冬青衛(wèi)矛LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列克隆及分析

賀詩琪　范付華　吳宇航　龍蓉　王君榮　陳美吉

摘要：本文以冬青衛(wèi)矛基因組DNA為模板，克隆LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1-copia類與Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）序列，通過測序及相關生物信息學軟件對所獲序列變化特點進行分析。最終獲得Ty1-copia與Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列分別為40條和39條。其中Ty1-copia-RT序列長度在231～267 bp之間，核酸序列的相似性為8.05%～97.7%;Ty3-gypsy-RT序列長度范圍為365～499 bp，核酸序列的相似性為10.04 %～99.31 %。將所獲得的核酸序列翻譯為氨基酸后發(fā)現(xiàn)RT氨基酸序列具有高度異質(zhì)性。通過與其他物種RT序列進行比對，結(jié)果顯示冬青衛(wèi)矛與其他一些植物間的部分RT序列相似性較高，可能存在共同起源，印證了LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不同物種間可能存在橫向傳遞。

關鍵詞：冬青衛(wèi)矛;LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子;反轉(zhuǎn)錄酶;異質(zhì)性

中圖分類號：S718.3文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2022）03-0001-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.03.001

反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是一種可移動的遺傳元件，可以引起物種特異性狀變異，在植物基因組中廣泛存在，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的激活對植物基因組的不斷進化有顯著影響，是物種遺傳多樣性的一個重要因素[1]。與DNA“剪切—粘貼”式的轉(zhuǎn)座機制不同，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以自身轉(zhuǎn)錄而成的RNA為中間體，通過編碼的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成DNA后插入基因組新位點，原位置成分并不會被切除，因此能夠在基因組中不斷的自我復制增加拷貝數(shù)從而影響基因的活性以及基因組的結(jié)構(gòu)[2]。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物發(fā)育過程中通常是轉(zhuǎn)錄沉默的，在外界環(huán)境因素和內(nèi)在生物因子的刺激下能夠激發(fā)其轉(zhuǎn)座功能，引起基因組結(jié)構(gòu)變化甚至相應基因功能的變異[2-3]。

反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分為LTR（long terminal repeats）反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩大類[2]。其中，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩類成員Ty1-copia與Ty3-gypsy在水稻、梨、桂花、蘋果、梨、枇杷等植物中均有報道[4-8]。冬青衛(wèi)矛（Euonymus japonicus）種質(zhì)資源豐富、隨處可見，不僅具有經(jīng)濟、生態(tài)和觀賞效益，更具有一定藥用價值[9-11]。目前，鮮見有關冬青衛(wèi)矛LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子研究的報道。植物LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可以采用同源序列克隆法獲得大量Ty1-copia類與Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）序列，因其多拷貝、高多態(tài)性等特點具有非常高的研究價值，為植物遺傳進化提供了素材;RT序列的測定，不僅可以對植物轉(zhuǎn)座子的多態(tài)性進行監(jiān)測分析，還可以此設計分子標記對植物種質(zhì)資源親緣關系等進行分析[12]。

本文利用LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列保守區(qū)簡并引物克隆并分析冬青衛(wèi)矛RT序列特點，揭示LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列在冬青衛(wèi)矛基因組中的異質(zhì)性，為植物反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因組進化關系中的研究提供依據(jù)，也為冬青衛(wèi)矛分子標記的開發(fā)種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性評價等提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1DNA的提取與檢測

以采集的貴州冬青衛(wèi)矛葉片為材料，利用DNA提取試劑盒（DNAsecure Plant Kit（DP320-03），北京天根生化科技有限公司）提取冬青衛(wèi)矛基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠（1%）電泳和超微量核酸蛋白測定儀（德國Implen，N60 Touch）檢測其質(zhì)量、濃度，并用緩沖液（TE）稀釋提取的DNA直至濃度約為20 ng/μL，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列的PCR擴增

冬青衛(wèi)矛RT序列引物參照前人的設計，與本課題組克隆枇杷RT序列的引物和反應條件一致[6]。Ty1-copia類RT上游引物為5-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3，下游引物為5-ARCATRTCRTCNACRTA-3;Ty3-gypsy類RT上游引物為5-AGMGRTATGTGYGTSGAYTAT-3，下游引物為5-CAMCCMRAAMWCACAMTT-3;其中N表示A/G/C/T堿基，M表示A/C，R表示G/T，Y表示C/T，S表示C/G，W表示A/T堿基。PCR反應體系為10 μL，其中PCR MasterMix（北京天根生化科技有限公司）5 μL，模板DNA和引物各0.5 μL。PCR程序參照課題組羅昌斌等[6]的研究。取3 μL的PCR擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad，ChemiDoc XRS+）觀察并拍照保存。

1.3PCR產(chǎn)物的回收、轉(zhuǎn)化及測序

使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit，DP209-02）回收純化PCR產(chǎn)物，且通過超微量核酸蛋白測定儀檢測其質(zhì)量和濃度。使用TaKaRa pMDTM19-T Vector Cloning Kit試劑盒和DH5α Competent Cell感受態(tài)細胞將PCR產(chǎn)物進行連接和轉(zhuǎn)化。取已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞在37 ℃無菌環(huán)境中倒置培養(yǎng)12～16 h，通過PCR擴增篩選陽性克隆，搖菌過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后測序。

1.4RT序列生物信息學分析

過濾出RT序列測序結(jié)果中的質(zhì)?；蚪M序列后，將所獲得的Ty1-copia與Ty3-gypsy類RT序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢、對比，Bioedit翻譯為氨基酸序列且構(gòu)建序列相似矩陣以除去完全重復序列。采用ClustalX軟件進行氨基酸序列多重比對，MEGA7軟件構(gòu)建LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列的系統(tǒng)進化樹。

2結(jié)果與分析

2.1冬青衛(wèi)矛RT序列特征

采用PCR擴增，將特征片段回收、測序，再去除重復和短序列后，獲得冬青衛(wèi)矛LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1-copia類RT（EJT1）序列40條，Ty3-gypsy類RT（EJT3）序列39條，此次得到的序列與其他植物RT序列長度大致一樣。序列長度、A/G比例及登錄號見表1。

2.2Ty1-copia類RT序列分析

本研究得到40條Ty1-copia類RT序列，長度范圍為231～267 bp，其中AT所占的比例為48.85%～65.27%。核酸序列的相似性為8.05%～97.7%，平均相似性為40.2%，其中序列EJT1-5、EJT1-30與EJT1-2的相似性最高，為97.7%;序列EJT1-4與EJT 1-7的相似性最低，為8.05%。這表明冬青衛(wèi)矛Ty1-copia類RT堿基序列差異較大，具有較高的異質(zhì)性。利用MEGA7軟件的最大似然法將克隆所得到的冬青衛(wèi)矛Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列進行系統(tǒng)進化分析，可將40條序列分為5類（圖1）。其中第Ⅰ類有27條序列，第Ⅱ類有6條序列，第Ⅲ類僅有1條序列為EJT1-22，第Ⅳ類包含4條序列，第Ⅴ類有2條序列為EJT1-34和EJT1-45。第Ⅰ類所包含的序列條數(shù)最多且分散，而第Ⅲ類序列EJT1-22相較于其他類別中的序列的遺傳距離較大。

將所獲得的 RT序列分別翻譯為氨基酸序列，可以發(fā)現(xiàn)沒有終止密碼子突變。參照Ty1-copia類RT氨基酸的保守序列，發(fā)現(xiàn)多處移碼突變。例如EJT1-37的50位氨基酸處;EJT1-19的5位氨基酸處;EJT1-3、EJT1-6、EJT1-12、EJT1-14等8條氨基酸序列的19位氨基酸處;EJT1-30、EJT1-31的24位氨基酸處等（圖2）。

從NCBI中下載已登錄的來源于蘋果（ABD76 543，Malus domestica）、棗（JQ003714，Ziziphus jujuba）、鐵皮石斛（KJ147111，Dendrobium officinale）、辣椒（JQ026381，Capsicum annuum）、李（AGX455 20，Prunus salicina）、梨（JN639033， Pyrus communis）、小麥（BAA02264，Triticum aestivum）等12條其他植物的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄氨基酸序列，將它們與本文所得的冬青衛(wèi)矛Ty1-copia類RT氨基酸序列進行多序列比較，構(gòu)建相應系統(tǒng)進化樹，可將所有序列分為4類（圖3）。其中第Ⅰ類包含18條冬青衛(wèi)矛Ty1-copia類RT序列，占所測序列的近一半，同時還有10條其他植物RT氨基酸序列在內(nèi)，蘋果、李、辣椒等三條序列比起其他序列與此次目標序列的遺傳距離近，也說明他們的親緣關系較近;第Ⅱ類有3條序列分別為EJT1-37、EJT1-38和EJT1-14，還包含有棗序列JQ003714，三者在進化關系中比較接近，聚為一類;第Ⅲ類僅有1條序列為EJT1-6;第Ⅳ類包含18條序列且沒有其他植物的氨基酸序列聚在一起，這18條序列之間具有較高的相似性，與其他植物的差異明顯。

2.3Ty3-gypsy類RT序列分析

從冬青衛(wèi)矛DNA中克隆得到39條Ty3-gypsy類RT序列，長度范圍為365～499 bp，這些序列中AT所占比例為46.29%～63.47%，核酸序列的相似性為10.04%～99.31%。其中序列EJT3-14與EJT3-17、EJT3-20與 EJT3-30的相似性最高，為99.31%，序列EJT3-3與 EJT3-27的相似性最低，為10.04%。將39條Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶DNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，總共可以分為5類（圖4）。其中第Ⅰ類有25條序列，第Ⅱ類包含2條序列，第Ⅲ類僅有1條序列為EJT3-38，第IV類含有9條序列，第V類也僅有2條序列為EJT3-11和EJT3-46。

將所得39條RT序列翻譯為氨基酸。參照Ty3-gypsy類RT氨基酸的保守序列，可以發(fā)現(xiàn)所得的冬青衛(wèi)矛Ty3-gypsy類RT氨基酸序列有移碼突變的情況。例如EJT3-24的8位氨基酸處，EJT3-25的49位氨基酸處，EJT3-6、EJT3-32、EJT3-35等6條的90位氨基酸處，EJT3-40的116位氨基酸處等（圖5）。

通過NCBI下載已登錄的鋸齒列當（ABD43 099，Orobanche crenata）、梅（ACU42192，Prunus mume）、草莓（EF443064，F(xiàn)ragaria x ananassa）、銀杏（AJ228325，Ginkgo biloba）、李（AGX45505，P.salicina）、馬尾松（AGD93162，Pinus massoniana）、火龍果（KU977005，Hylocereus undatus）、桂花（KY401399，Osmanthus fragrans）等其他植物Ty3-gypsy類RT氨基酸序列，與本文獲得相關序列進行多重比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，可將所有序列分為4類（圖6）。其中第Ⅰ類包含10條冬青衛(wèi)矛Ty3類RT序列，還包含馬尾松AGD93162、鋸齒列當ABD43099、桂花KY401399、銀杏AJ228325和梅ACU42192等RT氨基酸序列在內(nèi);第Ⅱ類僅有1條序列為EJT3-32;第Ⅲ類有9條序列，且無其他植物分入此類，這9條序列相似性高;第Ⅳ類包含17條序列具有較高的相似性，其同源性較高，此類還有其他植物草莓、火龍果。由上述結(jié)果可知，冬青衛(wèi)矛反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子除了物種內(nèi)的縱向傳遞外，還可能在不同物種間進行橫向傳遞

3結(jié)論與討論

植物體內(nèi)存在大量且類型多樣的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[13]。這種可以移動的DNA元件先通過RNA聚合酶合成一條RNA，再經(jīng)其自身編碼的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在整合酶的作用下插入到基因組其他位置，進而改變了目標物種的基因組結(jié)構(gòu)，對進化發(fā)揮了巨大作用[14]。前人研究表明，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子廣泛分布于植物基因組中，且占有極大的比例，其編碼區(qū)多存在堿基缺失、重復、替換等各種突變，從而導致物種內(nèi)基因組序列具有較大差異[6]。本研究所獲得的冬青衛(wèi)矛Ty1-copia與Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列多重比對結(jié)果顯示，各類型RT序列相似度普遍偏低，序列平均相似性均為40%左右。其中Ty1-copia類RT序列EJT1-4與EJT1-7的相似性為8.05%;Ty3-gypsy類RT序列EJT3-3與 EJT3-27的相似性為10.04%。產(chǎn)生序列異質(zhì)性的原因可能是由于轉(zhuǎn)座子序列中堿基本身在插入新位置時的缺失或移碼突變，使得冬青衛(wèi)矛LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT堿基順序存在一定程度的差異[6，14]。除此以外，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能編碼反轉(zhuǎn)錄酶與整合酶，其轉(zhuǎn)座機制與反轉(zhuǎn)錄病毒（遺傳信息儲存在RNA上）復制和傳播機制相似[1，15]，與DNA復制不同的是RNA可能缺乏核糖核酸復制酶與轉(zhuǎn)錄酶的校對修復，使其復制與反轉(zhuǎn)錄過程中具有較高的突變率[15]。

本研究獲得冬青衛(wèi)矛Ty1-copia類和Ty3-gypsy類RT序列分別為40條和39條，將其與部分其他物種同種類型反轉(zhuǎn)錄酶序列進行了系統(tǒng)進化分析。通過進化樹結(jié)果可以看出，Ty1-copia類RT序列分類中的第Ⅰ類里蘋果、李、梨、辣椒等植物與冬青衛(wèi)矛目標序列的遺傳距離很近，具有較近的親緣關系，其中蘋果AAX56349與EJT1-17、EJT1-18距離最近，可能同源;Ty3-gypsy類RT序列分類中馬尾松AGD93162與EJT3-31可能同源，桂花KY401399等與EJT3-9、EJT3-28、EJT3-37等序列具有較近的遺傳距離，可能同源。以上結(jié)果表明不同類型的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子都可能在不同的物種間進行橫向傳遞，才導致他們具有同一起源的關系[6]。（責任編輯：段麗麗）

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Cloning and Analysis of RT Sequences of LTR Retrotransposons in Euonymus japonicus

He Shiqi，F(xiàn)an Fuhua，Wu Yuhang，Long Rong，Wang Junrong，Chen Meiji

（1.Institute for Forest Resources and Environmental of Guizhou/Key Laboratory of Forest Cultivation in Plateau Mountain of Guizhou Province，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.College of Forestry， Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：In this paper，reverse transcriptase （RT） sequences of Ty1-copia and Ty3-gypsy retrotransposons were obtained through PCR amplification using Euonymus japonicus genomic DNA as template.The obtained sequences were analyzed by sequencing and bioinformatics software.Results revealed that 40 Ty1-copia like RT sequences and 39 Ty3-gypsy like RT sequences were identified.The length of Ty1-copia-RT sequences ranged from 231 bp to 267 bp，and the similarity of nucleic acid sequences ranged from 8.05% to 97.7%.The length of Ty3-gypsy-RT sequences was from 365 bp to 499 bp，and the similarity of nucleic acid sequences ranged from 10.04% to 99.31%.The translated RT amino acid sequences showed high heterogeneity.The phylogenetic analysis of RT sequences showed diverse similarity between E. japonicus and other species，reflecting that they had a common origin，and a horizontal transmission of LTR retrotransposons occurred in the process of evolution among different species.

Keywords：Euonymus japonicus;LTR retrotransposon;reverse transcriptase;heterogeneity