生產(chǎn)中用150~200 mg/L的HCHO消毒對蝦無節(jié)幼體，浸泡30~60 s，用于防治日本囊對蝦等養(yǎng)殖中出現(xiàn)的鐘形蟲及聚縮蟲病。在鹵蟲孵化過程中，可用HCHO對收集的無節(jié)幼體進(jìn)行消毒。陳婕研究HCHO對美國舊金山大鹽湖鹵蟲I期幼體的毒性效應(yīng)，得到24 h LC為1 590 mg/L。張文博等以美國大鹽湖的鹵蟲為受試生物，評估HCHO對水環(huán)境的毒性，24和48 h LC為16.765和4.783 mg/L。本研究中，HCHO對鹵蟲幼體的24和48 h LC為2 698.019和1 671.508 mg/L，SC為192.467 mg/L，高于陳婕、張文博等的研究結(jié)果。這可能是由于不同產(chǎn)地鹵蟲遺傳多樣性不同，對脅迫因子的耐受性也不同。此外，試驗條件（水質(zhì)、光照、鹽度、pH值等），試驗鹵蟲活動狀態(tài)和挑選試驗鹵蟲的隨機(jī)性等都是引起結(jié)果差異的原因。在鹵蟲養(yǎng)殖上，可參考HCHO SC不超過192.467 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)對水體進(jìn)行消殺，以預(yù)防病原微生物感染。

3.3 TCCA對早期鹵蟲幼體的急劇毒性效應(yīng)

TCCA是一種有效含氯濃度達(dá)30%的廣譜殺菌消毒劑，對細(xì)菌、真菌、芽孢、病原微生物及病毒均有高效的殺滅作用，在多種水產(chǎn)動物的人工繁育及養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛。羅氏沼蝦仔蝦SC為0.124 mg/L，凡納濱對蝦幼蝦SC為0.15 mg/L。含氯消毒劑在池壁消毒、水體病原微生物殺滅的應(yīng)用中，效果顯著。研究表明，含氯消毒劑、聚維酮碘和碘液（2%）對卵子表面消毒效果均較好，而且不降低卵子活性，但以含氯消毒劑的效果最佳。劉淇等研究得到TCCA對鹵蟲無節(jié)幼體的SC為0.79 mg/L。王興林研究得到有效氯對鹵蟲幼體24和48 h LC為2.88和1.99 mg/L，SC為0.097 mg/L。本研究得到TCCA的SC為5.660 mg/L，顯著高于劉淇等和王興林的研究結(jié)果。引起結(jié)果差異的原因較多，劉淇等所用含消毒劑的有效氯含量為88%，而王興林試驗過程中每間隔24 h 100%更換試驗海水，有效氯含量和SC的計算方法不同是分別是導(dǎo)致結(jié)果差異的主要原因。因此，可參考不同條件下的TCCA消毒SC，既可以殺滅大多數(shù)細(xì)菌和病原體，又不影響鹵蟲幼體生長。