柚皮素－β－環(huán)糊精包合物對鎘致精子損傷的保護作用

胡振良　何奉姣　賀睿昕　黃耀　鄧霖萱　袁衡

摘要：目的 探討柚皮素對鎘致大鼠精子損傷的干預(yù)作用及其可能的機制。方法 SPF級SD系成年雄性大鼠（200±20g）36只，動物適應(yīng)1周后按質(zhì)量隨機分成6組：陰性對照組;模型組;Nar-β-CD干預(yù)組;陽性對照組。模型組和各干預(yù)組以及陽性對照組以0.4mg/kg體質(zhì)量進行氯化鎘腹腔注射染毒，陰性對照組注射等量生理鹽水，連續(xù)進行4周。染毒的同時干預(yù)組分別灌胃50，100，200mg/kg Nar-β-CD，陽性對照組給予0.4mg/kg亞硒酸鈉灌胃，陰性對照組與模型組灌胃等量生理鹽水，持續(xù)4周并觀察大鼠的一般情況，實驗終末收集血清、睪丸和附睪等組織，待檢測相關(guān)指標。結(jié)果 與模型組相比Nar-β-CD低、中、高劑量組干預(yù)后，血漿及睪丸組織鎘含量顯著下降（P<0.05），而睪丸組織中MDA均顯著降低（P<0.05），中、高Nar-β-CD劑量組的超SOD和GSH-Px活性明顯上升（P<0.05），血清性激素組中的T有所升高（P<0.05）;與模型組相比Nar-β-CD低、中、高劑量組干預(yù)后，精子密度均有所上升（P<0.05）精子畸形率均有所下降（P<0.05）。結(jié)論 柚皮素能夠部分拮抗鎘致大鼠精子損傷，可能與抗脂質(zhì)過氧化和維持生精環(huán)境穩(wěn)定以及抑制細胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 柚皮素;環(huán)糊精;鎘;脂質(zhì)過氧化;

鎘（Cadmium，Cd）元素是一種常見的重金屬污染物，鎘元素主要是通過化肥、電鍍、鎳-鎘電池生產(chǎn)等方式產(chǎn)生并在環(huán)境中殘留[1]。Cd可能通過引起精子DNA氧化損傷而致精子損傷或畸形多個國家和地區(qū)已將Cd列為高危害有毒物質(zhì)加以管理。美國環(huán)境保護署也將Cd納入重要污染物名單，同時景觀國際癌癥研究所的長期研究，該元素長期接觸還能致癌。將其列為Ⅰ級致癌物[2]。

柚皮素（naringenin，Nar）屬于二氫黃酮類化合物，是一種單體，是柚皮苷的苷元，多是在一些柑橘類水果、西紅柿、蕓香科植物葡萄柚出現(xiàn)。國外學(xué)者經(jīng)過對柚皮素的長期研究發(fā)現(xiàn)，它在抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗衰老都有特殊的療效，在肝功保護、脂肪代謝免疫調(diào)節(jié)上有著良好的作用，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用與開發(fā)。

Nar具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用，這些特性可能在Cd致精子損傷的治療過程中起到積極作用，整理當(dāng)前對Nar生物學(xué)性質(zhì)的有限研究，暗示Nar能有效應(yīng)用于Cd致精子損傷的治療。假設(shè)Nar對Cd致精子損傷的治療具有積極作用，本研究通過制作大鼠Cd致精子損傷的模型以觀察Nar的藥理作用，為Nar的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1.實驗材料及方法

1.1主要藥物與試劑

氯化鎘Cdcl·5HO（分析純）;β-環(huán)糊精β-cyclodextrin（分析純）;柚皮素（純度>98%）;二甲亞砜和亞硒酸鈉;ELISA試劑盒，包括GSH-PX、血清性激素T、FSH、LH、 SOD、MDA。

1.1.1柚皮素-β-環(huán)糊精包合物（Nar-β-CD）的制取

要制取，先要稱取Nar0.5克，將這0.5Nar溶解于少量乙醇中。按1：1摩爾比準確稱取β-CD2.08g，稱取少量蒸餾水，倒入β-CD2中，將其制成飽和溶液。然后將含有柚皮素的乙醇溶液加入其中，在60℃環(huán)境下進行30分鐘的攪拌，將二者攪拌均勻，使其充分混合。在加熱停止后繼續(xù)進行5h的攪拌，繼而將其冷卻，放置在4℃環(huán)境下冷置一夜，第二天取出，過濾，將過濾出來的固體放置在保持40℃的真空干燥箱中進行24h的干燥。最后得出了76±3%產(chǎn)率的Nar-β-CD包合物。最終產(chǎn)率76±3%[3]。分裝入密封玻璃瓶置于4℃冰箱保存，當(dāng)需要用時放至室溫后配制搖勻后進行灌胃。

1.2主要實驗儀器

本次實驗需要儀器包括醫(yī)用離心機，上海一恒科學(xué)儀器有限公司的真空干燥箱，安捷倫火焰原子吸收光譜儀， Infinite F50酶標儀，顯微鏡，超凈工作臺，實驗室用醫(yī)學(xué)恒溫水浴箱。

1.3動物分組及給藥

在長沙天勤生物技術(shù)有限公司采購了36只許可證編號為SCXK（湘）2019-0014的成年雄性大鼠，都是SPF級SD系的，每只體質(zhì)量（200±20g）;這36只大鼠每天維持普通飼料飼養(yǎng)。在檢疫室觀察一周后1周后按照體質(zhì)量標號抽簽隨機分成6組：陰性對照組;模型組;50mg/kg Nar-β-CD干預(yù)組;100mg/kg Nar-β-CD干預(yù)組;200mg/kg Nar-β-CD干預(yù)組;陽性對照組。Nar-β-CD各劑量干預(yù)組、模型組這三組都采取體質(zhì)量為0.4mg/kg的氯化鎘腹腔注射染毒，注射期4周，陰性對照組則是給予生理鹽水，同樣也是給予0.4mg/kg體質(zhì)量的生理鹽水注射，連續(xù)4周都進行注射。除了對其進行染毒，還要同步進行干預(yù)，對低干預(yù)組給予50mg/kg的Nar-β-CD灌胃，中干預(yù)組則給予100，高干預(yù)組給予200，給予陽性對照組0.4mg/kg亞硒酸鈉灌胃，陰性對照組與模型組灌胃等量生理鹽水，持續(xù)4周并觀察大鼠的一般情況。

1.4實驗方法

1.4.1標本采集與組織處理

在實驗進行第4周末，用10%水合氯醛進行腹腔麻醉，從眼底靜脈叢采血，血液靜置45min后進行離心制備血清，樣品冷藏于-20℃冰箱中備用，同時解剖分離附睪、睪丸稱取臟器濕重（模型組有一只右側(cè)睪丸消失）。

1.4.2精子密度和精子形態(tài)的檢查

迅速地取得各組大鼠一側(cè)附睪尾，再次稱重。置于附睪稀釋液（預(yù)溫36℃的臺式液）2ml的小燒杯中，用眼科剪將其充分剪碎。將其吹打均勻，完成均勻吹打以后在35℃的溫箱進行5-10分鐘的孵育。放置一滴懸液在血細胞計數(shù)板上，在上面覆蓋一張蓋玻片，在進行2min的靜置后，采取紅細胞計數(shù)法（×400）進行精子數(shù)計算;清潔玻璃片的一側(cè)放置一滴懸液，然后推片晾干再以甲醇固定5min，等干燥過后，使用20g/L伊紅染色2h，沖洗干燥。在高倍鏡下觀察一千個較為完整的精子（考慮到畸形缺失部分），再記錄畸形的精子數(shù)目，主要觀察頭體尾三部分的形態(tài)異常。

1.4.3睪丸組織的制備

根據(jù)實驗需要，取一定質(zhì)量睪丸，將睪丸組織的被膜去除，再將其稱重，將睪丸實質(zhì)剪碎，繼而加入生理鹽水，生理鹽水比例為1∶4g/ml，再采用玻璃勻漿器制作睪丸勻漿液，將勻漿液放在低溫高速離心機中，進行30min離心，離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，30min后將液體靜置，提取上清液，放置在以便備用，主要是用來對睪丸組織內(nèi)含有的SOD的酶活力、MDA含量、GSH-PX等的測量。

1.4.4血清性激素T、FSH、LH水平測定 按試劑盒用Elisa法測定

1.4.5睪丸組織與血漿的鎘含量檢測

睪丸和血清中的鎘含量可以采用原子吸收光譜法石墨爐法進行檢驗。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件統(tǒng)計分析各分組測量數(shù)據(jù)，采用平均數(shù)±標準差形式表示結(jié)果。各組數(shù)據(jù)采用SNK-q檢驗、單因素方差分析方式進行兩兩比較。

2.結(jié)果

2.1對大鼠血液、睪丸組織中Cd含量的影響

通過對陰性對照組和模型組大鼠血漿和睪丸組織中Cd含量的測算，得出：陰性對照組血液Cd含量為0.050±0.01 ug/L;睪丸組織含Cd量為5.23±0.89 ug/g。模型則的為1.355±0.08 ug/L，（P<0.05）;睪丸組織含Cd量為208.58±0.12 ug/g，（P<0.05），說明實驗造模成功。分別對剩余各組血液、睪丸組織Cd含量的測算得出：與模型組相比，陽性對照組的血液Cd含量約為模型組的56%（P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，而睪丸組織Cd含量約為模型組的72%（P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比給予Nar-β-CD的濃度分別為50、100、200 mg/kg 時，血液Cd含量分別約為模型組的71%、49%、46%（P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，而睪丸組織含Cd量分別約為模型組的89%、76%、67% （P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。Nar-β-CD干預(yù)組隨Nar-β-CD給予濃度越大，大鼠血液、睪丸組織內(nèi)殘留的Cd濃度就越小，既Nar-β-CD濃度越高其治療效果越理想。最終獲得實驗數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義，表1是各組大鼠血漿鎘和睪丸組織鎘含量的比較數(shù)據(jù)情況。

Nar-β-CD：柚皮苷β環(huán)糊精包合物。對比陰性對照組， *P<0.05;與模型組相比較#P<0.05

2.2 對大鼠血清睪酮、黃體生成素卵泡刺激素的影響

在進行前面的測算可知，大鼠卵泡激素水平和黃體生成素并不受Cd的影響（P>0.05），即該數(shù)據(jù)差別無統(tǒng)計學(xué)意義。但在清睪酮水平方面，模型組的明顯要比對照組的低很多（P<0.05），這也表明，大鼠清睪酮水平會受Cd影響，且影響較大。相較于陰性對照組Nar-β-CD干預(yù)組給予濃度為50mg/kg時血清睪酮水平約為陰性對照組的53%（P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。但其血清睪酮水平，和模型組的相比并沒有太大差別（P>0.05），差別不具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明給予較低濃度的Nar-β-CD干預(yù)Cd致大鼠血清睪酮水平的能力有限。當(dāng)給予Nar-β-CD濃度提高至100、200 mg/kg時，血清睪酮水平較模型組顯著提高，分別提高約24%、36%（P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明當(dāng)Nar-β-CD達到一定濃度后，隨給予Nar-β-CD濃度的提升，大鼠的血清睪酮濃度亦有所提升。具體數(shù)據(jù)如表2所示。

Nar-β-CD：柚皮苷β環(huán)糊精包合物。對比陰性對照組， *P<0.05;與模型組相比較#P<0.05

2.3對大鼠精子數(shù)目和精子畸形率的影響

通過對各組大鼠附睪尾部鏡下精子的計數(shù)和觀察得出：陰性對照組精子密度為37.34±1.45×106/100mg，精子畸形率約為2.5%。模型組精子密度跟陰性對照組相比，模型組的為10.37±0.75 ×106/100mg （P<0.05），但精子也有較高畸形率，這一數(shù)值高達17.8%、表明大鼠精子密度明顯會受Cd影響，同時還會通過其影響導(dǎo)致精子畸形。各組精子密度明顯比模型組高，精子畸形率低于模型組（P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中Nar-β-CD干預(yù)組的治療效果隨給予Nar-β-CD的濃度的增加而不斷增大，給予各個濃度干預(yù)下大鼠精子密度分別為13.04±1.59×106/100mg、24.24±2.24×106/100mg、27.97±0.68×106/100mg（P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。精子畸形率分別約為13.6%、9.2%、6.2%（P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。具體數(shù)據(jù)詳見表3。

Nar-β-CD：柚皮苷β環(huán)糊精包合物。對比陰性對照組， *P<0.05;與模型組相比較#P<0.05

2.4對大鼠睪丸組織過氧化損傷的影響

模型組睪丸組織中的MDA較之陰性對照組更高，約為其1.8倍，模型組睪丸組織中的SOD、GSH-PX分別約為陰性對照組的79%、75%（P<0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明Cd能通過減少大鼠睪丸組織內(nèi)的SOD、GSH-PX的含量，從而增加了MDA的生成，致大鼠睪丸組織出現(xiàn)過氧化的損傷。相較于模型

組，明顯陽性對照組的相關(guān)指標會更加優(yōu)秀一些， MDA：7.10±1.04 nmol/ml，SOD：154.88±6.25 U/ml，GSH-PX：351.95±14.50 U/ml。Nar-β-CD干預(yù)組中，當(dāng)給予Nar-β-CD較低時，其SOD、GSH-PX 的活力指標與模型組相差不大（P>0.05）。伴隨Nar-β-CD干預(yù)組給予Nar-β-CD濃度的提升，MDA的濃度越低，SOD、GSH-PXD的活力指標越高。詳見表4

Nar-β-CD：柚皮苷β環(huán)糊精包合物。對比陰性對照組， *P<0.05;與模型組相比較#P<0.05

3 討論

柚皮素富含多種生物活性，它廣泛的存在于西紅柿、葡萄、柑橘類水果中，同時也是桃葉、枳實等中藥的有效成分。很多學(xué)者都對柚皮素[4]進行了大量研究，景觀研究也表明，它在抗纖維化、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護上都有著獨特功效。Ortiz[5]等人檢測柚皮素毒理性研究中，發(fā)現(xiàn)其屬于OECD的第五等級，表明柚皮素毒性較小，安全性高。但它水溶性較差，缺乏良好的生物利用度，針對這一特點，可通過引入較強水溶性基因來修飾，采取這種方式能夠提升柚皮素的生物利用度。環(huán)糊精分子[6]的外壁具有親水性，同時還有富電性疏水空腔，一般常作用在穩(wěn)定性差的藥物分子載體或用來克服藥物水溶性。XU[7]等人通過大量研究也表明，相對來說，柚皮素-β-環(huán)糊精包合物（Nar-β-CD）明顯會有更高的生物活動和水溶性。

多位學(xué)者的長期研究表明，當(dāng)體內(nèi)進入鎘以后，會導(dǎo)致體內(nèi)細胞發(fā)生氧化損傷。出現(xiàn)DNA鏈斷裂、脂質(zhì)過氧化等。之所以會出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化是因為在鎘的誘導(dǎo)下，大量活性氧（ROS）因此產(chǎn)生，過多的ROS會損傷體內(nèi)細胞，導(dǎo)致細胞出現(xiàn)凋亡或突變的情況。谷胱甘肽（GSH）能夠?qū)@一現(xiàn)象進行緩解，它主要是受GSH-Px調(diào)控，一旦它的活性下降，就會減少GHS的生成。SOD，即超氧化物歧化酶能夠?qū)Ⅲw內(nèi)過量ROS清除，它是一種重要的抗氧化酶。脂質(zhì)過氧化會產(chǎn)生丙二醛（MDA）[8]，所以脂質(zhì)過氧化發(fā)生程度都可以用GSH-Px、SOD以及MDA的活性和含量的變化表達。明顯本次研究中，睪丸組織在染鎘后，MDA含量有明顯的上升，而GSH-Px活性與SOD都有所下降，這也表明因細胞損壞增加了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，清除過氧化自由基因其變化有所下降。50、100及200mg/kg的Nar-β-CD干預(yù)組睪丸組織氧化產(chǎn)物MDA含量下降，抗氧化酶GSH-Px與SOD酶活力上升，提示Neg-β-CD對鎘造成的脂質(zhì)過氧化損傷有一定的保護作用。

本研究顯示，染鎘組的大鼠睪丸組織中的鎘含量均非常明顯上升，模型組相比陰性對照組鎘含量高40倍，表明鎘能通過血睪屏障進入睪丸，是鎘的靶器官之一。睪丸功能可通過精子密度和畸形率來客觀反映。通過研究發(fā)現(xiàn)，精子密度會受鎘元素影響，低劑量鎘能夠?qū)е戮踊温噬仙?倍，密度下降72%，在組織受鎘感染以后，會因為出現(xiàn)氧化應(yīng)激，發(fā)生細胞損傷和調(diào)往。Ren[9]等人通過Bcl-2、Bax蛋白以及天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）水平變化推測出鎘染毒引發(fā)睪丸生精細胞凋亡為內(nèi)源性（線粒體）凋亡通路。此次研究表明，在降低精子畸形率、提高精子密度上， Nag-β-CD有一定的功效。睪酮參與精子發(fā)生的調(diào)控，LH可刺激睪丸間質(zhì)細胞合成孕酮，并在3β-HSD的作用下轉(zhuǎn)化成睪酮，本研究結(jié)果顯示，血清睪酮下降近50%而FSH與LH均出現(xiàn)了一定程度下降，但是并沒有統(tǒng)計學(xué)意義。血清性激素的水平變化提示下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）受到Cd環(huán)境的影響進而使得維系精子發(fā)生的微環(huán)境發(fā)生變化。

本實驗研究通過制成Nar-β-CD包合物對低劑量鎘污染雄性大鼠灌胃干預(yù)治療，對各項相關(guān)指標進行檢測，結(jié)果表明，Nar-β-CD中、高劑量組能夠較為明顯地抗脂質(zhì)過氧化損傷，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，降低MDA的含量，使得機體減少受ROS的破壞，保護睪丸組織。同時降低血漿與睪丸組織內(nèi)的含鎘量，減少鎘對機體的損傷，以及睪酮水平升高，維護HPG軸的穩(wěn)定，使得精子發(fā)生的微環(huán)境趨于平穩(wěn)，部分恢復(fù)生精功能。另一方面，Nar-β-CD可能降低生精細胞的凋亡，使得精子密度以及畸形率得以提高，但其作用機制尚有待研究。

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基金項目：2019年度湖南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目：湘教通[2019]219號-2429;長沙醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目：長醫(yī)教〔2019〕61號–049;

第一作者：胡振良（1999.10-），男，本科在讀，臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)

*通訊作者：袁衡（1980.03-），女，碩士，副教授，研究方向：生殖