響應(yīng)面優(yōu)化長白山紫蘇籽油制備及其抗炎活性研究

呂萍

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

紫蘇為一年生唇形科草本植物，是一種藥食兩用植物。紫蘇對(duì)于環(huán)境的要求不高，野生紫蘇遍布全國各地[1]。我國東北長白山地區(qū)盛產(chǎn)紫蘇，紫蘇籽含油量為40%～50%，不飽和脂肪酸含量達(dá)90%以上，其中α-亞麻酸含量最高為50%～70%。紫蘇籽油是優(yōu)良的營養(yǎng)食用油，含有豐富的維生素E、8種人體必需氨基酸和多種微量元素[2-3]。紫蘇籽油具有調(diào)節(jié)免疫力、抗炎、降低血脂血壓、降膽固醇、抗過敏、預(yù)防腦血栓和心肌梗塞、抗癌、延緩衰老等功效，對(duì)視覺功能和學(xué)習(xí)的行為活動(dòng)有促進(jìn)作用[4-9]。

目前紫蘇籽油的提取方法主要有水酶法、機(jī)械壓榨法、溶劑浸提法[10]及CO2超臨界萃取法等[11-12]，水酶法與以上方法相比，具有耗能少、時(shí)間短以及毛油品質(zhì)高，并且提取方法易操作、處理?xiàng)l件溫和、不會(huì)破壞油脂營養(yǎng)物質(zhì)，有利于提高油料作物資源綜合利用率[13]。當(dāng)前國內(nèi)外對(duì)紫蘇籽油抗炎活性研究較少，故本文采用水酶法提取紫蘇籽油，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)選，借助響應(yīng)面優(yōu)化分析[14]得到最佳工藝，獲得紫蘇籽油較高的提取率，并研究其對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性及耳腫脹等抗炎活性，為紫蘇籽油在食品、醫(yī)藥等方面的綜合利用提供理論參考及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山地區(qū)紫蘇籽：市售。經(jīng)烘干粉碎后備用；堿性蛋白酶（25 000 U/g）：美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸、NaCl、醋酸、二甲苯（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；伊文思藍(lán)：上海振譽(yù)生物科技有限公司；阿司匹林：蘇州甫路生物科技有限公司；醋酸地塞米松：廣東南國藥業(yè)有限公司。

昆明鼠小鼠（SPF 級(jí)，18 g～20 g）：遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)SCXK（遼）2015-0001，動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房環(huán)境適應(yīng)一周。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BEM220.4）：上海卓精電子科技有限公司；多功能粉碎機(jī)（XS-10）：上海兆申科技有限公司；離心機(jī)（H2050R-1）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（752N）：上海儀器分析廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9223A型）：成都瑞派斯科技有限公司；恒溫水浴搖床（SY-2230）：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；集熱式磁力攪拌器（DF-101D）：河南自玉鋮科技有限公司；脂肪測(cè)定儀（YSXT-02）：上海熙揚(yáng)儀器有限公司；pH計(jì)（PHS-25型）：上海平軒科技儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇籽油的提取

采用水酶法提取紫蘇籽油。將100℃烘烤后的紫蘇籽粉碎過150目篩，即得紫蘇籽粉。準(zhǔn)確稱重50 g紫蘇籽粉后加水調(diào)節(jié)適宜料液比，待溫度上升至所需溫度時(shí)，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值，加入一定比例的堿性蛋白酶，酶解結(jié)束后100℃水浴滅酶15 min，然后冷卻至室溫20℃，6 000 r/min離心15 min，離心結(jié)束取上層清油，提取率計(jì)算公式如下[15]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 料液比的選擇

在堿性蛋白酶加酶量3%、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間5 h、pH 9.5條件下，考察料液比[（1∶4、1∶6、1∶8、1 ∶10、1 ∶12（g/mL）]對(duì)紫蘇籽油提取率的影響。

1.3.2.2 堿性蛋白酶加酶量的選擇

在酶解溫度 55℃、pH 9.5、料液比 1∶6（g/mL）、酶解時(shí)間5 h條件下，考察堿性蛋白酶加酶量（1%、2%、3%、4%、5%）對(duì)紫蘇籽油提取率的影響。

1.3.2.3 酶解pH值的選擇

在堿性蛋白酶加酶量3%、酶解溫度55℃、料液比1∶6（g/mL）、酶解時(shí)間 5 h 條件下，考察 pH 值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）對(duì)紫蘇籽油提取率的影響。

1.3.2.4 酶解溫度的選擇

在堿性蛋白酶加酶量 3%、料液比 1∶6（g/mL）、酶解時(shí)間 5 h、pH 9.5 條件下，考察酶解溫度（40、45、50、55、60℃）對(duì)紫蘇籽油提取率的影響。

1.3.2.5 酶解時(shí)間的選擇

在堿性蛋白酶加酶量 3%、料液比 1∶6（g/mL）、酶解溫度50℃、酶解pH 9.5條件下，考察酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對(duì)紫蘇籽油提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)長白山紫蘇籽油提取影響較大的4個(gè)因素料液比（A）、加酶量（B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析，對(duì)紫蘇油工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[16-17]。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Response surface test factors

1.3.4 紫蘇籽油抗炎活性研究

1.3.4.1 紫蘇籽油對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性的影響

取50只KM小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，分別為空白組，每天灌胃0.1 g/mL 0.9%NaCl。陽性對(duì)照組：每天灌胃0.001 g/mL阿司匹林，灌胃體積為0.01 mL/g；低、中、高劑量組：每天分別灌胃 100、150 、200 μL/kg紫蘇籽油；連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃1 h后，小鼠尾靜脈注射1%伊文思藍(lán)0.01 mL/g體重，同時(shí)腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只，使小鼠自由活動(dòng)0.5 h后處死，用5 mL 0.9%NaCl沖洗腹腔，收集沖洗液，2 500 r/min離心10 min，取上清液在590 nm測(cè)吸光度，以吸光度（OD）值判斷小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性[18-21]。

1.3.4.2 紫蘇籽油對(duì)小鼠耳腫脹的影響

小鼠分組及灌胃方法同1.3.4.1，陽性對(duì)照物為醋酸地塞米松（20 mg/kg），末次灌胃1 h后，在小鼠左耳廓的上下兩面分別滴涂10 μL二甲苯，右耳廓作空白對(duì)照，0.5 h后將小鼠處死，用打孔器將小鼠左、右耳廓相同位置取下，稱重，以左右耳片質(zhì)量差作為腫脹度，腫脹抑制率計(jì)算公式如下[18-21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比的選擇

料液比對(duì)紫蘇籽油提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)長白山紫蘇籽油提取率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of Perilla seed oil from Changbai Mountain

由圖 1可知，料液比由 1∶4（g/mL）～1∶6（g/mL），提取率大幅度上升。隨著溶液體積繼續(xù)增加，提取率變化并不明顯。原因可能是溶液體積較小時(shí)溶液黏度相對(duì)較大，不利于油脂的分離；溶液體積過大，酶解濃度會(huì)降低，酶與底物相互接觸機(jī)會(huì)減少，進(jìn)而影響反應(yīng)速度[22]，因此選用料液比 1 ∶6（g/mL）～1 ∶10（g/mL）進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.1.2 堿性蛋白酶加酶量的選擇

堿性蛋白酶加酶量對(duì)紫蘇籽油提取率的影響見圖2。

圖2 加酶量對(duì)長白山紫蘇籽油提取率影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the extraction rate of Perilla seed oil from Changbai Mountain

由圖2可知，加酶量為1%～3%時(shí)，紫蘇籽油提取率呈上升趨勢(shì)；加酶量達(dá)到4%～5%時(shí)，提取率均低于加酶量3%時(shí)的提取率，可能是隨著加酶量的增加提升了反應(yīng)體系的速率，增加到一定量時(shí)底物與酶作用達(dá)到飽和，紫蘇籽油提取率達(dá)到最大后逐漸趨于穩(wěn)定，從成本效益等因素考慮[23]，因此選用加酶量為3%～5%進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.1.3 酶解pH值的選擇

酶解pH值對(duì)紫蘇籽油提取率的影響見圖3。

圖3 pH值對(duì)長白山紫蘇籽油提取率影響Fig.3 Effect of pH on the extraction rate of seed oil from Perilla seed oil from Changbai Mountain

由圖3可知，紫蘇籽油的提取率隨著pH值的增加而增加，pH值為8.5時(shí)，紫蘇籽油提取率達(dá)到71.67%。但繼續(xù)增加pH值，提取率變化趨于穩(wěn)定，這可能與堿性蛋白酶的最適pH值有關(guān)，pH值過高或過低都會(huì)影響酶活性，進(jìn)而影響紫蘇籽油的提取率。因此，選擇pH 9.0～10.0進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.1.4 酶解溫度的選擇

酶解溫度對(duì)紫蘇籽油提取率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)長白山紫蘇籽油提取率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction rate of Perilla seed oil from Changbai Mountain

由圖4可知，當(dāng)酶解溫度為40℃～50℃時(shí)，紫蘇籽油提取率持續(xù)升高，之后隨著酶解溫度的升高，紫蘇籽油提取率趨于穩(wěn)定。這可能與酶的最適溫度有關(guān)。隨著酶解溫度的升高，酶的活力逐漸增加，使得紫蘇籽油的提取率逐漸上升，達(dá)到最適酶解溫度后，繼續(xù)升高溫度對(duì)酶的活力可能產(chǎn)生影響，故提取率不再上升且趨于穩(wěn)定，所以選擇酶解溫度為45℃～55℃進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.1.5 酶解時(shí)間的選擇

酶解時(shí)間對(duì)紫蘇籽油提取率的影響見圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)長白山紫蘇籽油提取率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction rate of Perilla seed oil from Changbai Mountain

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間延長提取率呈上升趨勢(shì)，此時(shí)酶與底物充分接觸，促進(jìn)油脂溶出，使紫蘇籽油提取率逐漸提高，酶解時(shí)間4 h時(shí)提取率達(dá)到最高。原因可能是酶解時(shí)間繼續(xù)延長底物逐漸消耗，酶解效果降低，紫蘇籽油提取率不再提高并趨于穩(wěn)定，且時(shí)間過長增加油脂中不飽和脂肪酸氧化的可能，降低油脂品質(zhì)[24]。因此選擇酶解時(shí)間3 h～5 h進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。響應(yīng)面回歸模型方差分析表見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

續(xù)表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Continue table 3 Analysis of variance of response surface regression model

采用Design Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立逐步回歸模型，得到回歸方程為Y=72.05+1.47A-1.44B-2.76C+2.34AD-1.74BC+3.93CD-1.83A2+0.79B2-2.84D2，該回歸模型P＜0.000 1極顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05不顯著，且R2=0.925 0，調(diào)整R2=88.94%，說明該模型與試驗(yàn)擬合良好。該方程可以用于分析和預(yù)測(cè)酶解條件與提取率之間的關(guān)系。其中A、B、C、AD、CD、A2、D2的影響極顯著（P≤0.01）。由 F檢驗(yàn)可知，影響因素主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D，即酶解溫度＞料液比＞加酶量＞酶解時(shí)間。得出最佳優(yōu)化酶解條件為料液比1∶10（g/mL）、堿性蛋白酶加酶量 3.44%、酶解溫度45.43℃、酶解時(shí)間3.12 h。此條件下長白山紫蘇籽油提取率為76.51%。考慮到實(shí)際采用料液比1∶10（g/mL）、堿性蛋白酶加酶量3%、酶解溫度45℃，酶解時(shí)間3 h，為最佳提取條件，此條件下，提取率為76.49%。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)面交互作用分析見圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)長白山紫蘇籽油提取率的影響Fig.6 Effects of interaction of various factors on the extraction rate of Perilla seed oil from Changbai Mountain

由圖6可知，當(dāng)料液比一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長，紫蘇籽油提取率先增加，達(dá)到極大值后開始下降；當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí)，隨著提取溶液體積的增加，紫蘇籽油提取率先增加，達(dá)到極大值后開始下降，且料液比與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)紫蘇籽油的提取率有極顯著性影響；加酶量與酶解溫度均引起紫蘇籽油的提取率持續(xù)上升的趨勢(shì)，且加酶量與酶解溫度的交互作用對(duì)紫蘇籽油的提取率有顯著影響；當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長，紫蘇籽油提取率先增加，達(dá)到極大值后開始下降，當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí)，酶解溫度升高，紫蘇籽油的提取率呈下降趨勢(shì)，且酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)紫蘇籽油的提取率有極顯著影響，這與方差分析的結(jié)果一致。

2.3 紫蘇籽油的抗炎活性研究

2.3.1 紫蘇籽油對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性的影響

紫蘇籽油對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性的影響見表4。

表4 紫蘇籽油對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性增加的影響Table 4 Effect of Perilla seed oil on increased capillary permeability in mice

由表4可知，紫蘇籽油各劑量組與空白組相比，中低劑量組和高劑量組及陽性對(duì)照組分別對(duì)伊文思藍(lán)滲出量顯著（P≤0.05）或極顯著（P≤0.01）下降，提示紫蘇籽油能顯著抑制醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增加。紫蘇籽油各劑量組與阿司匹林陽性對(duì)照組相比，抑制作用均無顯著性差異（P＞0.05）。在此反應(yīng)中，醋酸作為致炎因素會(huì)引起毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加，紫蘇籽油能夠抑制醋酸引起的小鼠毛細(xì)血管通透性增加，分析可能是其中的α-亞麻酸等不飽和脂肪酸能夠改變血液中高密度脂蛋白和低密度脂蛋白比例，使血管暢通、更有彈性，進(jìn)而抑制了醋酸誘導(dǎo)毛細(xì)血管擴(kuò)張和通透性增加，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。

2.3.2 紫蘇籽油對(duì)小鼠耳腫脹的影響

紫蘇籽油對(duì)小鼠耳腫脹的影響見表5。

表5 紫蘇籽油對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響Table 5 Effect of Perilla seed oil on xylene-induced auricle swelling in mice

由表5可知，紫蘇籽油各劑量組對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹有顯著或極顯著的抑制作用。其中，紫蘇籽油中高劑量組與醋酸地塞米松陽性對(duì)照組的抑制作用無顯著性差異。紫蘇籽油之所以能夠起到抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹度作用，可能是紫蘇油中n-3不飽和脂肪酸（如α-亞麻酸等）起到消炎及減輕腫痛的作用，具體機(jī)制還有待深入研究。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化了水酶法提取長白山紫蘇籽油的工藝條件：料液比1∶10（g/mL）、堿性蛋白酶加酶量3%、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間3 h，此條件下，提取率為76.49%。影響因素主次順序?yàn)槊附鉁囟龋玖弦罕龋炯用噶浚久附鈺r(shí)間。通過對(duì)長白山紫蘇籽油的小鼠抗炎活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長白山紫蘇籽油達(dá)到一定劑量能顯著抑制醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性的增加，且紫蘇籽油在一定劑量下對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹有顯著或極顯著的抑制作用，表明長白山紫蘇籽油具有良好的抗炎活性，這可能是由于紫蘇籽油中高含量的α-亞麻酸起到了抗炎作用。本研究為長白山紫蘇籽油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)，今后有必要對(duì)長白山紫蘇籽油抗炎活性的具體成分，以及其抗炎活性機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此，認(rèn)為長白山紫蘇籽油具有一定的抗炎活性，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。