基于改進(jìn)的熒光原位雜交技術(shù)定位B 型煙粉虱內(nèi)共生菌Portiera 和Wolbachia

盧珍華，閆曉會(huì)，馬亞杰，單永潘，宋賢鵬，劉青梅，王丹，胡紅巖*，馬艷*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽 455000；2.安陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 安陽 455000）

內(nèi)共生菌是生活在昆蟲體內(nèi)與宿主協(xié)同進(jìn)化的一類共生微生物， 幾乎存在于所有昆蟲體內(nèi)。 昆蟲內(nèi)共生菌分為初生共生菌和次生共生菌。 初生共生菌為宿主生長發(fā)育所必需的細(xì)菌，能為宿主提供營養(yǎng)物質(zhì)，比如一些氨基酸、類胡蘿卜素等，而這些物質(zhì)是宿主無法通過取食補(bǔ)充的，特別是在宿主生長發(fā)育的早期階段。 共生菌在宿主體內(nèi)的分布多種多樣， 除生殖細(xì)胞外，在其他組織中也有分布。 在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，共生菌與宿主形成了互利共生的關(guān)系，以多種方式影響宿主生命活動(dòng)，如參與宿主的營養(yǎng)代謝[1]，提高宿主的耐熱性及適應(yīng)性[2]，增強(qiáng)宿主對(duì)病毒的防御能力[3-4]，調(diào)節(jié)宿主的抗藥性[5-6]，調(diào)控宿主生殖生長[7]等。

煙粉虱Bemisia tabaci屬于半翅目Hemiptera粉虱科Aleyrodidae 小粉虱屬Bemisia，能夠直接取食寄主植物、傳播多種植物病毒，給多種作物造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，特別是對(duì)棉花、蔬菜等作物[8]。 煙粉虱寄主范圍廣泛，在行為、危害習(xí)性和傳毒能力等方面又分化為多種生物型，再加上化學(xué)農(nóng)藥的大量使用， 使煙粉虱的抗藥性不斷增強(qiáng)，防治十分困難[9]。煙粉虱有30 多個(gè)隱種，不同隱種之間共生菌組成存在很大差異，所有煙粉虱種群均含有初生共生菌CandidatusPortiera aleyrodidarum，除此之外，煙粉虱中還含有多種次 生 共 生 菌， 如Hamiltonella、Arsenophonus、Cardinium、Rickettsia、Hemipteriphilus、Wolbachia及Fritschea[10]等。 這些共生菌通常共存于昆蟲特化的細(xì)胞——含菌細(xì)胞（Bacteriocyte），并通過卵巢傳遞給下一代。Wolbachia作為分布最廣的次生菌，能夠在宿主中產(chǎn)生胞質(zhì)不親和、孤雌生殖、雌性化以及殺雄等多種生殖調(diào)控作用[11]。 Li 等[12]研究了Wolbachia在不同煙粉虱種群中的感染情況，認(rèn)為Wolbachia可能在B 型和Q 型煙粉虱種群擴(kuò)張及入侵過程中發(fā)揮重要作用。

熒光原位雜交（Florescencein situhybridization,FISH）是利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則將熒光探針與組織中靶標(biāo)序列結(jié)合，對(duì)序列進(jìn)行定位、定性或定量分析的一項(xiàng)技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)昆蟲體內(nèi)共生菌的定位[13]。Koga 等[14]建立了基于整蟲染色的FISH 方法， 對(duì)豌豆蚜Acyrthosiphon pisum進(jìn)行整蟲染色后，成功觀察到了初生共生菌Buchnera在蚜蟲體內(nèi)的分布。 隨后，研究人員應(yīng)用該技術(shù)對(duì)煙粉虱內(nèi)共生菌的分布進(jìn)行了定位分析。Caspi-Fluger 等[15]研究了Rickettsiasp.在煙粉虱體內(nèi)的分布， 認(rèn)為Rickettsia在煙粉虱中呈現(xiàn)分散型及限制型2 種分布模式， 在分散型模式中，Rickettsia在煙粉虱血腔中分布，而不存在于含菌細(xì)胞中， 在限制型模式中，Rickettsia僅在含菌細(xì)胞中分布。 Gottlieb 等[16]研究了其他共生菌在煙粉虱體內(nèi)的分布， 結(jié)果表明次生共生菌Hamiltonella和Arsenophonus與初生共生菌Portiera共生于含菌細(xì)胞中， 而Wolbachia和Cardinium除在含菌細(xì)胞中分布外， 在其他組織內(nèi)也有分布。Skaljac 等[17]的FISH 研究結(jié)果表明Wolbachia僅分布于含菌細(xì)胞中。 而Shi 等[18]研究認(rèn)為Wolbachia在亞洲Ⅱ7 煙粉虱隱種個(gè)體中呈現(xiàn)2種分布模式，一種是僅在含菌細(xì)胞中分布，另一種是在含菌細(xì)胞和血腔中均有分布。 上述研究表明不同類型的共生菌在煙粉虱體內(nèi)的分布不同，在自然感染W(wǎng)olbachia的煙粉虱種群中， 初生共生菌Portiera的分布位置相對(duì)比較固定，而Wolbachia的分布模式存在很大差異。 基于FISH 技術(shù)的共生菌定位分析依賴于雜交探針發(fā)出的熒光信號(hào)，當(dāng)共生菌的含量比較低時(shí)，F(xiàn)ISH 探針熒光信號(hào)較弱[19]，影響觀察結(jié)果；另外，昆蟲的幾丁質(zhì)、脂肪體或其他雜質(zhì)與探針結(jié)合形成假陽性信號(hào)，也是影響FISH 結(jié)果的因素之一[20]。 因此，優(yōu)化FISH 方法對(duì)提高共生菌定位分析的準(zhǔn)確度具有重要意義。

共生菌在宿主體內(nèi)的作用與它們?cè)谒拗黧w內(nèi)的分布模式密切相關(guān)，研究其在宿主體內(nèi)的分布，對(duì)揭示共生菌與宿主的共生機(jī)制具有重要意義。 基于顯微注射技術(shù)的人工轉(zhuǎn)染可以實(shí)現(xiàn)Wolbachia在不同宿主之間的水平轉(zhuǎn)移，Zhong等[21]通過偽蛹注射技術(shù)將管氏腫腿蜂Scleroderma guani的Wolbachia wSguBJ 導(dǎo)入煙粉虱體內(nèi)，首次實(shí)現(xiàn)了外源Wolbachia在煙粉虱中的轉(zhuǎn)染，通過生物學(xué)雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了外源Wolbachia在煙粉虱中能夠引起宿主的胞質(zhì)不親和現(xiàn)象，但該外源Wolbachia在新宿主煙粉虱體內(nèi)的分布尚不清楚。 本研究以人工轉(zhuǎn)染W(wǎng)olbachia的煙粉虱種群為研究對(duì)象， 采用FISH 方法對(duì)不同蟲態(tài)煙粉虱中的共生菌進(jìn)行染色， 以煙粉虱初生共生菌Portiera為對(duì)照，分析次生共生菌Wolbachia在新宿主煙粉虱中的分布。 同時(shí)，針對(duì)煙粉虱成蟲腹部組織復(fù)雜、探針難以穿透組織內(nèi)部造成染色效果不佳的問題， 本研究采用一種改進(jìn)的FISH 方法，對(duì)成蟲腹部解剖組織進(jìn)行染色觀察，對(duì)2 種內(nèi)共生菌在煙粉虱中的分布進(jìn)行分析， 擬為Wolbachia與煙粉虱的互作關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)ハx：以不攜帶Wolbachia的B 型煙粉虱種群為受體昆蟲，在人工氣候箱中飼養(yǎng)，條件為溫度27 ℃±2 ℃， 相對(duì)濕度為60%～80%，光照14 h/黑暗10 h。Wolbachia感染的管氏腫腿蜂為供體昆蟲，以黃粉蟲Tenebrio molitor為寄主繁殖，飼養(yǎng)條件：25～28 ℃，相對(duì)濕度65%，全暗。

供試棉花品種中棉所49 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。 用自配的基質(zhì)在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)棉花， 基質(zhì)由營養(yǎng)土和蛭石以2∶1 的體積比配制而成， 定期添加營養(yǎng)液以促進(jìn)棉花生長，待棉花長至5～6 片葉時(shí)供試。

1.2 人工轉(zhuǎn)染W(wǎng)olbachia 煙粉虱種群建立

參照Zhong 等[21]的方法從管氏腫腿蜂中提取Wolbachia， 將帶有煙粉虱偽蛹的棉花葉片置于含5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂的培養(yǎng)皿上，在體式顯微鏡下， 使用Nanolitre 2000 顯微注射儀，將Wolbachia轉(zhuǎn)入不攜帶Wolbachia的煙粉虱偽蛹，并置于人工氣候箱培養(yǎng)。 偽蛹羽化后，對(duì)雌雄成蟲進(jìn)行配對(duì)， 交配產(chǎn)卵5 d 后， 對(duì)成蟲進(jìn)行Wolbachia分子檢測(cè)， 舍棄未成功轉(zhuǎn)染的煙粉虱及其后代，構(gòu)建Wolbachia感染的煙粉虱種群。在轉(zhuǎn)染后第5～6 代煙粉虱仍攜帶Wolbachia，對(duì)轉(zhuǎn)染種群進(jìn)行FISH 染色觀察， 以未轉(zhuǎn)染煙粉虱的偽蛹作為陰性對(duì)照。

1.3 探針的合成與試劑配制

探針合成：用于定位初生共生菌Portiera的探針序列為5'-Cy3-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3'，定位Wolbachia的探針為Cy5 標(biāo)記的W2 序列5'-Cy5-CTTCTGTGAGTACCGTCATTATC-3'，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

試劑配制： 組織固定液由質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99%、99.7%和99.5%的三氯甲烷、 無水乙醇和冰醋酸以6∶3∶1 的體積比配制而成，脫色液由無水乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水以4∶1 的體積比配制而成。 雜交緩沖液和洗脫緩沖液的配制參考周曉飛[22]的方法。 0.01 mol·L－1的磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline,PBS,pH 7.2～7.6）、抗熒光猝滅封片劑和Kisser’s 封片劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4 樣本收集與組織解剖

煙粉虱整蟲樣本收集：在光學(xué)顯微鏡下用昆蟲針挑取葉片上的煙粉虱各階段蟲態(tài)，包括卵、1齡若蟲、2 齡若蟲、3 齡若蟲和4 齡若蟲 （偽蛹），用吸蟲器分別吸取煙粉虱雌性成蟲和雄性成蟲。每個(gè)蟲態(tài)各取20 頭，置于2.0 mL 離心管中，1 管為1 次重復(fù)，共計(jì)3 次重復(fù)。

煙粉虱成蟲腹部組織解剖：在體式顯微鏡下解剖煙粉虱卵巢。 首先，選擇無菌載玻片，在中間位置滴加100 μL PBS 緩沖液， 將待解剖的雌性成蟲放入緩沖液中；然后，用昆蟲針固定住昆蟲的胸部腹板，用解剖針剖開煙粉虱腹部，去除蟲體殘殼等雜物， 獲得煙粉虱卵巢及含菌細(xì)胞樣本，立即用組織固定液進(jìn)行固定。 采用同樣的方法獲得雄蟲腹部含菌細(xì)胞。

1.5 熒光原位雜交

1.5.1整蟲樣本FISH。參考Gottieb 等[16]的方法，并稍加改動(dòng)（樣品的脫色時(shí)間延長4 h）：首先，將收集的樣本放入1.5 mL 離心管中，加入1 mL 固定液，在4 ℃條件下固定24 h；用移液器吸出固定液后， 加入1 mL 脫色液沖洗蟲體， 去除混合液后，再次加入1 mL 脫色液對(duì)樣品脫色6 h；吸出脫色液， 加入1 mL 37 ℃預(yù)熱的雜交緩沖液（20 mmol·L－1Tris-HCl，0.9 mmol·L－1NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的十二烷基硫酸鈉， 體積分?jǐn)?shù)為30%的甲酰胺）沖洗；去除雜交緩沖液，在黑暗環(huán)境下加入1 μL 含2 種探針（10 nmol·L－1）的雜交緩沖液， 在37 ℃水浴鍋中雜交過夜； 雜交完成后，去除雜交緩沖液，用洗脫緩沖液洗脫2 次；洗脫完成后，去除洗脫緩沖液，用去離子水沖洗樣本，將樣本轉(zhuǎn)移至載玻片。 封片：在樣本上滴加抗熒光猝滅封片劑，并用Kisser’s 封片劑封片。

1.5.2組織解剖樣本FISH。 采用改進(jìn)的FISH 方法對(duì)樣本進(jìn)行染色，具體步驟如下：用無菌濾紙吸去載玻片上樣本周圍多余的PBS 緩沖液，并立即加入200 μL 昆蟲組織固定液固定5 min；用移液器或?yàn)V紙吸除樣本周圍的PBS 緩沖液和固定液，再次加入200 μL 固定液固定30 min，其間不斷加入固定液以避免載玻片干燥；去除固定液，用200 μL 蒸餾水清洗3 次，每次2 min；去除蒸餾水，并立即加入200 μL 脫色液，脫色10 min，重復(fù)此步驟3 次；脫色完成后，將載玻片放入37 ℃烘箱中干燥10 min 以固定組織樣本；在載玻片中加入200 μL 未加探針的雜交緩沖液，預(yù)雜交10～20 min；去除雜交緩沖液，加入200 μL 含2 種探針 （10 nmol·L－1） 的雜交緩沖液， 載玻片置于雜交濕盒中于37 ℃水浴鍋中雜交2 h；雜交完成后，去除雜交緩沖液，用48 ℃預(yù)熱的洗脫緩沖液200 μL 洗脫5 min，吸去洗脫緩沖液，重復(fù)洗脫1 次，時(shí)間20 min；然后用200 μL蒸餾水沖洗樣本去除洗脫緩沖液；在樣本上滴加抗熒光猝滅封片劑，并用Kisser’s 封片劑封片。

1.6 熒光染色觀察

將上述制好的樣本在奧林巴斯FV 1000 激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，日本）下觀察，拍照后用FV10-ASW 看圖軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種共生菌在煙粉虱卵中的定位

煙粉虱卵中共生菌Portiera和Wolbachia的定位結(jié)果（圖1）顯示，在所有被檢測(cè)卵中均能檢測(cè)出Portiera發(fā)出的紅色熒光（圖1A）和Wolbachia發(fā)出的藍(lán)色熒光（圖1B）。同時(shí)可以看出，Portiera集中分布于含菌細(xì)胞內(nèi)，且與Wolbachia共生于含菌細(xì)胞內(nèi)（圖1C～D）。

2.2 2 種共生菌在煙粉虱若蟲及偽蛹中的定位

從若蟲、 偽蛹中2 種共生菌的定位結(jié)果來看， 轉(zhuǎn)染W(wǎng)olbachia的煙粉虱若蟲和偽蛹體內(nèi)均能檢測(cè)出Portiera發(fā)出的紅色熒光（圖1E, I, M,Q）和Wolbachia發(fā)出的藍(lán)色熒光（圖1F, J, N,R），而在不攜帶Wolbachia的煙粉虱4 齡若蟲（圖1U～X） 中僅檢測(cè)出Portiera發(fā)出的紅色熒光，表明Wolbachia已經(jīng)成功在煙粉虱中定植。從圖1 可以看出，煙粉虱若蟲和偽蛹腹部有1 對(duì)由含菌細(xì)胞組成的“腎狀”含菌體，不同齡期的若蟲含菌體內(nèi)含菌細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)不同，與1 齡、2齡的若蟲相比，3 齡若蟲和4 齡若蟲（偽蛹）含菌細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較多；Portiera和Wolbachia共生于這些含菌細(xì)胞中。

圖1 不同蟲態(tài)煙粉虱中內(nèi)生菌Portiera（紅色熒光）和Wolbachia（藍(lán)色熒光）的FISH 結(jié)果Fig. 1 FISH of Portiera (red) and Wolbachia (blue) at different developmental stages of Bemisia tabaci

2.3 2 種共生菌在煙粉虱成蟲中的定位

圖2 為2 種內(nèi)共生菌Portiera和Wolbachia在煙粉虱雌性和雄性成蟲中的定位結(jié)果。 昆蟲共生菌是隨卵進(jìn)行傳播的，因此在煙粉虱雌性成蟲腹部能檢測(cè)出Portiera發(fā)出的紅色熒光 （圖2A,D）及Wolbachia發(fā)出的藍(lán)色熒光（圖2B,E）。 雄性成蟲中Portiera與Wolbachia共生于腹部的含菌細(xì)胞內(nèi)（圖2G～I(xiàn)）。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段的煙粉虱染色效果差異較大，一些發(fā)育較為成熟的煙粉虱雌蟲，卵巢中的卵粒較多，腹部組織較為復(fù)雜，造成染色效果差，從圖2 可以看出煙粉虱成蟲腹部含有2 種共生菌，但難以辨明共生菌所在的具體位置。 雄性成蟲中含菌細(xì)胞與其他組織交錯(cuò)重疊，整蟲熒光原位雜交也難以達(dá)到理想的效果。

圖2 煙粉虱成蟲內(nèi)生菌Portiera（紅色熒光）和Wolbachia（藍(lán)色熒光）的FISH 結(jié)果Fig. 2 FISH of Portiera (red) and Wolbachia (blue) in different female and male adults of Bemisia tabaci

2.4 煙粉虱成蟲腹部組織解剖觀察

在光學(xué)顯微鏡下對(duì)成蟲腹部進(jìn)行解剖，在PBS 緩沖液中可以獲得結(jié)構(gòu)較完整的煙粉虱雌性成蟲卵巢（圖3A），在卵巢附近及卵子基部可以觀察到大量呈暗黃色的球形含菌細(xì)胞。 在操作過程中，含菌細(xì)胞（圖3B 紅色箭頭所示）與卵巢分離，一些接近成熟的卵（圖3B 黑色箭頭所示）也容易從卵巢上脫落。 雄性成蟲多數(shù)內(nèi)共生菌集中分布于含菌細(xì)胞中， 通過解剖獲得1～3 個(gè)完整的含菌細(xì)胞（圖3C 紅色箭頭所示）。

圖3 煙粉虱成蟲腹部解剖光學(xué)顯微觀察Fig. 3 Optical microscopic observation of abdominal anatomy of adult Bemisia tabaci

2.5 雌蟲腹部組織熒光染色觀察

在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過一系列的染色，雌性成蟲卵巢仍能保持相對(duì)完整的形態(tài)， 在卵巢內(nèi)可以觀察到Portiera發(fā)出的紅色熒光及Wolbachia發(fā)出的藍(lán)色熒光（圖4A～B）。 同樣，在含菌細(xì)胞中也可以清楚地觀察到2 種熒光（圖4C～D）。 另外，2 種熒光所在的位置重疊，表明Portiera和Wolbachia在煙粉虱雌性成蟲腹部組織中的分布一致。

圖4 在煙粉虱雌性成蟲卵巢和含菌細(xì)胞中內(nèi)共生菌Portiera（紅色熒光）和Wolbachia（藍(lán)色熒光）的FISH 結(jié)果Fig. 4 FISH of Portiera and Wolbachia in ovary and bacteriocyte of female adults of Bemisia tabaci

2.6 雄蟲含菌細(xì)胞熒光染色觀察

在激光共聚焦顯微鏡下觀察雄蟲含菌細(xì)胞染色結(jié)果，染色后樣本中含菌細(xì)胞的形態(tài)變化不大，仍呈橢圓形。 無論是多個(gè)含菌細(xì)胞（圖5A～B）還是單個(gè)含菌細(xì)胞（圖5C～D）均可以清晰地觀察到Portiera發(fā)出的紅色熒光及Wolbachia發(fā)出的藍(lán)色熒光，2 種熒光所在的位置重疊， 表明Portiera和Wolbachia在煙粉虱雄蟲含菌細(xì)胞中的分布是一致的。

圖5 在煙粉虱雄蟲含菌細(xì)胞中內(nèi)共生菌Portiera （紅色熒光）和Wolbachia（藍(lán)色熒光）的FISH 結(jié)果Fig. 5 FISH of Portiera (red) and Wolbachia (blue) in bacteriocyte of male adults of Bemisia tabaci

3 討論與結(jié)論

Portiera是煙粉虱的初生共生菌， 能為煙粉虱提供生存所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。 本研究結(jié)果表明， 煙粉虱的初生共生菌Portiera集中分布于含菌細(xì)胞中。 這與陳吉強(qiáng)等[23]和Gottlieb 等[16]對(duì)煙粉虱中共生菌定位的研究結(jié)果一致。 另外，在卵巢發(fā)育的卵子中也有Portiera（圖1A），表明Portiera可以通過卵進(jìn)行傳播。

次生共生菌Wolbachia廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物中，由于其能夠引起宿主的胞質(zhì)不親和，而引起研究者的廣泛關(guān)注，Wolbachia在宿主中的分布模式與其發(fā)揮的作用有很大關(guān)系。 朱路雨等[24]對(duì)Wolbachia在皮氏葉螨（Tetranychus piercei）體內(nèi)的定位發(fā)現(xiàn)，Wolbachia在宿主卵母細(xì)胞中分布較均勻， 在中腸以及輸卵管中也有分布。Skaljac 等[17]對(duì)克羅地亞B 型煙粉虱和Gottlieb等[16]對(duì)以色列甘薯中Q 型煙粉虱的研究發(fā)現(xiàn)Wolbachia主要分布于含菌細(xì)胞內(nèi)。而Marubayashi等[19]研究發(fā)現(xiàn)Wolbachia在巴西B 型煙粉虱中有雙重的定位模式： 一種是僅分布于含菌細(xì)胞內(nèi)，屬于限制型分布；另一種在含菌細(xì)胞和其他組織均有分布，屬于分散型分布模式。 在一些煙粉虱隱種（如亞洲Ⅱ7 煙粉虱隱種）個(gè)體中，限制型分布的概率要顯著高于分散型分布[18]。 上述研究結(jié)果表明Wolbachia在不同的煙粉虱隱種體內(nèi)的分布存在差異，即使在同一隱種中的分布也不盡相同。 共生菌的限制型分布模式能很好地解釋共生菌呈嚴(yán)格的母系遺傳，分散型分布模式的發(fā)現(xiàn)引起了人們對(duì)共生菌水平傳播的廣泛關(guān)注[15]。本研究對(duì)外源Wolbachia在B 型煙粉虱中的分布進(jìn)行了定位研究， 結(jié)果顯示W(wǎng)olbachia分布于含菌細(xì)胞內(nèi)， 還存在于雌性個(gè)體的卵巢內(nèi)， 表明Wolbachia可以隨宿主產(chǎn)卵而傳播。

FISH 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)靈敏、無非特異性染色，是昆蟲共生菌定位研究常用的染色技術(shù)。 本研究利用該項(xiàng)技術(shù)對(duì)煙粉虱不同發(fā)育階段的卵、若蟲及成蟲的熒光染色觀察結(jié)果表明， 利用整蟲進(jìn)行FISH 染色能夠清晰地觀察到2 種共生菌在煙粉虱卵和若蟲中的分布位置，而對(duì)成蟲的染色效果不理想，這可能是由于成蟲腹部組織復(fù)雜，探針難以穿透造成的。 對(duì)這類昆蟲組織進(jìn)行冷凍或石蠟切片后再進(jìn)行FISH， 是一種可行的染色方法[14,24]，但操作比較繁瑣，染色過程耗時(shí)較長。 本研究提供了一種適合煙粉虱組織內(nèi)共生菌熒光染色的方法和流程，利用該方法在煙粉虱卵巢和含菌細(xì)胞中檢測(cè)到較強(qiáng)的Portiera和Wolbachia熒光信號(hào)。 使用該方法對(duì)昆蟲組織染色具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先，熒光染色前只需在顯微鏡下解剖昆蟲，獲得卵巢組織后在載玻片上可直接進(jìn)行FISH 染色， 整個(gè)過程無需冷凍和切片，操作簡(jiǎn)便，可將所需時(shí)間壓縮至幾小時(shí)，極大縮短操作時(shí)間；其次，該方法是在載玻片上對(duì)昆蟲組織進(jìn)行染色， 固定脫色處理結(jié)束后，經(jīng)37 ℃短時(shí)間烘干即可將組織樣本固定在載玻片上， 在后續(xù)操作過程中未見樣品脫落的情況，避免了冷凍切片容易脫片的問題。

了解共生菌在煙粉虱體內(nèi)的分布以及在宿主不同發(fā)育階段的變化，是研究共生菌與宿主互作的基礎(chǔ)。 本研究以Wolbachia感染的煙粉虱種群為研究對(duì)象，對(duì)不同發(fā)育階段的煙粉虱整蟲及成蟲解剖組織樣本進(jìn)行了FISH， 明確了外源Wolbachia在煙粉虱宿主中的分布情況， 為進(jìn)一步研究Wolbachia與煙粉虱互作打下基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究優(yōu)化得到操作相對(duì)簡(jiǎn)單的煙粉虱組織熒光染色方法，可為其他昆蟲組織中共生菌的分布及定位觀察提供借鑒。