基于響應(yīng)面法優(yōu)化紫花地丁多酚與黃酮的提取工藝

顧生玖，姚志仁，顧超豪，李豫，唐輝，謝鵬，朱開梅*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541100；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541100；3.廣西科倫制藥有限公司，廣西 桂林 541100）

紫花地丁（Viola philippica），堇菜科堇菜屬草本植物，在我國(guó)分布廣泛，除青海、西藏外均有生長(zhǎng)[1-2]。春夏秋均可采收，資源豐富[3]。其功效有涼血、解毒、消腫等，具有長(zhǎng)久的民間用藥史，臨床價(jià)值較高[4-6]?，F(xiàn)代臨床用途主要有疔瘡腫毒、尿路感染、咽炎等[7]。

紫花地丁中含有多種成分，如黃酮類、糖類、苷類、氨基酸等[8-9]。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，其有良好的抑菌、抗炎、降脂等功效作用，在食品、醫(yī)藥行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景[10]。鑒于對(duì)紫花地丁總黃酮、多酚類研究報(bào)告較少，本試驗(yàn)采用一種更合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法——響應(yīng)面法，優(yōu)化超聲波輔助提取技術(shù)對(duì)紫花地丁多酚、黃酮技術(shù)，為深入開發(fā)紫花地丁提供科學(xué)依據(jù)[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫花地?。褐袊?guó)科學(xué)院廣西植物研究所提供，經(jīng)唐輝研究員鑒定為紫花地丁正品；氫氧化鈉、無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇、硝酸鋁（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；蘆丁、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：國(guó)家食品藥品檢定研究院；福林酚：美國(guó)Sigma公司。

FA2204B型精密電子天平：上海越平科學(xué)儀器制造有限公司；750A型多功能粉碎機(jī)：永康市紅太陽機(jī)電有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ReadMax 1900型全波長(zhǎng)Epoch酶標(biāo)儀：上海閃譜生物科技有限公司；N-1300D型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法

1.2.1.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)[12]方法并做修改，稱取適量干燥沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，純水稀釋，配制成0.02 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[13]，并參照國(guó)標(biāo)法操作，依次吸取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.25 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測(cè)定 760 nm 處吸光度。

1.2.1.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)[14-16]的方法，并做修改，稱取適量干燥槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，純水稀釋，制備為0.125 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取標(biāo)準(zhǔn)液 0、2、4、6、8、10mL 于 25mL 容量瓶中，加入0.7 mL含5%的亞硝酸鈉溶液，輕微搖勻，無明顯變色現(xiàn)象，靜置5min，加入0.7mL含10%的硝酸鋁溶液，搖勻顏色變淺，放置5min后，加入5mL含20%的氫氧化鈉溶液，溶液變?yōu)榧t色，再加60%乙醇定容至刻度線，輕微晃勻，靜置15 min，測(cè)定510nm處吸光度[17-18]。

1.2.2 提取工藝流程

紫花地丁多酚黃酮提取工藝流程見圖1。

圖1 紫花地丁多酚黃酮提取工藝流程Fig.1 Flow chart of extracting polyphenol and flavonoids from Viola philippica

以紫花地丁干燥品為原料，稱取一定量，加入不同量的60%乙醇，固定60℃，在一定的超聲功率下，超聲不同時(shí)間，提取3次，收集提取液。旋蒸除去乙醇，冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干備用[18-19]。

1.2.3 多酚及黃酮提取量的測(cè)定

1.2.3.1 多酚提取量的測(cè)定

精密稱取紫花地丁凍干粉1 mg，加入10 mL蒸餾水使其充分溶解。按照1.2.1.1方法測(cè)定其多酚提取量，將測(cè)定的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紫花地丁凍干粉中多酚提取量。

1.2.3.2 黃酮提取量的測(cè)定

精密稱取紫花地丁凍干粉1 mg，加入10 mL蒸餾水使其充分溶解。按照1.2.1.2方法測(cè)定其黃酮提取量，將其測(cè)定的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紫花地丁凍干粉黃酮提取量。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 料液比對(duì)多酚、黃酮提取量的影響

以固定功率270 W、乙醇濃度40%和溫度60℃的條件下提取 10min，料液比依次為 1∶15、1∶20、1∶25、1∶35、1 ∶40（g/mL），平行提取 3 次，考察料液比對(duì)多酚、黃酮提取量的影響[20]。

1.2.4.2 超聲溫度對(duì)多酚、黃酮提取量的影響

以固定料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度40%和超聲功率270 W 的條件下提取 10 min，在 20、40、60、80、100℃條件下平行提取3次，考察超聲溫度對(duì)多酚、黃酮提取量的影響。

1.2.4.3 超聲時(shí)間對(duì)多酚、黃酮提取量的影響

以固定料液比 1∶30（g/mL）、超聲功率 270 W、溫度60℃和乙醇濃度40%的工藝，分別提取 0、3、5、10、15 min。平行提取3次，考察超聲時(shí)間對(duì)多酚、黃酮提取量的影響。

1.2.4.4 超聲功率對(duì)多酚、黃酮提取量的影響

以固定料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度40%、溫度60 ℃的工藝，在超聲功率 0、90、180、270、360 W 條件下提取10 min。平行提取3次，考察超聲功率對(duì)多酚、黃酮提取量的影響。

以固定料液比 1∶30（g/mL）、超聲功率 270 W、溫度60℃的工藝，分別在乙醇濃度為10%、20%、40%、60%、80%條件下提取10 min，考察乙醇濃度對(duì)多酚、黃酮提取量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)工藝，為充分考量多酚、黃酮提取量的最佳提取條件，利用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken模型進(jìn)一步分析料液比、超聲時(shí)間、超聲功率3個(gè)因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)方案如表1所示[21-22]。

表1 響應(yīng)面分析因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖，采用Design-Expert 10.0.0軟件對(duì)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，P<0.05表示具有顯著性差異意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

2.1.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

隨著課程改革的深入發(fā)展，人們對(duì)新課改理念理解表面化、膚淺化的現(xiàn)象越來越少，語文教學(xué)高位化和形式化的教學(xué)越來越?jīng)]有市場(chǎng)，但應(yīng)試式、結(jié)論化的問題依然非常嚴(yán)重，甚至有愈演愈烈之勢(shì)。不少教師的備課就是抄教學(xué)參考書上的現(xiàn)成結(jié)論，上課就是直接或變著花樣和形式，將現(xiàn)成的結(jié)論再傳遞給學(xué)生。學(xué)生的學(xué)習(xí)過程，就是上課被動(dòng)接受現(xiàn)成結(jié)論，課后通過做各類題目強(qiáng)化結(jié)論的記憶。很顯然，這和語文本色教學(xué)的主張是大相徑庭的。本色語文并不局限于語文教語文，好的語文課應(yīng)該什么都有而一切又為了語文。可教師們常問：這樣的語文課，到底應(yīng)該怎么上？

沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=8.026 9x-0.001 7，y為吸光度；x為沒食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/g），R2=0.997 8，可得沒食子酸濃度為0～0.2 mg/mL具有較好的線性關(guān)系，可應(yīng)用于多酚提取量測(cè)定。

2.1.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.110 8x+0.001，y為吸光度；x為黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/g），R2=0.990 8，說明蘆丁濃度為于0～0.2 mg/mL具有良好的線性關(guān)系，可應(yīng)用于黃酮提取量測(cè)定。

2.2 不同提取條件對(duì)多酚黃酮提取量的影響

2.2.1 料液比對(duì)多酚、黃酮提取量的影響

料液比對(duì)多酚、黃酮提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)多酚、黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction of polyphenol and flavonoids

由圖 2可知，在料液比 1∶15（g/mL）～1∶40（g/mL）內(nèi)，在增加溶劑的情況下，多酚、黃酮提取量均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中料液比為1∶35（g/mL）時(shí)，多酚和黃酮的提取量均處于最高值，所以提取紫花地丁多酚、黃酮的最佳料液比為1∶35（g/mL）。

2.2.2 超聲溫度對(duì)多酚、黃酮提取量的影響

超聲溫度對(duì)多酚、黃酮提取量的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)多酚、黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of polyphenol and flavonoids

由圖3可知，在超聲溫度20℃～100℃時(shí)，隨著超聲溫度的增加，多酚、黃酮提取量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而當(dāng)60℃時(shí)，其提取量均達(dá)到最高值，所以最佳超聲溫度為60℃。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)多酚、黃酮提取量的影響

超聲時(shí)間對(duì)多酚、黃酮提取量的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)多酚、黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasound time on the extraction of polyphenol and flavonoids

由圖4可知，在0～15 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚、黃酮提取量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但在5 min～15 min時(shí)，提取量相對(duì)較平緩，所以其最佳超聲時(shí)間為5 min。

2.2.4 超聲功率對(duì)多酚、黃酮提取量的影響

超聲功率對(duì)多酚、黃酮提取量的影響見圖5。

圖5 超聲功率對(duì)多酚、黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction power on the extraction of polyphenol and flavonoids

由圖5可知，在0～360 W時(shí)，多酚和黃酮提取量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。在270 W時(shí)，提取量達(dá)到最大值，由此確定最佳超聲功率為270 W。

2.2.5 乙醇濃度對(duì)多酚、黃酮提取量的影響

乙醇濃度對(duì)多酚、黃酮提取量的影響見圖6。

圖6 乙醇濃度對(duì)多酚、黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of ethanol on the extraction of polyphenol and flavonoids

由圖6可知，在乙醇濃度為10%～80%時(shí)，多酚、黃酮提取量均出現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)，在40%時(shí)達(dá)到最大值。由此確定最佳乙醇濃度為40%。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與回歸模型的建立

基于單因素試驗(yàn)的多酚、黃酮提取量，利用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken模型進(jìn)一步分析料液比、超聲時(shí)間、超聲功率3因素對(duì)多酚、黃酮提取量的影響情況，獲得最優(yōu)的提取工藝[15-16]。響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果以及方差分析見表2～表4。

表2 響應(yīng)面法提取多酚黃酮提取量的結(jié)果Table 2 Results for response surface method to extract the content of polyphenol and flavonoids

表3 多酚提取工藝方差分析Table 3 Variance analysis of the extraction process of polyphenols

表4 黃酮提取工藝方差分析Table 4 Variance analysis of flavone extraction process

運(yùn)用Design-Expert 10.0.0軟件對(duì)提取的回歸模型及方差分析結(jié)果進(jìn)行擬合，得到相關(guān)的提取工藝回歸公式：（1）多酚提取量=28.70+1.98A+2.70B+2.05C+3.84AB+0.56AC+0.36BC-4.85A2-12.14B2-6.37C2；（2）黃酮提取量=24.34+3.85A+3.29B+4.67C+2.41AB+3.91AC-0.77BC-3.64A2-11.72B2-2.69C2。

對(duì)公式（1）進(jìn)行方差分析，回歸方程的R2=0.983 2，說明模型擬合效果良好，此模型可以解釋98.32%響應(yīng)值的變化，可用于預(yù)測(cè)、分析紫花地丁中多酚的實(shí)際提取量。由表3可知，超聲功率是多酚提取量的最主要的影響因素，且超聲功率、超聲時(shí)間、料液比對(duì)多酚提取量都具有顯著性影響。

對(duì)公式（2）進(jìn)行方差分析，回歸方程的R2=0.984 7，說明模型擬合效果良好，此模型可以解釋98.47%響應(yīng)值的變化，可用于預(yù)測(cè)、分析紫花地丁中黃酮的實(shí)際提取量。由表4可知，超聲時(shí)間是黃酮提取量的最主要的影響因素，且超聲時(shí)間、超聲功率、料液比均顯著影響黃酮提取量。

2.3.2 交互因素對(duì)多酚、黃酮提取量響應(yīng)面曲面圖

運(yùn)用Design-Expert 10.0.0統(tǒng)計(jì)與分析獲得響應(yīng)面曲面圖。曲面彎曲明顯說明該因素對(duì)多酚、黃酮提取量的影響顯著，反之則表明該因素對(duì)多酚、黃酮提取量的影響不大。

2.3.2.1 多酚提取量曲面圖

不同條件因素下多酚提取量情況見圖7～圖9。

圖7 不同料液比、超聲功率條件下多酚提取量響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of polyphenol extraction under different liquid-solid ratio and ultrasonic power

圖8 不同料液比、超聲時(shí)間條件下多酚提取量響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of polyphenol extraction under different liquid-solid ratio and ultrasonic time

圖9 不同超聲功率、超聲時(shí)間條件下多酚提取量響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface diagram of polyphenol extraction under different ultrasonic power and ultrasonic time

由圖7可知，在60℃下提取8 min時(shí)，料液比和超聲功率交互作用對(duì)多酚提取量的影響，在料液比不變時(shí)，隨著超聲功率的增大，多酚提取量呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)。而當(dāng)超聲功率不變時(shí)，隨著溶液體積的增大，提取量也是呈現(xiàn)先遞增后遞減趨勢(shì)。

由圖8可知，在60℃、超聲功率180 W時(shí)，超聲時(shí)間和料液比交互作用對(duì)多酚提取量的影響，在超聲時(shí)間不變時(shí)，隨著溶液體積的增大，提取量出現(xiàn)先增大后遞減的趨勢(shì)。且在料液比不變時(shí)，超聲時(shí)間的不斷加大，提取量也是先增大后遞減的趨勢(shì)。

由圖9可知，在60℃、料液比1∶15（g/mL）條件下，超聲時(shí)間與超聲功率交互作用對(duì)多酚提取量的影響。在超聲時(shí)間不變的情況下，多酚提取量隨著超聲功率增大而先遞增后遞減，超聲功率一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚提取量也是先增加后減少。

2.3.2.2 黃酮提取量曲面圖

不同條件因素下黃酮提取量情況見圖10～圖12。

圖10 不同料液比、超聲功率條件下黃酮提取量響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface diagram of flavonoid extraction under different liquid-solid ratio and ultrasonic power

圖11 不同料液比、超聲時(shí)間條件下黃酮提取量響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface diagram of flavonoid extraction under different liquid-solid ratio and ultrasonic time

圖12 不同超聲功率、超聲時(shí)間條件下黃酮提取量響應(yīng)面圖Fig.12 Response surface diagram of flavonoid extraction under different ultrasonic power and ultrasonic time

由圖10可知，在60℃下提取8 min時(shí)，料液比和超聲功率交互作用對(duì)黃酮提取量的影響，在料液比不變時(shí)，隨著超聲功率的增大，黃酮提取量呈現(xiàn)先遞增后遞減的趨勢(shì)。而當(dāng)超聲功率不變時(shí)，隨著溶液體積的增大，提取量也呈現(xiàn)先遞增后遞減趨勢(shì)。

由圖11可知，在60℃、超聲功率180 W時(shí)，超聲時(shí)間和料液比交互作用對(duì)黃酮提取量的影響，當(dāng)超聲時(shí)間不變時(shí)，隨著溶液體積的增大，提取量呈先增加后減少趨勢(shì)。同時(shí)當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量也出現(xiàn)先遞增后遞減趨勢(shì)。

由圖12可知，在60℃、料液比1∶15（g/mL）條件下，超聲時(shí)間與超聲功率交互作用對(duì)黃酮提取量的影響，在超聲時(shí)間不變時(shí)，提取量隨著超聲功率增大而呈現(xiàn)先遞增后遞減趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率不變時(shí)，提取量也呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)。

2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)與優(yōu)化，可得最佳的優(yōu)化的參數(shù)。1）多酚提取優(yōu)化方案為料液比1∶14.29（g/mL）、超聲功率208.50 W、超聲時(shí)間9.24 min，預(yù)測(cè)的多酚提取量為29.367 mg/g。2）黃酮提取優(yōu)化方案為料液比1∶12.50（g/mL）、超聲功率 214.32W、超聲時(shí)間11.31min，預(yù)測(cè)的黃酮提取量為28.30 mg/g。實(shí)際驗(yàn)證操作中修正方案為1）多酚實(shí)際修正參數(shù)為料液比1∶14（g/mL）、超聲功率210 W、超聲時(shí)間9 min。2）黃酮實(shí)際修正參數(shù)為料液比1∶13（g/mL）、超聲功率215 W、超聲時(shí)間11 min。按修正后的工藝參數(shù)驗(yàn)證，進(jìn)行3次平行提取試驗(yàn)，分別獲得紫花地丁多酚提取量為29.04 mg/g，黃酮提取量為28.02 mg/g。修正工藝參數(shù)獲得的多酚、黃酮提取量與預(yù)測(cè)提取量無明顯差異，說明基于響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝參數(shù)是可行的。

3 結(jié)論

基于響應(yīng)面法通過超聲輔助提取紫花地丁的多酚、黃酮提取量，在單因素參數(shù)條件的前提下運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行多因素曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了紫花地丁多酚、黃酮的二次多項(xiàng)式回歸模型。優(yōu)化設(shè)計(jì)紫花地丁中多酚最佳提取工藝為超聲時(shí)間9 min、超聲功率210 W、料液比1∶14（g/mL）。黃酮最佳提取工藝為超聲時(shí)間11 min、超聲功率 215 W、料液比 1∶13（g/mL）。而通過該優(yōu)化工藝參數(shù)可得多酚提取量達(dá)到預(yù)測(cè)值的98.98%，黃酮提取量達(dá)到預(yù)測(cè)值的99.01%。說明響應(yīng)面法可用于優(yōu)化紫花地丁多酚、黃酮提取量的提取方案，且試驗(yàn)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單，安全無毒，為深入研究紫花地丁中多酚、黃酮基礎(chǔ)物質(zhì)研究提供了理論依據(jù)。