桑葉黃酮的雙水相萃取及其抗氧化活性研究

于建麗，王汝華，孟琬星，梁增瀾，3，宋璇，孔宇，陸旸，尹吉泰，李超，

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津市食品研究所有限公司，天津 301609；3.北京國貿東孚工程科技有限公司，北京 100032；4.天津食品集團有限公司，天津 300074）

桑科植物桑（Morus alba L.）在中國各地被廣泛種植，且產量較高。2002年桑葉被中國衛(wèi)生部批準為藥食同源食品[1]。桑葉中含有豐富的營養(yǎng)物質，如多糖、蛋白質、黃酮類，生物堿類等[2]。其中黃酮類化合物是桑葉的重要活性成分，并在其食療功效中起著關鍵作用[3]。桑葉黃酮（mulberry leaves flavone，MLF）具有抗氧化[4]、降糖降脂[1]、抑菌[5]等功效，是極具潛力的功能性食品產品添加劑。

目前，桑葉乙醇-水提取物中黃酮類化合物的提取率較高，但成分復雜，分離難度較大，多采用有機溶劑萃取法配合大孔吸附樹脂柱層析法進行分離純化。有機溶劑萃取法雖然對于不同極性的物質分離效果明顯，但有機溶劑殘留會阻礙活性物質的應用[6]。而雙水相（aqueous two-phase system，ATPS）萃取技術則是利用親水有機溶劑與離子液體在水溶液中分相，根據被分離物在兩相中溶解度的差異進行分離，并能夠保持良好的生物活性[7]。因其具有分相清晰、綠色環(huán)保、操作簡便、萃取率高等優(yōu)點[8]，近年來雙水相萃取在天然產物分離方面被廣泛研究應用[9]。

因此，本研究探究乙醇-無機鹽雙水相體系對桑葉黃酮的分離純化效果及其對體外抗氧化活性的影響，以期為桑葉黃酮作為抗氧化劑添加劑應用于食品領域提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉：采摘自天津薊州山區(qū)。

九水合硝酸鋁、硫酸鉀、硫酸銨、氫氧化鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津市江天化工技術股份有限公司；磷酸氫二鉀、無水碳酸鈉、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市化學試劑一廠；亞硝酸鈉、氯化鈉、三氯乙酸、氯化鐵（均為分析純）：天津市光復科技發(fā)展有限公司；AB-8大孔吸附樹脂、還原型輔酶Ⅰ二鈉（NADH-Na2）、氯化硝基四氮唑藍（nitroblue-tetrazolium，NBT）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methyl sulfate，PMS）、蘆丁標準品（≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ2200v超聲波處理器：江蘇昆山超聲儀器有限公司；IKA RV 8旋轉蒸發(fā)儀：瓦恩默電器股份有限公司；UV-5100B紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；TGL-21高速冷凍離心機：四川蜀科儀器有限公司；Multiskan FC酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉黃酮粗提物的制備

新鮮桑葉50℃溫度烘干4 h，干燥粉碎，過60目篩。根據前期提取工藝優(yōu)化試驗結果，選擇84%乙醇溶液、料液比1∶8（g/mL）、提取溫度50℃、提取時間30 min/次，超聲輔助提取3次，離心合并上清液，得到桑葉黃酮粗提物（mulberry flavone extract，MFE）。

1.3.2 總黃酮的測定

參照孫雪皎等[10]的黃酮檢測方法，以蘆丁為標準品，制作標準曲線，方程為 y=1.1288x-0.0042（R2=0.9995）。

1.3.3 雙水相成相研究

選擇無水乙醇為有機相，氯化鈉、碳酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鉀和硫酸銨作為試驗無機鹽，采用濁點滴定法[11]繪制雙水相系圖。

1.3.4 雙水相萃取單因素試驗

根據雙水相系圖，乙醇質量分數分別選擇25%、30%、35%、40%、45%，硫酸銨質量分數分別選擇5%、10%、15%、20%、25%，MFE 添加量分別選擇 2、4、6、8、10 mg/mL進行單因素試驗。室溫25℃下，溶解混勻，3 000 r/min離心10 min，分液，計算相比R、分配系數K、萃取率Y，計算公式如下。

式中：V1、V2分別為上、下相的體積，mL；C1、C2分別為上下相的總黃酮濃度，mg/mL。

1.3.5 雙水相萃取響應面試驗

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken響應面試驗對萃取工藝條件進一步優(yōu)化。分別選定乙醇質量分數、硫酸銨質量分數、MFE添加量作為響應面的3個因素，以桑葉黃酮萃取率Y為響應值，設計響應面試驗，并對結果進行回歸分析和優(yōu)化，各因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken響應面設計Table 1 Box-Behnken response surface design

1.3.6 大孔吸附樹脂純化

使用AB-8大孔吸附樹脂分別對未經過萃取的MFE和經過雙水相萃取后的萃取物進行分離純化。將樣品配制成一定濃度的溶液，按5 mg總黃酮/g樹脂的上樣量上樣，保持3 mL/min的流速，用3倍柱體積（column volume，CV）的超純水沖洗，隨后用2 CV的10%乙醇水溶液除去雜質，最后用3 CV的80%乙醇水溶液進行洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮，凍干得到固體MLF1和MLF2。

1.3.7 桑葉黃酮的抗氧化活性測定

參考石玉平等[12]、陳青青等[13]、ALARA O R 等[14]、萬聆[15]的方法，檢測 MLF1 和 MLF2 對于·OH、ABTS+·、DPPH·、O2-·的清除能力，以蘆丁做陽性對照，并計算其半數抑制濃度（IC50）。

1.3.8 數據處理

所有試驗進行3次平行測定，試驗結果以平均值±標準差表示。圖表繪制使用Origin 2019b，采用IBM SPSS 26.0對數據進行統計分析，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 桑葉黃酮分離萃取雙水相體系的確定

分相試驗表明，氯化鈉無法與乙醇形成雙水相體系，其余無機鹽均可與乙醇形成雙水相溶液，結果如圖1所示。

圖1 4種不同無機鹽的雙水相系圖Fig.1 Aqueous two-phase systems with four different inorganic salt

由圖1可知，4種無機鹽分相范圍大小排序為硫酸銨>磷酸氫二鉀>碳酸鈉>硫酸鉀。乙醇-硫酸鉀體系中，硫酸鉀容易析出，分相時乙醇、無機鹽質量分數均較小，不利于黃酮類物質的萃取。硫酸銨在乙醇中溶解度較低，與乙醇爭奪水分子能力較強，可達到很好的分離效果[16]。

此外，由于部分黃酮類化合物難溶于水，易溶于弱堿性溶液和乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑，而磷酸氫二鉀與碳酸鈉均為強堿弱酸鹽，溶液呈弱堿性，使得上下相黃酮幾乎平均分布，不利于黃酮類化合物在上相中富集[17-18]。因此，本研究選擇乙醇-硫酸銨雙水相體系進行萃取分離，根據在雙水相系圖中乙醇質量分數范圍25.80%～45.15%，硫酸銨質量分數范圍3.96%～20.38%，進行單因素試驗。

2.2 雙水相體系單因素試驗

乙醇質量分數、硫酸銨質量分數、MFE添加量對桑葉黃酮萃取率Y的影響，結果如圖2～圖4所示。

圖2 乙醇質量分數對萃取率的影響Fig.2 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate

圖3 硫酸銨質量分數對萃取率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate mass fraction on the extraction rate

圖4 MFE添加量對萃取率的影響Fig.4 Effect of the amount of MFE added on the extraction rate

由圖2可知，隨著乙醇質量分數的增大，相比R逐漸增大，分配系數K先增大后減小。乙醇質量分數25%～35%時，萃取率Y差異顯著（P<0.05），在乙醇質量分數為35%時達到最大值，隨后略有減小，無顯著性差異?？赡苁怯捎谝掖紝λ肿拥母偁幠芰υ鰪?，使兩相更容易分開[19]，上相體積隨乙醇質量分數的增加而增加，而且黃酮具有醇溶性，這有助于黃酮類物質在上相富集。然而，過高的乙醇濃度會導致鹽析出，還會引起小分子雜質溶出，降低桑葉黃酮的溶解量[20]。因此，選擇乙醇質量分數35%進行后續(xù)試驗。

由圖3可知，相比R隨硫酸銨質量分數的增大而減小，這是因為下相中硫酸銨結合水的能力增強，下相體積增加。分配系數K隨硫酸銨質量分數的增大先上升后趨于平緩，萃取率Y隨硫酸銨質量分數的增大先增大后略有減小。硫酸銨質量分數為5%～15%時，相比R、分配系數K和萃取率Y差異顯著（P<0.05）。硫酸銨質量分數為15%時，萃取率Y達到最大（95.61±0.97）%，此時下相溶液基本飽和，黃酮在上相中溶解較多，達到良好的分配效果。過飽和后會有硫酸銨析出，目標物略有減少。因此，選擇硫酸銨質量分數15%進行后續(xù)試驗。

由圖4可知，隨著MFE添加量的增大，萃取率Y和分配系數K逐漸減小。相比R基本不變且無明顯差異。MFE添加量為2 mg/mL～6 mg/mL時，萃取率Y無顯著性差異。但當MFE添加量≥8 mg/mL時，萃取率Y明顯下降，這是由于添加量過大，黃酮溶解度達到飽和。因此，為達到較高的萃取率并節(jié)約成本，選擇MFE添加量6 mg/mL進行后續(xù)試驗。

2.3 雙水相體系響應面試驗

2.3.1 響應面試驗結果及方差分析

本試驗采用擬合二次多項式回歸模型的Box-Behnken響應面法設計試驗，以桑葉黃酮萃取率Y為響應值，對乙醇-硫酸銨雙水相萃取工藝進行優(yōu)化，響應面試驗結果和模型方差分析結果如表2和表3所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface experimental results

表3 響應面二次回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic regression model

由表3可知，模型的擬合度達到極顯著水平，失擬項不顯著，所選的二次回歸模型合理，能夠預測桑葉黃酮萃取率Y?；貧w模型R2=0.991 5，說明模型與實際試驗擬合情況良好。試驗中3個因素對桑葉黃酮萃取率Y影響均為極顯著，影響大小依次為C>B>A，即MFE添加量>硫酸銨質量分數>乙醇質量分數。響應值與各因素間多元回歸擬合方程為Y=95.47+1.01A+1.30B-1.73C-0.70AB+0.42AC+0.14BC-1.62A2-1.30B2-1.91C2。

2.3.2 響應面分析及驗證試驗

響應面分析及驗證試驗結果如圖5所示。

圖5 各因素交互作用響應面和等高線圖Fig.5 Surface plots and contour plots for the interactions of various factors

由圖5可知，交互項AB的等高線變化密集，變化范圍大，3D圖對角走勢陡峭，交互作用極顯著；交互項AC的等高線變化較密，變化范圍較大，3D圖對角走勢較陡，交互作用顯著；但交互項BC交互作用不顯著，與方差分析結果一致。研究表明，萃取率Y受3種因素綜合影響，不是簡單的線性關系。

根據試驗結果得出推薦工藝參數為乙醇質量分數35.82%，硫酸銨質量分數17.18%，MFE添加量5.16 mg/mL，預測萃取率Y為96.19%。為便于操作，選擇在乙醇質量分數36%、硫酸銨質量分數17%、MFE添加量5 mg/mL的條件下進行3次驗證試驗，桑葉黃酮萃取率Y 可達（95.74±0.58）%，此時相比 R=1.84±0.17，分配系數K=11.82±0.34，達到預測值的99.53%，說明該試驗選用的模型與實際擬合良好。

2.4 純化結果

經過純化后，MLF1的純度達到（61.48±0.54）%，MLF2 純度達到（80.32±0.18）%，相較于蘇偉等[21]、王珂[22]單一大孔吸附法純化桑葉黃酮，純度提高了接近一倍。

2.5 桑葉黃酮抗氧化活性結果

2.5.1 ·OH清除率的測定

MLF1、MLF2和蘆丁對·OH清除率的影響如圖6所示。

圖6 MLF1、MLF2、蘆丁對·OH清除率的影響Fig.6 Effects of MLF1，MLF2 and rutin on·OH scavenging rate

由圖6可知，濃度為0.02 mg/mL～0.10 mg/mL時，MLF1、MLF2和蘆丁對·OH清除率的影響隨樣品濃度增大而增大，存在劑量依賴效應。根據半數抑制濃度比較，·OH清除能力從大到小依次為MLF2（IC50=0.028 mg/mL）>蘆?。↖C50=0.059 mg/mL）>MLF1（IC50=0.077 mg/mL），各組內均存在顯著性差異。這是由于MLF2中存在多種黃酮類物質，如蘆丁、槲皮素、桑色素、異槲皮苷、金絲桃苷等[23-25]，共同作用下對·OH清除能力優(yōu)于蘆丁單體。抗氧化活性與總黃酮純度存在正相關性[26]，而MLF1純度較低，清除能力較差。在0.10 mg/mL濃度下，MLF2對·OH清除率可達（87.18±1.00）%。

2.5.2 ABTS+·清除率的測定

MLF1、MLF2和蘆丁對ABTS+·清除率的影響如圖7所示。

圖7 MLF1、MLF2和蘆丁對ABTS+·清除率的影響Fig.7 Effects of MLF1，MLF2 and rutin on ABTS+·scavenging rate

由圖7可知，在0.02 mg/mL～0.10 mg/mL的濃度范圍內，MLF1、MLF2和蘆丁對ABTS+·清除率的影響隨樣品濃度增加而增大，存在劑量依賴效應。根據半數抑制濃度比較，ABTS+·的清除能力從大到小依次為蘆?。↖C50=0.033 mg/mL）>MLF2（IC50=0.034 mg/mL）>MLF1（IC50=0.064 mg/mL），MLF1清除率與其余兩組差異顯著。MLF2對于ABTS+·的清除能力相對較好。在0.10mg/mL濃度下，MLF2的ABTS+·清除率可達（99.70±0.31）%，與桑葉乙酸乙酯萃取物的結果基本一致[27]。這是因為MLF2總黃酮純度較高，黃酮類化合物的B環(huán)3位酚羥基結構可以有效增強抗氧化活性[28]。

2.5.3 DPPH·清除率的測定

MLF1、MLF2和蘆丁對DPPH·清除率的影響如圖8所示。

圖8 MLF1、MLF2、蘆丁對DPPH·清除率的影響Fig.8 Effects of MLF1，MLF2 and rutin on DPPH·scavenging rate

由圖8可知，在0.02 mg/mL～0.10 mg/mL的濃度范圍內，MLF1、MLF2和蘆丁對DPPH·清除率的影響隨樣品濃度增加而增加，存在劑量依賴效應。隨著濃度的增加，MLF2的清除率逐漸高于MLF1和蘆丁。樣品濃度≥0.80 mg/mL時，MLF2清除率與其余兩組差異顯著，這是由于MLF2中多種黃酮的協同作用逐漸顯著[29]。根據半數抑制濃度比較，DPPH·的清除能力從大到小依次為 MLF2（IC50=0.066 mg/mL）>蘆?。↖C50=0.107mg/mL）>MLF1（IC50=0.112 mg/mL）。在 0.10mg/mL濃度下，MLF2的清除率可達（78.99±0.14）%，說明雙水相萃取可顯著提升DPPH·清除能力。

2.5.4 O2-·清除率的測定

MLF1、MLF2和蘆丁對于O2-·清除率的影響如圖9所示。

圖9 MLF1、MLF2、蘆丁對O2-·的清除率的影響Fig.9 Effects of MLF1，MLF2 and rutin on O2-·scavenging rate

由圖9可知，在0.02 mg/mL～0.10 mg/mL的濃度范圍內，MLF1、MLF2和蘆丁對O2-·清除率的影響隨樣品濃度增加而增加，存在劑量依賴效應。根據半數抑制濃度比較，清除O2-·的能力從大到小依次為蘆?。↖C50=0.050 mg/mL）>MLF2（IC50=0.080 mg/mL）>MLF1（IC50=0.109mg/mL），各組內均存在顯著性差異。MLF2對O2-·有一定的清除能力，相較于蘆丁略差，各濃度下均顯著低于蘆丁。0.10 mg/mL濃度下，MLF2的O2-·清除率可達（59.39±0.60）%。這可能是因為除多種黃酮的協同作用外，還可能因為羥基數量較多，在特定反應體系中分子間形成氫鍵，出現復雜的拮抗作用[29]，減弱了MLF2對于O2-·的清除能力。

3 討論與結論

本研究旨在選擇綠色安全、便于量產的純化方法，得到較高純度的桑葉黃酮，并對其體外抗氧化活性進行分析。試驗結果表明，雙水相萃取系統的最佳工藝參數為乙醇質量分數36%、硫酸銨質量分數17%、MFE添加量5 mg/mL，進一步純化后得到MLF2，其純度達到（80.32±0.18）%。此外，MLF2抗氧化能力顯著高于MLF1，初步證明經雙水相萃取得到的桑葉黃酮具有良好的抗氧化活性，說明在純化過程中有效去除了很多對反應體系產生影響的雜質。上述試驗結果可為桑葉黃酮的分離純化以及活性研究提供參考，具有一定的理論研究及工業(yè)應用價值。