輪狀病毒性腸炎患兒腸道菌群與病情程度、腸道黏膜屏障功能及體液免疫的相關(guān)性

陳國琴,王麗麗

陳國琴,王麗麗,浙江省玉環(huán)市第二人民醫(yī)院兒科 浙江省玉環(huán)市 317299

0 引言

輪狀病毒性腸炎(rotavirus enteritis,RVE)具有起病急驟、病情進(jìn)展迅速等特點(diǎn),多發(fā)于冬春季節(jié),流行病學(xué)調(diào)查顯示,全世界范圍內(nèi)約1.25億嬰幼兒感染輪狀病毒,不僅會誘發(fā)電解質(zhì)紊亂、酸中毒等并發(fā)癥,還能導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)、呼吸道損害,嚴(yán)重時危及患兒生命安全.目前,國外有研究表明,腸道菌群組成的微小變化不會影響RVE患兒DSS結(jié)腸炎易感性.國內(nèi)相關(guān)報道則指出,腸道雙歧桿菌、大腸桿菌及乳酸桿菌等腸道正常微生物菌群紊亂是RVE主要發(fā)病機(jī)制之一.說明腸道菌群在RVE中的機(jī)制尚未得到完全統(tǒng)一.另外,腸道黏膜屏障功能障礙、免疫功能紊亂在多種腸炎發(fā)病中的作用也越來越受到重視.但關(guān)于RVE患兒腸道菌群與病情程度、腸道黏膜屏障功能、體液免疫之間的關(guān)系仍缺乏大量循證依據(jù),故本研究對此進(jìn)行探討,旨在為臨床判斷病情程度、制定針對性治療方案提供數(shù)據(jù)支持.報告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 選取我院2019-01/2021-05 RVE患兒131例,根據(jù)病情程度分為輕癥組(39例)、中癥組(58例)、重癥組(34例).3組年齡、性別、病程、體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義,有可比性,見表1.本研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過,批號:QR58689.

表1 3組一般資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn):大便均呈蛋花湯樣或水樣,每天數(shù)次至數(shù)十次;均經(jīng)糞便輪狀病毒抗原檢測呈陽性,糞便細(xì)菌培養(yǎng)呈陰性,符合《兒科學(xué)》中輪狀病毒性腸炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及病情程度標(biāo)準(zhǔn);患兒監(jiān)護(hù)人均知情本研究,簽訂知情承諾書.

排除標(biāo)準(zhǔn):因寄生蟲感染、細(xì)菌性腸炎、痢疾等其他疾病所致的腹瀉;均為首次確診,參與本研究前未接受RVE相關(guān)治療;伴有嚴(yán)重心肝腎肺等重要臟器功能異常者;存在腸組織解剖結(jié)構(gòu)畸形者;合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、先天性免疫缺陷性疾病者;服用抗生素或益生菌者.

1.2 方法 腸道菌群檢測方法:于患兒入院當(dāng)日采集3 g濕糞便樣本,常規(guī)離心,洗滌,采用Sigma公司的DNA試劑盒提取樣本中細(xì)菌總DNA,將糞便細(xì)菌DNA樣本與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品,對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行5次以上的連續(xù)梯度稀釋,之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),乳桿菌、雙歧桿菌和大腸埃希菌引物序列分別為:F:5’-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’,R:5’-CACCGCTACACATGGAG-3’;F:5’-TCGCGTC(C/T)GGTGTGAAAG-3’,R:5’-CCACATCCAGC(A/G)TCCAC-3’;F:5’-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3’,R:5’-ACCAGGGTATCTTAATCCTGTT-3’,靶基因?yàn)?6S rDNA,經(jīng)系統(tǒng)軟件自動計算出Ct值,繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定乳桿菌、雙歧桿菌和大腸埃希菌的拷貝數(shù).腸道菌群失調(diào)分級參考文獻(xiàn)制定:糞便菌群總數(shù)及分布比例輕度改變,革蘭陰性桿菌數(shù)量增加,革蘭陽性桿菌數(shù)量減少,革蘭陽性球菌有所增加或正常,酵母菌、梭菌比例呈輕度增加為1級;糞便菌群數(shù)量、分布比例有明顯變化,革蘭陰性桿菌數(shù)量增加,革蘭陽性桿菌數(shù)量減少,革蘭陽性球菌增加,桿菌、球菌比例紊亂或倒置,酵母菌、梭菌數(shù)量明顯增加為2級;糞便細(xì)菌總數(shù)明顯減少,菌群比例紊亂,真菌或細(xì)菌為占優(yōu)勢,少數(shù)菌群轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢菌群為3級.分級越高,表示腸道菌群失調(diào)越嚴(yán)重.

血清指標(biāo)檢測方法:于患兒入院當(dāng)日抽取清晨空腹靜脈血3 mL,離心處理,離心半徑為13.5 cm,離心速率為3000 r/min,離心時間為10 min,取上清液,保存于-70 ℃恒溫冰箱內(nèi),待檢.采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清D-乳酸(D-lactic acid,D-LA)、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)水平,試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,鱟試劑偶氮顯色基質(zhì)法檢測血清內(nèi)毒素(endotoxin,ET)水平,試劑盒購自廈門市鱟試劑公司,所有操作遵循試劑盒說明書.

1.3 觀察指標(biāo) (1)3組腸道菌群數(shù)量分布情況,包括乳桿菌、雙歧桿菌和大腸埃希菌數(shù)量;(2)3組腸道菌群失調(diào)分級分布情況;(3)腸道菌群數(shù)量、失調(diào)分級與病情程度的關(guān)系;(4)不同腸道菌群失調(diào)分級患兒腸道黏膜屏障功能指標(biāo)血清D-LA、DAO、ET水平;(5)不同腸道菌群失調(diào)分級患兒體液免疫指標(biāo)血清IgA、IgG、IgM水平;(6)血清D-LA、DAO、ET、IgA、IgG、IgM與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性.

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0處理數(shù)據(jù),計量資料采取Bartlett方差齊性檢驗(yàn)與夏皮羅-威爾克正態(tài)性檢驗(yàn),均確認(rèn)具備方差齊性且服從正態(tài)分布,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)描述,多組間比較采用單因素方差分析,采用檢驗(yàn),進(jìn)一步兩兩組間比較采用LSD-檢驗(yàn),兩組間比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn);計數(shù)資料用(%)表示,檢驗(yàn),等級資料用表示,Ridit檢驗(yàn);相關(guān)性采用Spearman相關(guān)系數(shù)模型分析.＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 3組腸道菌群數(shù)量分布情況 單因素方差分析,3組雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05);重癥組雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量低于中癥組、輕癥組,中癥組低于輕癥組,重癥組大腸埃希菌數(shù)量高于中癥組、輕癥組,中癥組高于輕癥組(＜0.05),見表2.

表2 3組腸道菌群數(shù)量分布情況比較(mean±SD,lgCFU/g)

2.2 3組腸道菌群失調(diào)分級分布情況 Ridit檢驗(yàn)分析,重癥組腸道菌群失調(diào)分級高于中癥組、輕癥組,中癥組高于輕癥組(＜0.05),見表3.

表3 3組腸道菌群失調(diào)分級分布情況比較n(%)

2.3 腸道菌群數(shù)量、失調(diào)分級與病情程度的關(guān)系 Spearman相關(guān)性分析,腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量與病情程度呈負(fù)相關(guān),腸道大腸埃希菌數(shù)量、菌群失調(diào)分級與病情程度呈正相關(guān)(=-0.727、-0.734、0.757、0.748,均＜0.05),見圖1.

圖1 腸道菌群數(shù)量、失調(diào)分級與病情程度的關(guān)系.A:雙歧桿菌與RVE病情程度的關(guān)系;B:乳酸桿菌與RVE病情程度的關(guān)系;C:大腸埃希菌與RVE病情程度的關(guān)系;D:菌群失調(diào)分級與RVE病情程度的關(guān)系;病情程度賦值:輕癥=1,中癥=2,重癥=3;腸道菌群失調(diào)分級賦值:1級=1,2級=2,3級=3.RVE:輪狀病毒性腸炎.

2.4 不同腸道菌群失調(diào)分級患兒腸道黏膜屏障功能指標(biāo)水平 單因素方差分析,不同腸道菌群失調(diào)分級患兒血清D-LA、DAO、ET差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05);隨著腸道菌群失調(diào)分級增加,血清D-LA、DAO、ET呈不斷升高趨勢(＜0.05),見表4.

表4 不同腸道菌群失調(diào)分級患兒腸道黏膜屏障功能指標(biāo)水平比較(mean±SD)

2.5 不同腸道菌群失調(diào)分級患兒體液免疫指標(biāo)水平 單因素方差分析,不同腸道菌群失調(diào)分級患兒血清IgA、IgG、IgM差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05);隨著腸道菌群失調(diào)分級增加,血清IgA、IgG、IgM呈不斷降低趨勢(＜0.05),見表5.

表5 不同腸道菌群失調(diào)分級患兒體液免疫指標(biāo)水平比較(mean±SD,g/L)

2.6 腸道黏膜屏障功能、體液免疫指標(biāo)與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析,血清D-LA、DAO、ET與腸道菌群失調(diào)分級呈正相關(guān),血清IgA、IgG、IgM與腸道菌群失調(diào)分級呈負(fù)相關(guān)(=0.752、0.717、0.748、-0.715、-0.703、-0.787,均＜0.05),見圖2.

圖2 腸道黏膜屏障功能、體液免疫指標(biāo)與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性.A:血清D-LA與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性;B:血清DAO與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性;C:血清ET與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性;D:血清IgA與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性;E:血清IgG與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性;F:血清IgM與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性;腸道菌群失調(diào)分級賦值:1級=1,2級=2,3級=3.D-LA:D-乳酸;DAO:二胺氧化酶;ET:內(nèi)毒素;IgA:免疫球蛋白A;IgG:免疫球蛋白G;IgM:免疫球蛋白M.

3 討論

RVE是臨床常見兒科腸道感染性疾病,發(fā)生率僅次于呼吸道感染,主要經(jīng)由糞口與呼吸道傳播,會出現(xiàn)不同程度腹瀉、發(fā)熱等臨床癥狀,危害兒童身心健康.相關(guān)研究表明,隨著RVE病情不斷進(jìn)展,可能引起全身性感染,對機(jī)體呼吸、循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重不利影響,若未得到及時有效救治,則會顯著增加預(yù)后不良及死亡風(fēng)險.因此,積極探索病情進(jìn)展相關(guān)機(jī)制對采取針對性治療方案改善預(yù)后至關(guān)重要.(=-0.727、-0.734、0.757、0.748,均＜0.05);血清D-LA、DAO、ET與腸道菌群失調(diào)分級呈正相關(guān),血清IgA、IgG、IgM與腸道菌群失調(diào)分級呈負(fù)相關(guān)(=0.752、0.717、0.748、-0.715、-0.703、-0.787,均＜0.05).

腸道菌群是維持腸道系統(tǒng)功能的重要物質(zhì),大量臨床實(shí)踐證實(shí),腸道菌群紊亂在RVE發(fā)病與病情進(jìn)展過程中扮演著關(guān)鍵角色.正常情況下,腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌處于動態(tài)平衡狀態(tài),其中雙歧桿菌、乳酸桿菌為益生菌,雙歧桿菌可提高機(jī)體對鈣、磷、維生素D的吸收,具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育完善等作用;乳酸桿菌能抑制各種病原菌黏附于腸道上皮細(xì)胞,抑制毒素增殖;大腸埃希菌屬于致病菌,在發(fā)生腸道相關(guān)感染疾病時數(shù)量顯著增加,發(fā)揮促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展作用.蔡海芳報道中顯示,RVE患兒治療前雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量顯著減少,大腸埃希菌數(shù)量明顯增加.在此基礎(chǔ)上,本研究發(fā)現(xiàn),腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量與病情程度呈負(fù)相關(guān),腸道大腸埃希菌數(shù)量、菌群失調(diào)分級與病情程度呈正相關(guān),說明腸道菌群數(shù)量改變、失調(diào)分級與RVE病情程度聯(lián)系緊密.原因在于以下方面:在RVE發(fā)生時,RV侵襲機(jī)體腸微絨毛柱狀上皮細(xì)胞,導(dǎo)致其出現(xiàn)空泡變性、壞死,引發(fā)吸收障礙、腹瀉,還會造成雙糖酶活性受到抑制、分泌量明顯減少,無法正常分解乳糖,導(dǎo)致腸腔滲透液增高、滲透性腹瀉,破壞腸道厭氧環(huán)境,形成利于需氧菌繁殖的內(nèi)環(huán)境,從而致使雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量減少,大腸埃希菌數(shù)量增加,且隨著病情進(jìn)展這種改變會逐漸加重腸道菌群失調(diào)分級,而腸道菌群失調(diào)加重又會促進(jìn)病情進(jìn)展,最終形成惡性循環(huán).因此,腸道菌群數(shù)量改變、失調(diào)分級會對RVE病情程度產(chǎn)生明顯影響,臨床需給予重視.

腸黏膜表面形成的腸道黏膜屏障是保障腸道菌群維持動態(tài)平衡的重要環(huán)節(jié).本研究結(jié)果顯示,隨著腸道菌群失調(diào)分級增加,血清D-LA、DAO、ET呈不斷升高趨勢,與腸道菌群失調(diào)分級呈正相關(guān),其中血清D-LA、DAO、ET是評估腸道黏膜屏障功能的主要指標(biāo),水平異常升高提示腸道黏膜屏障損傷.本研究產(chǎn)生上述結(jié)果的原因結(jié)合Martens等報道考慮是由于腸道菌群遭到破壞,便會增加腸道黏膜通透性,導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損、大量腸液分泌,進(jìn)一步加重腸道菌群紊亂.此外,RVE患兒常伴有免疫功能受損,急性期常表現(xiàn)為體液免疫低下,呈現(xiàn)明顯免疫抑制.血清IgA、IgG、IgM是反映機(jī)體體液免疫情況的指標(biāo),均屬于抗感染抗體,在機(jī)體內(nèi)有害代謝物質(zhì)增加時,其表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢.本研究發(fā)現(xiàn),血清IgA、IgG、IgM與腸道菌群失調(diào)分級呈負(fù)相關(guān),主要是因?yàn)闄C(jī)體受到RVE病毒侵襲后,腸道菌群中的致病菌大量增加,免疫球蛋白為抵抗致病菌過度消耗,導(dǎo)致其轉(zhuǎn)換功能減弱、合成速度減緩、含量明顯減少.

由上述研究結(jié)果可知,糾正腸道菌群紊亂、修復(fù)腸道黏膜屏障、增強(qiáng)機(jī)體體液免疫功能有望成為治療RVE患兒的重要途徑,可給予益生菌、腸道黏膜保護(hù)劑、免疫球蛋白聯(lián)合治療,為提高治療效果、促進(jìn)病情改善創(chuàng)造有利條件.本研究局限性在于:未詳細(xì)探討益生菌、腸道黏膜保護(hù)劑、免疫球蛋白聯(lián)合治療RVE患兒的臨床療效,今后應(yīng)繼續(xù)收集病例,做進(jìn)一步分析,以獲取更為全面的數(shù)據(jù)支持.

4 結(jié)論

綜上可知,輪狀病毒性腸炎患兒腸道菌群數(shù)量、失調(diào)分級與病情程度顯著相關(guān),在腸道黏膜屏障功能障礙、體液免疫紊亂中發(fā)揮重要作用,為臨床制定治療方案提供借鑒依據(jù).

輪狀病毒性腸炎(rotavirus enteritis,RVE)是嬰幼兒發(fā)病率較高的疾病之一,具有較大危害性,是導(dǎo)致兒童營養(yǎng)不良和死亡的重要原因之一.目前認(rèn)為腸道菌群紊亂能加快RVE發(fā)生,但關(guān)于腸道菌群對RVE患兒病情程度、體液免疫的影響的驗(yàn)證數(shù)據(jù)尚少.

關(guān)于腸道菌群與RVE患兒病情程度、腸道黏膜屏障功能、體液免疫之間的關(guān)系驗(yàn)證數(shù)據(jù)尚少,本研究以此為目標(biāo)入手,通過觀察不同病情程度RVE患兒腸道菌群數(shù)量、菌群失調(diào)分級分析腸道菌群與RVE患兒病情程度的關(guān)系,還通過觀察不同腸道菌群失調(diào)分級患兒腸道黏膜屏障功能、體液免疫指標(biāo)水平分析腸道菌群與腸道黏膜屏障功能、體液免疫的關(guān)系,為臨床提供數(shù)據(jù)支持.

觀察腸道菌群與RVE患兒病情程度、腸道黏膜屏障功能、體液免疫之間的關(guān)系.

連續(xù)納入我院2019-01/2021-05 RVE患兒131例,根據(jù)病情程度分為輕癥組(39例)、中癥組(58例)、重癥組(34例),進(jìn)行前瞻性研究.收集比較3組腸道菌群數(shù)量與失調(diào)分級分布情況,采用Spearman相關(guān)性分析腸道菌群數(shù)量、失調(diào)分級與病情程度的關(guān)系,對比不同腸道菌群失調(diào)分級患兒腸道黏膜屏障功能指標(biāo)[血清D-乳酸(D-lactic acid,D-LA)、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、內(nèi)毒素(endotoxin,ET)]、體液免疫指標(biāo)[血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)]水平,采用Spearman相關(guān)性分析腸道黏膜屏障功能、體液免疫與腸道菌群失調(diào)分級的相關(guān)性,應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析.

腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量與病情程度呈負(fù)相關(guān),腸道大腸埃希菌數(shù)量、菌群失調(diào)分級與病情程度呈正相關(guān)(均＜0.05);血清D-LA、DAO、ET與腸道菌群失調(diào)分級呈正相關(guān),血清IgA、IgG、IgM與腸道菌群失調(diào)分級呈負(fù)相關(guān)(均＜0.05).

輪狀病毒性腸炎患兒腸道菌群數(shù)量、失調(diào)分級與病情程度、腸道黏膜屏障功能障礙、體液免疫紊亂顯著相關(guān),在其疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用.

隨著腸道菌群紊亂在輪狀病毒性腸炎中的作用機(jī)制逐漸明確,臨床可通過檢測腸道菌群具體細(xì)菌種類數(shù)量、菌群失調(diào)分級為采取合理、適量的益生菌類藥物提供可靠依據(jù),意味著輪狀病毒性腸炎患兒的治療得到進(jìn)一步改善,也預(yù)示著安全、高效治愈輪狀病毒性腸炎是可以輕松實(shí)現(xiàn)的.