Box-Behnken模型優(yōu)化油茶餅粕多酚提取工藝及抗氧化活性研究

孫曉波，韋桂鳳，王小明，張鵬，覃逸明，郭松

（廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 來賓 546199）

油茶，山茶科茶屬植物，在我國已有2 000多年的種植歷史，與油棕、油橄欖、椰子并稱為世界四大木本食用油料作物[1-2]。我國油茶種植面積已達(dá)460萬hm2，主要分布于長江以南省區(qū)[3]。油茶果由油茶籽、油茶果皮、油茶籽殼3個(gè)部分組成，以油茶籽為原料榨出的茶籽油中含有高達(dá)90%的不飽和脂肪酸，同時(shí)還含有多糖、茶皂苷、角鯊烯等多種功能性成分，長期食用有利于身體健康[4-5]。油茶籽經(jīng)榨油后得到的主要副產(chǎn)物為油茶餅粕，如果將每年收獲的油茶籽全部用來榨油，可產(chǎn)生近200萬噸油茶餅粕。油茶餅粕中茶皂素、茶籽蛋白、黃酮和多酚類物質(zhì)含量豐富，對大腸桿菌、稻瘟病菌、炭疽病菌、柑橘青霉病菌有較好抑制效果[6]。油茶餅粕多糖具有抗血栓、降血糖、降血壓、降血脂等功效[7-8]。油茶餅粕正丁醇萃取相中的抑菌物質(zhì)為黃酮苷類化合物，具有抑制黃曲霉素的效果[9]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)油茶餅粕皂苷在體外對人腫瘤細(xì)胞有抗增殖活性，并以肝癌H22荷瘤小鼠為實(shí)驗(yàn)對象驗(yàn)證了油茶餅粕中總皂苷的抗癌活性。目前，因生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)成本限制，油茶餅粕除極少數(shù)用于提取茶皂素外，其余大部分都被當(dāng)做清塘劑或肥料使用，造成資源的極大浪費(fèi)。

微波輔助提取法具有耗時(shí)短、浸提液受熱均勻、節(jié)省溶劑、操作簡便等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于多糖、黃酮、色素等有效成分的提取，但未見其應(yīng)用于油茶餅粕中多酚提取的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究采用微波輔助提取油茶餅粕中多酚，經(jīng)單因素試驗(yàn)和Box–Behnken模型優(yōu)化油茶餅粕中多酚的最優(yōu)提取工藝，并驗(yàn)證其抗氧化活性，旨在為油茶餅粕資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶餅粕：市售；L-抗壞血酸（VC）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、沒食子酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、30%過氧化氫、鹽酸、石油醚（均為分析純）：四川西隴科學(xué)股份有限公司；DPPH（純度>98%）：凱瑪生化有限公司；福林酚（生物試劑）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-GF101-3BS）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；多功能粉碎機(jī)（FW-135）：天津市泰斯特儀器有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-9600）：北京瑞利分析儀器有限公司；祥鵠微波合成儀（XH-MC-1）：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；循環(huán)水多用真空泵（SHZ-D（Ш）：鞏義市科瑞儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-1001VN）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（H-1850）：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶餅粕預(yù)處理

油茶餅粕除去雜質(zhì)，45℃恒溫干燥至恒重，粉碎機(jī)粉碎后過80目篩；然后將油茶餅粕粉末用石油醚回流脫脂，過濾得到脫脂油茶餅粕，再次45℃恒溫干燥至恒重，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過80目篩后密封袋儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用福林-酚測定法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。準(zhǔn)確移取 0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8、5.6、6.4 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL）分別置于10 mL比色管中，蒸餾水稀釋定容得到不同濃度沒食子酸溶液。分別移取1.0mL上述不同濃度沒食子酸溶液于10 mL比色管中，依次加入5.0 mL蒸餾水、1.0 mL福林酚顯色劑，充分振蕩后靜置6 min，然后加入3.0 mL 7%碳酸鈉溶液，搖勻，室溫25℃下避光反應(yīng)2 h，于765 nm波長處測定其吸光度。以沒食子酸溶液質(zhì)量濃度X（mg/L）為橫坐標(biāo)，以吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y＝95.938X+0.000 7，R2＝0.999 3。表明在 0.000 8 mg/mL～0.006 4 mg/mL溶度范圍內(nèi)，沒食子酸溶液與其吸光度線性關(guān)系良好，適用于油茶餅粕多酚提取量的測定。

1.3.3 油茶餅粕多酚的提取及測定

準(zhǔn)確稱取經(jīng)1.3.1方法處理后的油茶餅粕粉末1.0 g，在不同微波功率、微波時(shí)間、微波溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比條件下微波輔助提取后，減壓抽濾并定容至100 mL容量瓶作為油茶餅粕多酚提取液。準(zhǔn)確移取1.25 mL多酚提取液稀釋定容至10 mL比色管作為待測液備用。準(zhǔn)確移取1.0 mL上述待測液于10 mL比色管，按1.3.2方法顯色后，765 nm處測定其吸光度，平行測定3次。多酚提取量計(jì)算公式如下。

式中：c為稀釋后油茶餅粕多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；m為油茶餅粕粉末質(zhì)量，g；N為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

分別考察微波功率、微波時(shí)間、微波溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比5個(gè)因素對油茶餅粕多酚提取量的影響。微波功率選擇 300、400、500、600、700 W；微波時(shí)間選擇 1、3、5、7、9min；微波溫度選擇 30、40、50、60、70 ℃；乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇40%、50%、60%、70%、80%；液料比選擇 40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1、80 ∶1（mL/g）。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合單因素方差分析，篩選出4個(gè)對多酚提取量影響較大的因素，分別為微波功率（A）、微波時(shí)間（B）、微波溫度（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）。以上述4個(gè)因素為自變量，以油茶餅粕多酚提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，對多酚提取條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。響應(yīng)面因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 油茶餅粕多酚抗氧化活性評價(jià)

參考黎克純等[12]、裴斐等[13]、宋佳敏等[14]的方法并稍加以修改，對油茶餅粕多酚體外抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)，具體評價(jià)方法如下。

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的測定

準(zhǔn)確移取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的油茶餅粕多酚提取液于10 mL離心管中，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL，搖勻并均勻反應(yīng)30 min后，于517 nm波長處測定其吸光度A1；固定上述試驗(yàn)條件，用等體積無水乙醇替代DPPH溶液，測定油茶餅粕多酚提取液本底吸光度A2；用等體積無水乙醇替代油茶餅粕多酚提取液，測定其空白吸光度A0，以L-抗壞血酸（VC）溶液作為對照試驗(yàn)，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.6.2 超氧陰離子自由基清除率的測定

取8支潔凈的10 mL離心管，分別加入4.5 mL 50 mmol/L（pH8.2）Tris-HCl緩沖溶液，25℃恒溫水浴20 min后立即加入1.0 mL已預(yù)熱至25℃不同質(zhì)量濃度的油茶餅粕多酚提取液和0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻后再次將離心管置于25℃恒溫水浴4 min，取出并立即加入8 mmol/L HCl溶液1.0 mL終止反應(yīng)，于325 nm波長處測定其吸光度Aβ。固定上述試驗(yàn)條件，用等體積蒸餾水替代油茶餅粕多酚提取液，測定其空白吸光度Aα，以VC溶液作為對照試驗(yàn)，超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.3.6.3 羥基自由基清除率的測定

準(zhǔn)確移取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的油茶餅粕多酚提取液于10 mL離心管中，依次加入10 mmol/L硫酸亞鐵溶液、10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L過氧化氫溶液各2.0 mL，37℃水浴反應(yīng)30 min后，于510 nm波長處測定其吸光度As；用等體積蒸餾水替換上述試驗(yàn)中過氧化氫溶液，測定油茶餅粕多酚提取液本底吸光度Ac，用等體積蒸餾水替代油茶餅粕多酚提取液，測定其空白吸光度Ab。以VC溶液作為對照試驗(yàn)，羥基自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)測定3次；采用Excel 2010和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及顯著性差異分析，采用Origin 2018繪圖，采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率對油茶餅粕多酚提取量的影響

微波功率對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖1。

圖1 微波功率對多酚提取量的影響Fig.1 Effects of microwave power on polyphenols extraction amount

由圖1可知，當(dāng)微波功率為300 W～600 W時(shí)，油茶餅粕多酚提取量隨著微波功率的增大而顯著增加（P<0.05）。這可能是由于增大微波功率會(huì)加速植物細(xì)胞中極性分子的振動(dòng)，導(dǎo)致多酚類化合物溶出增多，提取量增加[15]；微波功率為600 W時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大，最大值為39.16 mg/g；當(dāng)微波功率超過600 W后，油茶餅粕多酚提取量開始顯著降低（P<0.05），原因可能是微波功率過大會(huì)破壞多酚類化合物的分子結(jié)構(gòu)，因而提取量降低。故選擇600 W作為最佳微波功率。

2.1.2 微波時(shí)間對油茶餅粕多酚提取量的影響

微波時(shí)間對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖2。

圖2 微波時(shí)間對多酚提取量的影響Fig.2 Effects of microwave time on polyphenols extraction amount

由圖2可知，當(dāng)微波時(shí)間為5 min時(shí)，油茶餅粕多酚的提取量達(dá)到最大，最大值為40.38 mg/g；與其他微波時(shí)間條件下的多酚提取量差異顯著（P<0.05）。原因可能是隨著微波時(shí)間的不斷延長，油茶餅粕中多酚類化合物溶出更完全。微波時(shí)間為5 min時(shí)，多酚類化合物已基本溶出，而過長的微波時(shí)間不僅耗能增加，且會(huì)引起其他醇溶性雜質(zhì)溶出增多，導(dǎo)致多酚提取量下降[16]。故選擇5 min作為最優(yōu)微波時(shí)間。

2.1.3 微波溫度對油茶餅粕多酚提取量的影響

微波溫度對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖3。

圖3 微波溫度對多酚提取量的影響Fig.3 Effects of microwave temperature on polyphenols extraction amount

由圖3可知，當(dāng)微波溫度為30℃～60℃時(shí)，油茶餅粕多酚提取量隨著微波溫度的升高而顯著增加（P<0.05），可能原因?yàn)轶w系溫度升高導(dǎo)致分子間傳質(zhì)動(dòng)力增大，多酚的溶解度增大。微波溫度為60℃時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大，最大值為40.12 mg/g；當(dāng)微波溫度超過60℃后，油茶餅粕多酚提取量開始顯著降低（P<0.05）。這可能是因?yàn)闇囟瘸^60℃后，油茶餅粕中某些多酚類化合物開始分解，提取量下降[17]。故選擇60℃作為最優(yōu)微波溫度。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對油茶餅粕多酚提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on polyphenols extraction amount

由圖4可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，油茶餅粕多酚的提取量達(dá)到最大，最大值為42.00mg/g，與其他乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下的多酚提取量差異顯著（P<0.05）。原因主要是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于50%時(shí)，溶劑極性較大，油茶餅粕多酚不能完全溶解；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚溶出增多；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過50%后，溶劑極性降低導(dǎo)致油茶餅粕中一些其他醇溶性雜質(zhì)溶出增多，與多酚形成競爭關(guān)系，降低了多酚的溶出效果[18]。故選擇50%乙醇作為最優(yōu)提取溶劑。

2.1.5 液料比對油茶餅粕多酚提取量的影響

液料比對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖5。

圖5 液料比對多酚提取量的影響Fig.5 Effects of liquid-material ratio on polyphenols extraction amount

由圖5可知，當(dāng)液料比為 40∶1（mL/g）～70∶1（mL/g）時(shí)，油茶餅粕多酚提取量隨著液料比的增大也顯著增加（P<0.05），原因主要是隨著液料比的不斷增大，油茶餅粕粉末與乙醇溶液接觸更加充分，多酚類化合物溶出增多，提取量增加；液料比為70∶1（mL/g），多酚提取量達(dá)到最大，最大值為42.19 mg/g；當(dāng)液料比超過70∶1（mL/g）后，油茶餅粕多酚提取量開始顯著降低（P<0.05），這主要是由于液料比過大時(shí)，一些其它醇溶性物質(zhì)溶解性也增大，從而抑制了油茶餅粕多酚的溶出，且液料比過大會(huì)導(dǎo)致溶劑的浪費(fèi)[19-20]。綜合考慮，選擇70∶1（mL/g）作為最優(yōu)液料比。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

以油茶餅粕多酚提取量為響應(yīng)值，按照Box-Behnken設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Design and results of response surface methodology

通過Design expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸分析，得到油茶餅粕多酚提取量與各因素的二次多元回歸方程為Y=42.05+0.80A+1.08B+0.73C-1.09D-0.75AB+0.14AC+1.02AD+0.71BC-0.37BD-0.12CD-2.16A2-2.58B2-1.58C2-2.97D2，方差分析及顯著性檢驗(yàn)見表3。

表3 方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis and significance test

由表3可知，模型F值為29.17，P值<0.000 1，說明模型極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.226 4，不顯著（P>0.05）；相關(guān)系數(shù)R2=0.966 9，說明該模型能夠很好的預(yù)測出多酚提取量。A（微波功率）、B（微波時(shí)間）、C（微波溫度）、D（乙醇體積分?jǐn)?shù)）4個(gè)因素對油茶餅粕多酚提取量均有極顯著影響（P<0.01）；交互項(xiàng)AD有極顯著影響（P<0.01），AB、BC 有顯著影響（P<0.05），AC、BD、CD 間無顯著性影響；二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。從表3中F值大小可知，各因素影響重要性依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波時(shí)間＞微波功率＞微波溫度。

2.2.2 各因素交互作用分析

各因素間響應(yīng)面和等高線圖見圖6。

圖6 各因素交互作用對油茶餅粕多酚提取量的影響Fig.6 Effects of interactions factors on polyphenols extraction amount from Camellia seed cake

由圖6可知，各因素對油茶餅粕多酚提取量的影響反映在響應(yīng)面曲面的陡峭程度上，響應(yīng)面曲面弧度變化越陡峭，說明該因素對提取量的影響越敏感；反之則不敏感[21]。乙醇體積分?jǐn)?shù)曲面較其他因素曲面陡峭，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對油茶餅粕多酚提取量影響較為明顯。在有交互作用的影響下，微波功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互影響作用極顯著，微波功率和微波時(shí)間、微波時(shí)間和微波溫度交互影響作用顯著，微波功率和微波溫度、微波時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互影響作用不顯著，這與表3分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面模型預(yù)測出油茶餅粕多酚最佳提取工藝條件為微波功率610.61 W、微波時(shí)間5.50 min、微波溫度63℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)48.13%、液料比70∶1（mL/g），此條件下油茶餅粕多酚理論提取量為42.44 mg/g。考慮到試驗(yàn)操作的可實(shí)施性，將工藝條件調(diào)整為微波功率600 W、微波時(shí)間5.5 min、微波溫度63℃、乙醇體積分?jǐn)?shù) 48%、液料比 70∶1（mL/g），此條件下，油茶餅粕多酚的實(shí)際提取量為42.29 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.42%，與理論提取量相近，說明模型有效。

2.3 油茶餅粕多酚抗氧化活性評價(jià)

2.3.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定見圖7。

圖7 油茶餅粕多酚提取液對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effects of polyphenols from Camellia seed cake on the scavenging rate of DPPH radicals

由圖7可知，油茶餅粕多酚、VC對DPPH自由基的清除率均隨著濃度的增大而增大，當(dāng)溶度為0.07 mg/mL時(shí)，油茶餅粕多酚對DPPH自由基的清除率達(dá)到83.76%，相同濃度下VC清除率為89.86%。油茶餅粕多酚濃度在0.06 mg/mL～0.07 mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH自由基清除率不存在顯著差異（P>0.05），說明繼續(xù)增大多酚濃度，清除率升高不再顯著。經(jīng)擬合得出油茶餅粕多酚對DPPH自由基的半抑制濃度（IC50）為0.029 mg/mL，VC的IC50為0.024 mg/mL，說明油茶餅粕多酚對DPPH自由基的清除能力與VC相近。

2.3.2 超氧陰離子自由基清除率的測定

超氧陰離子自由基清除率的測定見圖8。

圖8 油茶餅粕多酚提取液對超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.8 Effects of polyphenols from Camellia seed cake on the scavenging rate of superoxide anion radicals

由圖8可知，在低濃度范圍內(nèi)，油茶餅粕多酚對超氧陰離子自由基的清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于VC，隨著濃度的增大，油茶餅粕多酚、VC對超氧陰離子自由基的清除率也不斷增大且兩者差值逐步縮??；當(dāng)溶度為0.8 mg/mL時(shí)，油茶餅粕多酚、VC對超氧陰離子自由基的清除率分別為83.38%、82.02%。油茶餅粕多酚濃度為0.7 mg/mL～0.8 mg/mL時(shí)，對超氧陰離子自由基清除率不存在顯著差異（P>0.05），說明繼續(xù)增大多酚濃度，清除率升高不再顯著。經(jīng)擬合得出油茶餅粕多酚對超氧陰離子自由基的IC50為0.23 mg/mL，VC的IC50為0.48 mg/mL，說明油茶餅粕多酚對超氧陰離子自由基的清除能力較VC強(qiáng)。

2.3.3 羥基自由基清除率的測定

羥基自由基清除率的測定見圖9。

圖9 油茶餅粕多酚提取液對羥基自由基清除率的影響Fig.9 Effects of polyphenols from Camellia seed cake on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖9可知，隨著油茶餅粕多酚、VC濃度的不斷增大，其對羥基自由基的清除率也不斷增大，但油茶餅粕多酚對羥基自由基的清除率增勢較VC平緩。油茶餅粕多酚溶度為0.8 mg/mL時(shí)，對羥基自由基的清除率達(dá)到34.96%，而相同濃度下VC的清除率高達(dá)99.74%，說明油茶餅粕多酚清除羥基自由基的能力較VC弱。

3 結(jié)論

本研究基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過Box-Behnken模型優(yōu)化油茶餅粕多酚的微波輔助提取工藝，確定微波功率600 W、微波時(shí)間5.5 min、微波溫度63℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)48%、液料比70∶1（mL/g）為最優(yōu)提取工藝條件，此條件下，油茶餅粕多酚的實(shí)際提取量為42.29 mg/g，與預(yù)測值擬合效果好。在試驗(yàn)所選濃度范圍內(nèi)，油茶餅粕多酚對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的最高清除率分別為83.76%、83.38%、34.96%，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。本研究為油茶餅粕多酚的生產(chǎn)以及油茶餅粕抗氧化活性成分應(yīng)用于功能性食品開發(fā)提供理論依據(jù)。