微小RNA-151a-3p及Notch2在結(jié)腸癌的表達及臨床意義

徐鎮(zhèn)錢,趙嗣鈺

徐鎮(zhèn)錢,臺州市腫瘤醫(yī)院腫瘤放療科 浙江省臺州市 317502

趙嗣鈺,臺州市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 浙江省臺州市 317502

0 引言

結(jié)腸癌(colon cancer,CC)是臨床常見惡性腫瘤,近年來我國CC患病率呈逐漸升高趨勢,嚴重威脅人們生命健康,加強防治非常重要.臨床上越來越多的研究關注分子改變對CC的影響,有研究指出微小RNA在CC的發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)控作用.微小RNA-151a-3p(microRNA-151a,miR-151a)基因定位于染色體8q24.3,包括miR-151a-3p和miR-151a-5p兩條成熟序列.國外有學者于胰腺癌組織中發(fā)現(xiàn)微小RNA-151a-3p(microRNA-151a-3p,miR-151a-3p)明顯高表達.國內(nèi)相關研究在前列腺癌細胞中也發(fā)現(xiàn)miR-151a-3p表達發(fā)生明顯異常.但miR-151a-3p在CC中的表達情況如何,目前尚無研究報道.此外,研究指出Notch信號通路是一種進化上保守的細胞信號通路,它對癌癥發(fā)生、癌癥干細胞生物學和腫瘤血管生成產(chǎn)生影響,其中Notch2表達與結(jié)直腸癌密切相關,抑制Notch2表達可能在腫瘤抑制中發(fā)揮作用.基于此,本研究嘗試探討miR-151a-3p及Notch2在CC中的表達情況及臨床意義.報告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 收集2018-01/2020-06我院92例CC患者作為研究對象,均取術中切除的癌組織與癌旁組織(距癌邊緣＞2.0 cm,且病理結(jié)果顯示無癌細胞)標本.所有患者均經(jīng)過組織病理學檢查確診為結(jié)腸癌.其中男53例,女39例;年齡47-78歲,平均(58.79±5.89)歲.收集所有患者臨床病理參數(shù),腫瘤直徑:≤5 cm 37例,＞5 cm 55例;腫瘤部位:左半結(jié)腸49例,右半結(jié)腸43例;病理類型:腺癌62例,其他30例;腫瘤分期:Ⅰ-Ⅱ期40例,Ⅲ-Ⅳ期52例;浸潤深度:T1-T2 43例,T3-T4 49例;分化程度:中高分化51例,低分化41例;52例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.所有患者均參照《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017年版)》中相關標準診斷為CC,并經(jīng)術后病理組織學診斷確診,均為首次確診,且術前均未接受放、化療等抗腫瘤治療.本研究獲得本院醫(yī)院倫理委員會批準開展,且在獲取標本前均患者均知情同意并簽署同意書.手術外科切除過程必須在30 min內(nèi)收集相對應的標本,并迅速置于液氮凍存?zhèn)溆?

1.2 方法 RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo scientific公司;BX51光學顯微鏡購自于日本奧林巴斯公司;ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司;miR-151a-3p引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司;內(nèi)參U6購自美國Invitrogen;Notch2一抗、二抗均購自德國CST公司.

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測組織標本中miR-151a-3p的表達 采用組織研磨法提取組織中總RNA,在無酶的操作條件下加入焦炭酸二乙酯,測量RNA濃度后,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后采用熒光定量PCR試劑盒,按照說明書要求進行qRT-PCR.反應體系:總RNA 2 μL,2×One Step RT-PCR BufferⅢ 12.5 μL,TaKaRa Ex Taq HS(5 U/μL)0.5 μL,Prime Script RT enzyme MixⅡ0.5 μL,上下游引物各0.5 μL.miR-151a-3p上游引物5'-AGGAGCTCACAGTCTAGTATGTCT-3',下游引物5'-CTACTGGCCTGGAGGGTTTGG-3'.反應條件:反轉(zhuǎn)錄反應,42 ℃,5min、95 ℃ 10 s,95 ℃5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán).以U6為內(nèi)參檢測,應用公式2計算miR-151a-3p相對表達水平.

1.4 Western blot法檢測組織標本中Notch2蛋白的表達

組織標本中加入細胞裂解液,提取總蛋白,采用BCA法檢測蛋白濃度,將50 μg蛋白在SDS-PAGE凝膠上電泳并分離,將分離后的蛋白分子轉(zhuǎn)至PVDF膜上,于低速搖床上用含脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h.加入Notch2一抗(1:1000),4 ℃過夜孵育.加入Notch2二抗(1:3000)孵育2 h.用ECL發(fā)光液在顯影儀中進行目的蛋白顯影并保存圖片.分析條帶灰度,以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值表示Notch2蛋白相對表達量.

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件,計數(shù)資料以例數(shù)描述,采用檢驗.計量資料采取Bartlett方差齊性檢驗與Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗,均確認具備方差齊性且服從正態(tài)分布,以mean±SD描述,采用獨立樣本檢驗.癌組織中miR-151a-3p與Notch2蛋白表達量的相關性采用Pearson相關性分析.miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量與CC臨床病理特征的關系用檢驗.＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量比較 癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量均顯著高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.001),見表1.Notch2蛋白電泳圖,見圖1.

圖1 Notch2蛋白電泳圖.A:癌組織中Notch2蛋白表達情況;B:癌旁組織中Notch2蛋白表達情況.

表1 癌組織、癌旁組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量比較(mean±SD)

2.2 癌組織中miR-151a-3p與Notch2蛋白表達量的相關性 經(jīng)Pearson相關性分析顯示,CC癌組織中miR-151a-3p表達量與Notch2蛋白表達量間存在正相關關系(=0.592,＜0.05),見圖2.

圖2 miR-151a-3p與Notch2蛋白表達量的相關性.

2.3 患者臨床特征與癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量的關系 不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、病理類型CC患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義;腫瘤分期、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不同CC患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05),見表2.經(jīng)Spearman相關性分析顯示,CC患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量與腫瘤分期(=0.752、0.539)、浸潤深度(=0.592、0.391)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(=0.791、0.563)間存在正相關關系,與分化程度(=-0.680、-0.463)間存在負相關關系(均＜0.05).

表2 不同臨床特征患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量比較(mean±SD)

3 討論

CC是一種發(fā)病機制非常復雜的惡性腫瘤,已知有多種致瘤途徑均可導致CC的發(fā)生發(fā)展.腫瘤細胞的侵襲和遷移等惡性生物學行為是CC致死的主要原因,但其機制仍未明確,而從分子水平研究CC惡性生物學行為的影響因素意義深遠.

微小RNA是一類長21-25個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA,其表達變化不僅能調(diào)節(jié)基因沉默和癌癥惡化過程,同時能影響細胞功能,如惡性轉(zhuǎn)化、血管生成、細胞生長、炎癥反應等.其中miR-151a-3p是一種多功能微小RNA,能調(diào)控骨質(zhì)疏松、狼瘡性腎炎的發(fā)生發(fā)展,且與急性腦梗死患者的炎性因子聯(lián)系緊密.Liu等開展的一項體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn),miR-151a-3p對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲具有促進作用,下調(diào)其蛋白表達可抑制腫瘤進展.湯杰等研究也證實,在胰腺癌細胞中過表達的miR-151a-3p能促進胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲,且能抑制細胞凋亡.推測miR-151a-3p可能是一種促癌基因,但目前miR-151a-3p在結(jié)腸癌的表達及其作用尚未見報道.本研究在CC癌組織中同樣發(fā)現(xiàn)miR-151a-3p表達量顯著升高,提示miR-151a-3p表達水平升高可能促進CC的發(fā)生.但其具體作用機制尚未明確.

文獻報道顯示,Notch信號通路被認為在多種癌癥中發(fā)揮作用,是調(diào)節(jié)正常腸黏膜的細胞譜系分化的必要條件,Notch受體中Notch2具有促進腫瘤細胞增殖的作用,且能降低腫瘤細胞對化療的敏感性.目前,Notch2在CC發(fā)生發(fā)展中的機制逐漸被發(fā)現(xiàn),Lin等報道指出,Notch2抑制了GATA3介導的結(jié)直腸癌細胞中IL-4的分泌,并最終抑制了M2樣TAM極化.王艷良等研究發(fā)現(xiàn),通過抑制Notch2表達,可降低CC SW480細胞增殖、遷移和侵襲能力.上述研究均表明Notch2可能是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要因子.本研究結(jié)果顯示,CC患者癌組織中Notch2蛋白表達量顯著高于癌旁組織,說明Notch2蛋白表達可能促進CC的發(fā)生.此外,本研究通過相關性分析,發(fā)現(xiàn)CC患者癌組織中miR-151a-3p表達量與Notch2蛋白表達量間存在正相關關系,提示miR-151a-3p可能通過正向調(diào)控Notch2蛋白參與CC的發(fā)生過程.

為進一步探究miR-151a-3p、Notch2在CC進展中的作用機制,本研究對比分析了不同臨床特征CC患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量,結(jié)果顯示,CC患者腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量呈正相關,分化程度與癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量呈負相關,提示miR-151a-3p、Notch2表達增高可能是結(jié)腸癌組織發(fā)生轉(zhuǎn)移和浸潤的重要因子.因此,我們推測通過抑制miR-151a-3p、Notch2的表達可對CC惡性生物學行為進行抑制,將來可能成為CC防治的新途徑.但由于本研究屬于初步研究,未進行相關的細胞學研究觀察,在下一步的研究中我們將開展相關研究進行探討.

4 結(jié)論

綜上可知,CC癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白的表達升高,且二者在CC癌組織中的表達量呈正相關,miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量的升高可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關系,可為CC的發(fā)病機制及臨床診斷提供參考依據(jù).但本研究屬于單中心研究,存在樣本量較少的不足,研究結(jié)果可能存在一定誤差,仍需通過大樣本研究進一步驗證.

據(jù)統(tǒng)計,全球每年約有100萬人被診斷為結(jié)腸癌,探究結(jié)腸癌的發(fā)病機制,尋找新的診斷指標及治療方法是其治療關鍵.RNA在其發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)控作用,Notch2表達與結(jié)直腸癌密切相關,抑制其表達可能在腫瘤抑制中發(fā)揮作用.

本研究嘗試探討miR-151a-3p及Notch2在結(jié)腸癌中的表達情況及臨床意義,為探討結(jié)腸癌發(fā)病機制提供參考依據(jù).

本研究探究微小RNA-151a-3p及Notch2在結(jié)腸癌的表達情況及臨床意義,找出RNA-151a-3p及Notch2與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關系.

選取2018-01/2020-06我院92例結(jié)腸癌患者作為研究對象,均取術中切除的癌組織與癌旁組織(距癌邊緣＞2.0 cm,且病理結(jié)果顯示無癌細胞)標本,檢測比較癌組織與癌旁組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量,分析癌組織中miR-151a-3p與Notch2蛋白表達量的相關性,并比較不同臨床特征(性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、病理類型、腫瘤分期、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量,分析miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量與結(jié)腸癌臨床特征的關系.

結(jié)腸癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量均高于癌旁組織(＜0.001);癌組織中miR-151a-3p表達量與Notch2蛋白表達量呈正相關(＜0.001);隨著結(jié)腸癌患者腫瘤分期和浸潤深度增加、分化程度降低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量逐漸升高(＜0.05);癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量與結(jié)腸癌患者腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關,與分化程度呈負相關(＜0.05).

miR-151a-3p、Notch2蛋白在結(jié)腸癌癌組織中表達明顯增加,且二者之間的表達呈正相關關系,其過表達可參與了結(jié)腸癌疾病的發(fā)生發(fā)展.

miR-151a-3p、Notch2在結(jié)腸癌癌組織中的表達量呈正相關,miR-151a-3p、Notch2蛋白表達量的升高可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關系,可為結(jié)腸癌的發(fā)病機制及臨床診斷提供參考依據(jù),但本研究屬于單中心研究,存在樣本量較少的不足,研究結(jié)果可能存在一定誤差,仍需通過大樣本研究進一步驗證.