QuEChERS前處理結(jié)合HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定原料乳中30種獸藥殘留

李婧妍，韓波，安樂，張瑞雪

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（楊凌），陜西 楊凌 712100）

原料乳通常是從奶牛乳房擠出來未經(jīng)過處理的生牛乳，優(yōu)質(zhì)、安全的原料乳供應(yīng)是現(xiàn)代乳業(yè)健康發(fā)展的重要保障。為促進(jìn)奶牛生長、防止各類疾病、降低死亡率，獸藥被廣泛應(yīng)用于奶牛養(yǎng)殖[1-2]。但由于獸藥使用過程中濫用、誤用以及不遵守休藥期等現(xiàn)象屢禁不止，導(dǎo)致過量的獸藥在牛奶中蓄積與殘留，當(dāng)殘留量超過一定限度時(shí)，會(huì)對(duì)人體造成潛在的危害[3-5]。GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》里明確規(guī)定了不得檢出的獸藥清單和禁用且不得檢出的獸藥清單，其中β-激動(dòng)劑類、磺胺類和喹諾酮類獸藥是我國畜禽產(chǎn)品重點(diǎn)監(jiān)控項(xiàng)目，也是我國農(nóng)業(yè)部門和市場(chǎng)監(jiān)管部門執(zhí)行畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全例行監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中主要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）廣泛應(yīng)用于獸藥殘留的檢測(cè)，該方法通過保留時(shí)間、特征離子以及離子對(duì)豐度比進(jìn)行定性、定量分析，方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高。獸藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用較多的前處理技術(shù)有液液萃取[6]、固相萃取[7]、加速溶劑萃取[8]、鹽析液相萃取法[9]、分散固相萃取[10]等。這些方法前處理過程復(fù)雜，大多需經(jīng)過提取、凈化、濃縮等步驟，且消耗耗材多、試驗(yàn)周期長、方法靈敏度低?？焖佟⒑?jiǎn)便、低價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe，QuEChERS）提取法具有高通量、試劑消耗少、成本低、環(huán)境友好的優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)檢測(cè)多種類藥物，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品和畜禽產(chǎn)品中多藥物殘留檢測(cè)。在乳制品獸藥殘留檢測(cè)中，QuEChERS提取法已應(yīng)用于大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類、胺酰醇類等獸藥的檢測(cè)[11-12]，但檢測(cè)對(duì)象多為單一類獸藥，且沒有同時(shí)檢測(cè)β-激動(dòng)劑類、磺胺類和喹諾酮類獸藥的研究方法。

QuEChERS提取法用于原料乳中多種類獸藥殘留的檢測(cè)存在兩個(gè)關(guān)鍵問題：原料乳基質(zhì)成分復(fù)雜，乳蛋白、乳脂肪、乳糖以及維生素和礦物元素等因素對(duì)獸藥殘留定量產(chǎn)生干擾[13]；另外，原料乳中同時(shí)存在脂溶性和非極性獸藥，而非極性獸藥又易與乳脂肪結(jié)合，導(dǎo)致獸藥提取難度增大，因此建立適宜的樣品提取方法對(duì)定量檢測(cè)至關(guān)重要。本文以原料乳為研究對(duì)象，通過考察提取溶劑、提取方法、凈化劑組成及配比對(duì)目標(biāo)獸藥回收率的影響，建立QuEChERS提取法結(jié)合HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定原料乳中β-激動(dòng)劑類、磺胺類和喹諾酮類獸藥的分析方法，可在1個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)同時(shí)檢測(cè)樣品中30種獸藥殘留，降低了檢測(cè)成本，縮短了檢測(cè)時(shí)間，對(duì)原料乳的質(zhì)量安全控制具有較高的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

LC-2010A高效液相色譜：日本島津公司；AB 4000 Q-Trap串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國SCIEX公司；電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）、MS3 型渦旋振蕩器：德國IKA公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)：美國Beckman公司；xs105DU十萬分之一分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；DCY-III氮吹水浴濃縮儀：北京金科精華苑技術(shù)研究所；Milli-Q超純水儀：美國Millipore公司。

1.2 材料與試劑

克倫特羅（clenbuterol，CLE）、沙丁胺醇（salbutamol，SAL）、萊克多巴胺（ractopamine，RAC）、特布他林（terbutaline，TER）、西馬特羅（cimaterol，CIM）、非諾特羅（fenoterol，F(xiàn)EN）、氯丙那林（clorprenaline，CLO）、妥布特羅（tulobuterol，TUL）、噴布特羅（penbuterol，PEN）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99%）：美國Sigma-Aldrich公司；丹諾沙星（danofloxacin，DAN）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、依諾沙星（enoxacin，ENO）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、雙氟沙星（difloxacin，DIF）、磺胺醋酰（sulfacetamide，SAA）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathiazole，STZ）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SP）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SM）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SMZ）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，SMT）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶（sulfameter，SME）、磺胺氯噠嗪（sulfachloropyrida，SCP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadoxine，SDO）、磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole，SMX）、磺胺二甲基異噁唑（sulfisoxazole，SIX）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99%）：德國Dr Ehrenstorfer公司；十八烷基硅烷（n-octadecylsilane，C18）、N-丙基乙二胺 （primary-secondary amine，PSA）、氨基（amino，NH2）凈化劑：天津博納艾杰爾公司；乙腈（acetonitrile，ACN）、甲醇（均為色譜純）：美國天地有限公司；甲酸、MgSO4、Na2SO4、NaCl、Na2HPO4、檸檬酸、EDTA-2Na·2H2O（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；試驗(yàn)所用原料乳購自于陜西西安、咸陽和寶雞等地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)。pH4.0的乙二胺四乙酸-Mcllvaine（ethylene diamine tetraacetic acid-Mcllvaine，EDTA-Mcllvaine）0.1 mol/L緩沖液通過以下方法制備：準(zhǔn)確稱取10.9 g Na2HPO4、37.2 g EDTA二鈉鹽和12.9 g一水檸檬酸用超水溶解，定容至1.0 L。

1.3 色譜和質(zhì)譜分析條件

LC-2010A高效液相色譜儀配備Shim-pack XRODS（I.D.3.0 mm × 75 mm，2.2 μm）色譜柱；流動(dòng)相 A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。AB 4000 Q-Trap串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備ESI多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）正離子掃描模式，離子源溫度：550℃；電噴霧電壓：5 000 V；氣簾氣電壓：69 kPa；噴霧氣壓力：345 kPa；輔助氣壓力：345 kPa條件下，依次進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定母離子、定量子離子和定性子離子，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)質(zhì)譜參數(shù)，如去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞電壓（collision energy，CE）等進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取所有標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg（精確至0.01 mg），置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，即為濃度1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃避光儲(chǔ)存3個(gè)月。吸取1mL上述溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，配制為濃度10 μg/mL的中間工作液（5℃避光儲(chǔ)存2周）。吸取上述溶液10 mL加入到100 mL容量瓶中，用乙腈溶液稀釋至刻度，即為30種獸藥濃度均為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（保質(zhì)期為1周）。

1.5 原料乳的前處理方法

準(zhǔn)確稱取10 g原料乳（精確到0.01g）置于50 mL具塞離心管中，加入8 mL乙腈、2 mL 0.1 mol/L EDTAMcllvaine和0.1 mL乙酸，渦旋振蕩2 min，樣品和溶劑完全混合后，加入2 g NaCl和2 g Na2SO4繼續(xù)渦旋振蕩1 min，以10 000 r/min離心5 min，取4 mL上層乙腈相，加入100 mg C18和100 mg PSA凈化劑，渦旋振蕩1 min，50℃水浴氮?dú)獯蹈珊?，殘?jiān)?.0mL10%水乙腈溶液復(fù)溶，溶液過0.22 μm有機(jī)濾膜至進(jìn)樣瓶中，供HPLC-MS/MS分析。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）用加標(biāo)量為 10 μg/kg的空白樣品峰面積（Am）和溶劑標(biāo)峰面積（Ai）計(jì)算，重復(fù)3次，計(jì)算公式如下。

以空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液，配制濃度分別為0.5 μg/kg～100.0 μg/kg的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各組分濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 方法回收率及檢出限和定量限測(cè)定

稱取待測(cè)樣品10 g，加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成30種獸藥加標(biāo)量分別為5.0、10.0、20.0 μg/kg 3個(gè)濃度的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定3份樣品，計(jì)算批內(nèi)和批間回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分別通過加標(biāo)樣品（10 μg/kg）3倍和10倍信噪比計(jì)算。

1.8 數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)分析采用AB 4000 Q-Trap Analyst軟件進(jìn)行處理，回收率和精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Office Excel軟件處理，統(tǒng)計(jì)圖采用Origin Pro 8.5制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

30種目標(biāo)獸藥經(jīng)質(zhì)譜優(yōu)化得到的最佳參數(shù)見表1。

表1 30種獸藥的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Table 1 MRM parameters for the 30 veterinary drugs

2.2 色譜條件的優(yōu)化

30種獸藥經(jīng)液相色譜條件優(yōu)化得到的總離子流圖見圖1。

圖1 原料乳中30種獸藥的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the 30 veterinary drugs in raw milk

由圖1可知，以乙腈為有機(jī)相時(shí)，目標(biāo)物離子化效率和靈敏度高，峰行對(duì)稱且較窄、分離效果普遍較好。采用甲醇為有機(jī)相時(shí)，色譜峰形不對(duì)稱，出現(xiàn)拖尾。當(dāng)水相中不添加甲酸時(shí)，喹諾酮類獸藥存在拖尾現(xiàn)象。添加0.1%甲酸后，峰形得到明顯改善。這是因?yàn)猷Z酮類獸藥極性較大，且該類化合物中含有羧酸和哌嗪基，屬于酸堿兩性化合物，色譜峰容易拖尾，而以酸性溶液作為流動(dòng)相可改善拖尾現(xiàn)象。對(duì)色譜梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，反復(fù)試驗(yàn)后確定為0～7.0 min，90%A～60%A；7.0 min～20.0 min，10%A ；20.0 min～20.1 min，10%A～90%A，保持到 34.0 min。

2.3 提取條件優(yōu)化

在QuEChERS前處理方法中，乙腈是提取獸藥殘留常用試劑，具有良好的蛋白沉淀作用?？紤]到喹諾酮類（羧基和氨基）獸藥為兩性物質(zhì)，酸性環(huán)境離子化程度高[14]，并且磺胺類獸藥在酸化乙腈中具有較好的溶解性[15-16]，因此本研究以1.0%乙酸乙腈為提取劑，考察不同體積比（9∶1、8∶2、7∶3）乙酸乙腈與 EDTA-Mcllvaine緩沖液對(duì)30種獸藥提取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取液比例對(duì)30種獸藥回收率的影響Fig.2 Effect of extracting solutions rate on recoveries of the 30 veterinary drugs

由圖2可知，當(dāng)乙酸乙腈和EDTA-Mcllvaine緩沖液體積比為8∶2時(shí)，目標(biāo)獸藥的提取效率最高，獸藥回收率均在70.6%～96.3%之間。不同體積比（9∶1、8 ∶2、7∶3）乙酸乙腈和 EDTA-Mcllvaine緩沖液對(duì)喹諾酮類獸藥影響較大，當(dāng)提取液中EDTA-Mcllvaine緩沖液含量較低時(shí)，原料乳中存在鈣、鎂等礦物元素，會(huì)與喹諾酮類化合物發(fā)生一定的螯合反應(yīng)，導(dǎo)致回收率降低。加入體積比為8∶2的乙酸乙腈和EDTAMcllvaine緩沖液可絡(luò)合乳中的鈣鎂離子，使喹諾酮保持溶解狀態(tài)，從而提高提取率[17]。

2.4 鹽析劑和脫水劑條件優(yōu)化

NaCl、Na2SO4、MgSO4是 QuEChERS 方法中常用的鹽析劑和脫水劑[11，18]，試驗(yàn)分別對(duì)比了NaCl和 Na2SO4、NaCl和MgSO4對(duì)各類獸藥回收率的影響。當(dāng)選用NaCl和MgSO4作為鹽析劑時(shí)，喹諾酮類和磺胺類獸藥的回收率有不同程度降低，最高降低幅度達(dá)到30%。這是因?yàn)猷Z酮類獸藥易與Mg2+形成螯合物導(dǎo)致溶解度降低。當(dāng)選用NaCl和MgSO4時(shí)，回收率明顯提高，因此本試驗(yàn)選用NaCl作為鹽析劑、Na2SO4作為脫水劑。

2.5 凈化劑條件優(yōu)化

液態(tài)乳基質(zhì)中存在脂肪、蛋白、乳糖、維生素和礦物質(zhì)等雜質(zhì)，因此凈化劑的選擇既要能有效除去乳中雜質(zhì)，又不會(huì)吸附目標(biāo)物。試驗(yàn)比較了不同含量（50、100、200 mg）C18、PSA和NH23種凈化劑的凈化效果，結(jié)果分別見圖3。

圖3 C18、NH2和PSA凈化劑對(duì)30種獸藥回收率的影響Fig.3 Influence of C18，NH2and PSA sorbents on the recovery of the 30 veterinary

由圖3可知，使用NH2為凈化劑時(shí)，喹諾酮和磺胺類獸藥回收率為30%～60%，說明該凈化劑對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生了吸附作用。PSA具有良好的吸附糖類、脂肪酸和其他極性有機(jī)酸作用[19]，當(dāng)使用100 mg PSA作為凈化劑時(shí)，除了 TUL（49.6%）、SD（45.2%）、SP（46.5%）、SDO（45.4%），其他獸藥的回收率為50.8%～89.7%。C18主要吸附非極性物質(zhì)[20]，凈化乳脂肪效果較好，但C18凈化劑用量為100 mg時(shí)，β-激動(dòng)劑類獸藥的回收率低于70%?？紤]到兩種凈化劑在凈化效果方面的互補(bǔ)性，試驗(yàn)進(jìn)一步考察C18和PSA兩種凈化劑組合使用對(duì)獸藥回收率的影響，當(dāng)C18和PSA用量為100 mg時(shí)，獸藥回收率可達(dá)到70%以上，隨著PSA和C18用量的增加，回收率降低。綜合考慮凈化效果和方法回收率，最終確定100 mg C18和100 mg PSA作為混合凈化吸附劑。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

在最佳凈化條件下，對(duì)30種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effect

由圖4可知，12種目標(biāo)物顯示了基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME為65.4%～99.0%，其中SAR（65.0%）、PEF（69.7%）、RAC（65.4%）和SDO（67.9%）存在明顯的抑制效應(yīng)。其他18種目標(biāo)物ME為100%～160%，其中FEN（140.2%）和SAA（130.3%）存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)是由樣品基質(zhì)中的共體干擾物與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)電離所致，導(dǎo)致目標(biāo)成分在離子化時(shí)受到樣品基質(zhì)中某些成分的影響而引起分析信號(hào)改變，與目標(biāo)物濃度、提取方法以及離子化程度關(guān)，且基質(zhì)效應(yīng)的變化有不確定因素[13]。為使定量分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液作為校準(zhǔn)曲線以降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。

2.7 方法有效性

方法有效性依據(jù)歐盟規(guī)定2002/657/EC對(duì)線性回歸、回收率、重復(fù)性（批內(nèi)精密度）和再現(xiàn)性（批間精密度）、LOD和LOQ進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。

表2 30種獸藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）、回收率、檢出限、定量限、批內(nèi)和批間精密度Table 2 Linear range，linear equations，correlation coefficient（r），recovery，LOD，LOQ ，intra-precision and inter-precision of 30 veterinary drugs

由表 2 可知，30 種化合物在 0.5 μg/kg～100.0 μg/kg的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于 0.99。目標(biāo)化合物的檢出限為 0.10 μg/kg～1.21 μg/kg，定量限為 0.40 μg/kg～4.05 μg/kg，這個(gè)結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法和其他研究相比相近似或更低[21-22]。試驗(yàn)選擇陰性樣品添加3個(gè)濃度水平（5.0、10.0、20.0 μg/kg）混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度加標(biāo)水平做6個(gè)平行樣，考察方法回收率和精密度。30種目標(biāo)化合物的回收率為71.1%～94.8%，RSD低于12.2%。

2.8 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)陜西西安、咸陽和寶雞地區(qū)農(nóng)戶的50份原料乳樣本進(jìn)行了測(cè)定，所測(cè)原料乳中發(fā)現(xiàn)一個(gè)樣品中氧氟沙星含量為3.5 μg/kg，另一個(gè)樣品中恩諾沙星含量為 2.47 μg/kg。

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS前處理結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)，通過優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件、提取條件和凈化條件，建立了快速測(cè)定原料乳中30種獸藥殘留的分析方法。與傳統(tǒng)獸藥提取前處理方法相比，本方法具有前處理簡(jiǎn)單快捷、有機(jī)溶劑用量少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，且該方法成功用于實(shí)際樣品的測(cè)定，可作為原料乳中獸藥的定性定量檢測(cè)手段，對(duì)原料乳中獸藥殘留情況的監(jiān)測(cè)具有重要的用應(yīng)用價(jià)值。