祛白片正丁醇部位對(duì)脫黑色素細(xì)胞模型的藥效學(xué)研究

段松冷 顧紅燕 年宏蕾 邢若 曾蔚欣

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）09-1049-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.09.05

摘 要 目的 研究祛白片正丁醇部位的化學(xué)成分，以及其對(duì)脫黑色素細(xì)胞模型的藥效作用。方法 制備祛白片正丁醇部位。采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）技術(shù)分析其化學(xué)成分。以小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，建立脫黑色素細(xì)胞模型后分為模型組、陽性對(duì)照不同濃度組（8-甲氧補(bǔ)骨脂素10、50、100、150、200 μmol/L）、溶媒組（以DMSO稀釋而得）和祛白片正丁醇部位不同濃度組（10、50、100、150、200 μg/mL），采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量變化，并檢測(cè)細(xì)胞增殖率、促黑色素生成率、酪氨酸酶活性促進(jìn)率。結(jié)果 在正、負(fù)離子模式下初步確定了祛白片正丁醇部位的53個(gè)化合物（正離子模式下29個(gè)，負(fù)離子模式下33個(gè)，重合9個(gè)），其中香豆素類化合物所占比例最大，其次是黃酮類化合物。祛白片正丁醇部位可使細(xì)胞數(shù)明顯增加，且與作用時(shí)間和給藥濃度呈正相關(guān);其可顯著升高細(xì)胞的增殖率、促黑色素生成率、酪氨酸酶活性促進(jìn)率（P<0.01）。結(jié)論 香豆素類和黃酮類化合物可能是祛白片正丁醇部位發(fā)揮抗白癜風(fēng)作用的物質(zhì)基礎(chǔ);祛白片正丁醇部位的抗白癜風(fēng)作用可能是通過促進(jìn)酪氨酸酶活性實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 祛白片;正丁醇部位;白癜風(fēng);超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;黑色素;酪氨酸酶

n-butanol part from Qubai tablet and study on its pharmacodynamics to de melanocyte model

DUAN Songleng1，2，GU Hongyan1，2，NIAN Honglei1，2，XING Ruo1，2，ZENG Weixin1，2（1. Dept. of Pharmacy， Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100038， China; 2. Beijing Key Laboratory of Evaluation of Rational Drug Use， Beijing 100038， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To study the chemical constituents of n-butanol part of Qubai tablet and its pharmacodynamic effect on the model of de melanocyte. METHODS The n-butanol part of Qubai tablet was prepared. The chemical constituents were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS）. Taking mice B16 melanoma cells as the research object， the de melanocyte model was established and divided into model group， positive control different concentration groups （8-methoxypsoralen 10， 50， 100， 150， 200 μmol/L）， solvent group （diluted with DMSO） and Qubai tablet n-butanol part different concentration groups （10， 50， 100， 150， 200 μmol/L）. The number of cells were observed by inverted microscope， and the cell proliferation rate， the rate of melanin production and promotion rate of tyrosinase activity were also detected. RESULTS In the positive and negative ion mode， 53 compounds in the n-butanol part of Qubai tablet were preliminarily determined （29 in the positive ion mode， 33 in the negative ion mode， overlapping 9）， of which coumarins accounted for the largest proportion， followed by flavonoids. The n-butanol part of Qubai tablet could significantly increase the number of cells， which was positively correlated with the action time and administration concentration. It could significantly increase the proliferation rate of cells， the rate of melanin production and promotion rate of tyrosinase activity （P<0.01）. CONCLUSIONS Coumarins and flavonoids may be the material basis for the anti-vitiligo effect of n-butanol part from Qubai tablet; anti-vitiligo effect of n-butanol part of Qubai tablet may be realized by promoting tyrosinase activity.

KEYWORDS ? Qubai tablet; n-butanol part; vitiligo; UPLC- MS; melanin; tyrosinase

醫(yī)院制劑祛白片（京藥制字Z20063383）因療效好、患者需求大，一直是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥學(xué)研發(fā)團(tuán)隊(duì)研究的重點(diǎn)[1-2]。為使更多的白癜風(fēng)患者受益，醫(yī)院擬將祛白片進(jìn)行成果轉(zhuǎn)化。本課題組前期研究了祛白片全方、揮發(fā)油和乙酸乙酯部位的初步藥效學(xué)，證實(shí)了這些部位均具有較好的抗白癜風(fēng)作用，且重點(diǎn)分析了揮發(fā)油和乙酸乙酯部位的化學(xué)成分[3-5]。為更全面地解決患者提出的該藥服藥劑量大的問題（說明書中規(guī)定：每次5片，每日3次），本課題組又富集了祛白片正丁醇部位，在前期研究的基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-performance liquid chromatography- mass spectrometer，UPLC-MS）技術(shù)初步確定其化學(xué)成分，并從細(xì)胞數(shù)量、促細(xì)胞活力、促黑色素生成3個(gè)方面研究祛白片正丁醇部位對(duì)脫黑色素細(xì)胞模型的藥效學(xué)，以期為該制劑的進(jìn)一步藥理機(jī)制研究和制備工藝優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Q ExactiveTM型四極桿軌道離子阱質(zhì)譜、DionexTM UltiMateTM 3000型UPLC儀、Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），COIC XDS-1B型顯微鏡（重慶重光實(shí)業(yè)有限公司），RT-TDL-40B型離心機(jī)（無錫市瑞江分析儀器有限公司），YT-CJ-1ND型無菌操作臺(tái)（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司），MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本Panasonic公司）。

1.2 主要藥品與試劑

炒蒺藜、補(bǔ)骨脂、黑芝麻等15味中藥飲片均購自北京金崇光藥業(yè)有限公司，經(jīng)我院藥檢室檢驗(yàn)符合2020年版《中國藥典》（一部）要求[6];8-甲氧補(bǔ)骨脂素（8- ?methoxypsoralen，8-MOP，批號(hào)M3501-1G）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)D2650）、過氧化氫（H2O2，批號(hào)H1009-100）和左旋多巴（L-DOPA，貨號(hào)72816）均購自美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)C11965500BT）購自美國Invitrogen公司;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞（編號(hào)3111C0001CCC000324）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 祛白片正丁醇部位成分的UPLC-MS分析

2.1.1 樣品的制備 取炒蒺藜、補(bǔ)骨脂、黑芝麻等15味中藥飲片，加水煎煮3次，每次1 h，濾過;合并煎液，濃縮，即得祛白片干浸膏。參考文獻(xiàn)[7]方法，取祛白片干浸膏適量，充分溶解于熱水，用等體積正丁醇分3次萃取，合并萃取液，濃縮，即得祛白片正丁醇部位干浸膏。取適量祛白片正丁醇部位干浸膏用甲醇充分溶解，待測(cè)。

2.1.2 UPLC-MS條件 （1）色譜條件：色譜柱為Waters UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動(dòng)相為A相（水，含有0.05%乙酸和1 mmol/L乙酸銨）-B相[異丙醇-乙腈混合液（1 ∶ 1，V/V）]，梯度洗脫（0～3 min，10% B→35% B;3～6 min，35% B→85% B;6～8 min，85% B→100% B;8～11 min，100% B;11～11.1 min，100% B→10% B;11.1～13 min，10% B）;流速為0.3 mL/min，柱溫為50 ℃。（2）質(zhì)譜條件：正、負(fù)離子源電壓分別為3.7、3.5 kV;碰撞氣為氮?dú)?，壓力?.5 mTorr;鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?，鞘氣壓力?0 psi，輔助氣壓力為10 psi;毛細(xì)管加熱溫度為320 ℃;容積加熱蒸發(fā)溫度為300 ℃。一級(jí)全掃描參數(shù)：分辨率為7×105，自動(dòng)增益控制目標(biāo)為3×106，最大隔離時(shí)間為100 ms，質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為50～1 500。本研究進(jìn)行正、負(fù)離子模式下的全掃描檢測(cè)。

2.1.3 UPLC-MS分析及結(jié)果 取“2.1.1”項(xiàng)下祛白片正丁醇部位待測(cè)樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，得正、負(fù)離子模式下祛白片正丁醇部位的總離子流圖，結(jié)果見圖1。將采集好的數(shù)據(jù)用 Progenesis QI軟件處理，依次進(jìn)行原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入、峰對(duì)齊、峰提取、歸一化處理，最后通過m/z、保留時(shí)間、峰強(qiáng)度等信息，在正、負(fù)離子模式下初步確定了祛白片正丁醇部位的53個(gè)化合物（正離子模式下29個(gè)，負(fù)離子模式下33個(gè)，重合9個(gè)），結(jié)果見表1、表2。

2.2 脫黑色素細(xì)胞模型的藥效學(xué)研究

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取0.1 g祛白片正丁醇部位干浸膏，加不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基定容至10 mL，再以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得祛白片正丁醇部位母液，臨用時(shí)稀釋成所需濃度作為供試品溶液。

2.2.2 脫黑色素細(xì)胞模型的建立 參考文獻(xiàn)[8]方法，將小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)基更換為含0.1 mmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，即得脫黑色素細(xì)胞模型。

2.2.3 細(xì)胞數(shù)量觀察 取對(duì)數(shù)生長期小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液（1×104 個(gè)/mL），接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法建立脫黑色素細(xì)胞模型，然后分為模型組、陽性對(duì)照不同濃度組（8-MOP，10、50、100、150、200 μmol/L，以DMSO溶解，濃度根據(jù)文獻(xiàn)[5]設(shè)置，下同）、溶媒組（由于8-MOP以DMSO溶解，故本實(shí)驗(yàn)另設(shè)DMSO溶媒組，即以DMSO稀釋1×104倍）和祛白片正丁醇部位不同濃度組（10、50、100、150、200 μg/mL，質(zhì)量濃度根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]設(shè)置）。模型組細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基，其余各組加入相應(yīng)藥物或溶劑，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后，采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞數(shù)量變化。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，與模型組比較，祛白片正丁醇部位各濃度組細(xì)胞數(shù)均明顯增加，且與作用時(shí)間和給藥濃度呈正相關(guān)。其中，200 μg/mL的祛白片正丁醇部位（作用48 h后）使黑色素細(xì)胞數(shù)量增加最明顯。與溶媒組比較，8-MOP各濃度組細(xì)胞數(shù)也明顯增加，也與作用時(shí)間和給藥濃度呈正相關(guān)。

2.2.4 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的活性。取對(duì)數(shù)生長期小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，按“2.2.3”項(xiàng)下方法接種、造模、分組與給藥，另設(shè)只加培養(yǎng)基、不加細(xì)胞的本底對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后，吸去上清液，加入 CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測(cè)定各孔光密度值（OD），并取平均值，再計(jì)算細(xì)胞增殖率[細(xì)胞增殖率=（OD給藥組-OD本底對(duì)照組）/（OD模型組或溶媒組-OD本底對(duì)照組）×100%[9]]。采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果顯示，與模型組比較，祛白片正丁醇部位各濃度組細(xì)胞增殖率均顯著升高（P<0.01）;與溶媒組比較，8-MOP各濃度組細(xì)胞增殖率均顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見圖3。

2.2.5 促黑色素生成率的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，按“2.2.3”項(xiàng)下方法接種、造模、分組與給藥，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后，棄去上清液，以磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）清洗2次后，加入1 mol/L NaOH溶液（不含DMSO）200 μL，于80 ℃條件下恒溫水浴2 h，待細(xì)胞充分裂解、黑色素顆粒充分溶解后，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測(cè)定各孔OD，并取平均值，再計(jì)算促黑色素生成率[促黑色素生成率=（OD給藥組-OD模型組或溶媒組）/OD模型組或溶媒組×100%]。結(jié)果顯示，與模型組比較，祛白片正丁醇部位各濃度組細(xì)胞促黑色素生成率均顯著升高（P<0.01）;與溶媒組比較，8-MOP各濃度組細(xì)胞促黑色素生成率也顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見圖4。

2.2.6 酪氨酸酶活性促進(jìn)率的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，按“2.2.3”項(xiàng)下方法接種、造模、分組與給藥，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后，棄去培養(yǎng)基，以磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）洗滌2次，每孔加入TritonX-100溶液（1%）90 μL，立即放入-80 ℃冰箱冷凍30 min，取出后室溫融化至細(xì)胞完全破裂，37 ℃預(yù)溫后加入L-DOPA溶液（10 g/L）100 μL，于37 ℃條件下孵育30 min后，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測(cè)各孔OD，并取平均值，再計(jì)算酪氨酸酶活性促進(jìn)率[酪氨酸酶活性促進(jìn)率=（OD給藥組-OD模型組或溶媒組）/OD模型組/溶媒組×100%]。結(jié)果顯示，與模型組比較，祛白片正丁醇部位各濃度組細(xì)胞酪氨酸酶活性促進(jìn)率均顯著升高（P<0.01）;與溶媒組比較，8-MOP各濃度組細(xì)胞酪氨酸酶活性促進(jìn)率也顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見圖5。

3 討論

3.1 中藥有效部位篩選

中藥有效部位指從中藥中提取出的一類或幾類化學(xué)成分的混合物，是發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。通過分離純化除去無效、低效或有毒的成分，來降低服用劑量和毒副作用，是中藥創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)的重要途徑[12-13]。中藥有效部位的研究內(nèi)容為對(duì)中藥或其制劑進(jìn)行系統(tǒng)提取分離，根據(jù)功效采用相應(yīng)藥理學(xué)指標(biāo)建立藥理模型，確定具有活性的部位，同時(shí)采用現(xiàn)代分析手段確定該部位所含化學(xué)成分的類型。中藥有效部位的確定是中藥新藥研究開發(fā)的基礎(chǔ)[14]。近年來，多項(xiàng)國內(nèi)外研究表明，中藥有效部位的提取與篩選，對(duì)揭示中藥多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)及中藥復(fù)方配伍內(nèi)在規(guī)律具有重要意義[15-17]。本文遵循中藥有效部位研究方法，旨在確定祛白片的活性部位，為進(jìn)一步研發(fā)抗白癜風(fēng)藥物奠定基礎(chǔ)。

3.2 祛白片正丁醇部位化學(xué)成分分析

中藥正丁醇部位化學(xué)成分和生物活性一直是近年來中藥化學(xué)研究的熱點(diǎn)[18-20]。本研究利用UPLC-MS技術(shù)，初步確定了祛白片正丁醇部位所含的53個(gè)化合物（正離子模式下29個(gè)，負(fù)離子模式下33個(gè)，重合9個(gè)），并計(jì)算了相對(duì)百分含量。正離子模式下相對(duì)百分含量排名前3位的化合物分別為7-O-（3，3-二甲基烯丙基）-東莨菪素（34.37%）、比克白芷素（18.12%）和黃決明素（8.73%）;負(fù)離子模式下相對(duì)百分含量排名前3位的化合物分別為十六（烷）酸（28.35%）、十八碳酸（27.51%）和柚皮苷（24.12%）。另外，在正、負(fù)離子模式下均檢出的9種化合物分別為苜蓿素、比克白芷素、黃決明素、補(bǔ)骨脂色烯查爾酮、異歐前胡內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素、8-牻牛兒醇基補(bǔ)骨脂素、柳杉醇。在這些成分中，香豆素類化合物所占比例最大，黃酮類化合物次之，這與本課題組前期對(duì)祛白片乙酸乙酯部位化學(xué)成分研究結(jié)果類似[4]。但祛白片正丁醇部位中有7種成分在乙酸乙酯部位中未檢出，分別為辛弗林、苜蓿素、柚皮苷、丹酚酸C、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、苜蓿素和十六（烷）酸。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，香豆素類和黃酮類化合物均具有潛在的抗白癜風(fēng)作用[21-23]，值得進(jìn)一步深入研究。

3.3 脫黑色素模型的藥效學(xué)結(jié)果分析

小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞目前在藥理學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用[24-25]。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞建立脫黑色素細(xì)胞模型，從細(xì)胞數(shù)量、促細(xì)胞活力、促黑色素生成3個(gè)方面，研究了祛白片正丁醇部位的藥效學(xué)。首先，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的數(shù)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，祛白片正丁醇部位可使細(xì)胞數(shù)明顯增加，且增加趨勢(shì)與作用時(shí)間和給藥濃度呈正相關(guān)。其次，研究了祛白片正丁醇部位對(duì)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，祛白片正丁醇部位可顯著提高細(xì)胞的增殖率（P<0.01）。為進(jìn)一步探索祛白片正丁醇部位的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)其對(duì)酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，祛白片正丁醇部位可顯著升高酪氨酸酶活性促進(jìn)率，由此推測(cè)，該部位具有潛在的抗白癜風(fēng)作用，且可能是通過提高酪氨酸酶活性實(shí)現(xiàn)的。結(jié)合本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，祛白片乙酸乙酯部位也具有良好的抗白癜風(fēng)作用，這提示在后續(xù)研究中可優(yōu)化祛白片原有制備工藝，將祛白片水煎液用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取后，合并兩部位制備成制劑，以達(dá)到既保留原有藥效、又減小服用劑量的效果，從而更好地提高患者的依從性。

綜上所述，香豆素類和黃酮類化合物可能是祛白片正丁醇部位發(fā)揮抗白癜風(fēng)作用的物質(zhì)基礎(chǔ);祛白片正丁醇部位的抗白癜風(fēng)作用可能是通過促進(jìn)酪氨酸酶活性實(shí)現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 屠善慶.中藥白癜風(fēng)片治療白癜風(fēng)349例療效觀察[J].北京醫(yī)學(xué)，1991，13（3）：182-183.

[ 2 ] 屠善慶.中藥白癜風(fēng)片與部分外用氮芥酒精治療白癜風(fēng)112例療效觀察[J].鐵道醫(yī)學(xué)，1983，11（4）：232-233.

[ 3 ] 顧紅燕，韋元元，金銳，等.祛白片對(duì)實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)模型的療效學(xué)及其作用機(jī)制探討[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（19）：1741-1746.

[ 4 ] 段松冷，顧紅燕，年宏蕾，等.祛白片乙酸乙酯部位成分分析及其對(duì)小鼠脫黑色素細(xì)胞模型的藥效學(xué)研究[J].中國藥房，2022，33（7）：43-50.

[ 5 ] 顧紅燕，韋元元，盧文超，等.祛白片對(duì)小鼠B16脫黑色素細(xì)胞模型促黑色素生成的影響[J].中成藥，2020，42（7）：1910-1914.

[ 6 ] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：121.

[ 7 ] 高靖.中藥有效部位提取物制備研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（2）：113-114.

[ 8 ] GUAN C P，XU W，HONG W S，et al. Quercetin attenuates the effects of H2O2 on endoplasmic Reticulum morphology and tyrosinase export from the endoplasmic Reticulum in melanocytes[J]. Mol Med Rep，2015，11（6）：4285-4290.

[ 9 ] 李敏，周明偉，劉翔宇，等.復(fù)方倍他米松注射液對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖及黑素生成的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2018，22（7）：1253-1254.

[10] ULLAH S，KANG D W，LEE S，et al. Synthesis of cinnamic amide derivatives and their anti-melanogenic effect in α-MSH-stimulated B16F10 melanoma cells[J]. Eur J Med Chem，2019，161：78-92.

[11] YE Y，CHOU G X，WANG H，et al. Flavonoids，apigenin and icariin exert potent melanogenic activities in murine B16 melanoma cells[J]. Phytomedicine，2010，18（1）：32- 35.

[12] 姜勇，李軍，屠鵬飛.再議新形勢(shì)下中藥創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)與研發(fā)思路[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2017，19（6）：892-899.

[13] 屠鵬飛，姜勇，郭曉宇.新形勢(shì)下中藥創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)與研發(fā)[J].中國中藥雜志，2015，40（17）：3423-3428.

[14] 邵璟，狄留慶，劉產(chǎn)明，等.中藥有效部位新藥研發(fā)中關(guān)鍵問題分析[J].中國新藥雜志，2010，19（2）：98-101.

[15] 張王寧，李愛平，李科，等.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究方法進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，2018，53（10）：761-764.

[16] 王長福，徐嘉智，王思宇，等.六神曲抗菌有效部位化學(xué)成分研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2020，31（10）：2350-2353.

[17] HEIDARI-BENI M，MORAVEJOLAHKAMI A R，GORGIAN P，et al. Herbal formulation “turmeric extract，black pepper，and ginger” versus Naproxen for chronic knee osteoarthritis：a randomized，double-blind，controlled clinical trial[J]. Phytother Res，2020，34（8）：2067-2073.

[18] 趙青群，付輝政，林凱鵬，等.鮮竹瀝正丁醇部位化學(xué)成分研究[J].中草藥，2021，52（7）：1891-1897.

[19] 曹海娟，方洋，饒志粒，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討荊防藥對(duì)正丁醇部位分離物A的抗氧化作用機(jī)制[J].中藥藥理與臨床，2021，37（2）：111-118.

[20] 紀(jì)雅菲，芮翊馨，方洋，等.逍遙散正丁醇部位基于IGF-1Rβ/PI3K/Akt信號(hào)通路的抗抑郁作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2021，27（14）：1-11.

[21] 雷杰豪，許愛娥.中草藥黃酮類提取物對(duì)白癜風(fēng)抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2018，17（3）：281-284.

[22] 韓寶龍.中藥祛白消斑湯加減配合光療治療白癜風(fēng)臨床觀察[J/OL].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2018，5（31）：165

[2022-02-14]. https：//kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx？dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2018&filename=LCWX201831137&uniplatform=NZKPT&v=ZAyjCfMFs6d- VFO80Jv60dAkYrPXjAuSeKluPxl2EEuyDyEvcPdS3fjIk_ 3_snRb9. DOI：10.16281/j.cnki.jocml.2018.63.137.

[23] 韓春雷，陳海燕，吳潔貞，等.復(fù)方槐花補(bǔ)骨脂酊聯(lián)合NB-UVB治療穩(wěn)定期散發(fā)型白癜風(fēng)療效觀察[J].皮膚性病診療學(xué)雜志，2019，26（5）：276-279.

[24] 吳淼林，羅穎穎，嚴(yán)新，等.白頭翁皂苷對(duì)B16-F10黑色素瘤荷瘤小鼠炎癥因子的影響及機(jī)制初步研究[J].中成藥，2020，42（6）：1609-1614.

[25] 孟星君，李孝東，劉俊，等. C57BL/6 J小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2018，26（2）：139- 144.

（收稿日期：2021-12-29 修回日期：2022-03-29）

（編輯：唐曉蓮）