蛹蟲草滴丸的制備及質量評價

唐浩入，韓禹鑫，張志同，江鑫，張玥，郭坤鵬，劉雪潔

（天津天獅學院 醫(yī)學院，天津 301700）

蛹蟲草 [Cordyceps militaris（L.） Link]，又稱北冬蟲夏草、北蟲草，是一種常用的食藥用真菌，屬子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌科（Clavicipitaceue）蟲草屬（Cordyceps），與冬蟲夏草同屬[1]。研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草有著多種有效成分，其中的蟲草多糖和腺苷分別具有免疫調節(jié)功能[2-3]、抗腫瘤[4-5]、降血糖[6-7]和改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常[8-9]、保護腎臟[10]等藥理作用。蛹蟲草與天然冬蟲夏草功效相似，近年來逐步成為冬蟲夏草的替代品[11]，具有良好的應用前景，目前蛹蟲草的應用形式有膠囊、口服液、顆粒、片劑和粉末等。為了實現(xiàn)溶出快、穩(wěn)定性好、生物利用度高及制備工藝簡單的目標，本研究擬將蛹蟲草提取物制作成滴丸并進行質量評價，為蛹蟲草滴丸的深入研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SY-2000型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TD6002C型電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；ME204型萬分之一電子天平，METTLER TOLEDO；DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技儀器有限公司；SS-1022型直立式粉碎機，東莞市幕荷商貿有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；CL型恒溫加熱磁力攪拌器，金壇市金祥龍華電子有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；3-18KS型臺式冷凍離心機，SIGMA（德國）；RC1207DP型溶出試驗儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州天瑞儀器有限公司；UH5300型紫外可見分光光度計，日立科學儀器（北京）有限公司；1220 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀，Agilent。

蛹蟲草，亳州仙太生物藥業(yè)有限公司；甲醇，色譜純，霍尼韋爾貿易（上海）有限公司；腺苷，99.85%，成都麥德生科技有限公司；濃硫酸、PEG6000，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；蒽酮，分析純，合肥巴斯夫生物科技有限公司；液體石蠟、無水乙醇，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；無水葡萄糖，分析純，天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；超純水，實驗室自制。

1.2 提取蛹蟲草有效成分

因蛹蟲草中含有蟲草多糖、核苷類化合物、甾醇類、蛋白質等多種有效成分[12]，故實驗采用不同濃度的乙醇水溶液使用回流的方式對蛹蟲草的有效成分進行提取。

稱取150 g蛹蟲草子實體于80℃電熱鼓風干燥箱內烘30 min，用粉碎機粉碎干燥子實體，稱取100 g蛹蟲草粉末置500 mL圓底燒瓶中。加入500 mL的95%乙醇溶液回流1h，濾出殘渣，按照此法繼續(xù)用500 mL的60%乙醇和500 mL蒸餾水依次回流提取1h[13]。合并3次回流提取液，濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至糖漿狀后趁熱轉移到干燥恒重的蒸發(fā)皿中，80 ℃水浴蒸至60 g，得到蛹蟲草浸膏。

1.3 滴丸制備工藝的選擇

1.3.1 基質與冷凝液的選擇

因PEG6000具有良好的水溶性、分散力和內聚力且安全無刺激；液體石蠟安全無害，不溶解料液與基質，不與其發(fā)生反應，故選PEG6000作為制備滴丸的基質，液體石蠟作為冷凝劑，進行預滴。

1.3.2 浸膏與基質比例的選擇

為了考察浸膏與PEG6000比例對制備滴丸的影響，實驗分別取蟲草浸膏與基質按照質量比為1∶1.5、1∶2.0和1∶2.5進行滴丸的制備，以滴丸的外觀形態(tài)為標準選擇最優(yōu)比例。

1.3.3 料液溫度的選擇

選擇料液溫度為70 ℃、80 ℃、90 ℃，在同一滴制條件下滴入5 ℃液體石蠟中觀察滴丸成型的情況。

1.3.4 滴距與滴速的選擇

在滴距為4～12 cm處進行滴丸的制備并觀察滴丸的外觀，選擇合適的滴距，在滴丸成型度好的條件下選擇合適的滴速。

1.4 蛹蟲草滴丸的質量評價

1.4.1 滴丸性狀與重量差異限度

評價蛹蟲草滴丸的外觀，并根據(jù)《中華人民共和國藥典（2020版）》中丸劑重量差異限度的要求[14]，精密稱定20粒蛹蟲草滴丸的總重量，求得平均丸重，再分別精密稱定每粒丸的重量，將每粒丸重與平均丸重比較，計算重量差異。

1.4.2 繪制硫酸-蒽酮法標準曲線

精密稱取10 mg無水葡萄糖置100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻得葡萄糖對照品溶液。精密稱取0.1 g蒽酮加入100 mL的80%硫酸溶液溶解，搖勻，棕色瓶保存[15]。分別精密吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL葡萄糖對照品溶液于試管中，加水至1.5 mL再加無水乙醇至3.5 mL。精密加入6 mL硫酸-蒽酮顯色液，混勻，水浴加熱15 min后取出冷卻，以等量蒸餾水為空白，在625 nm處測定溶液吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.3 繪制腺苷標準曲線

實驗采用高效液相色譜法（HPLC）測定腺苷含量，色譜條件如下。Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為75%甲醇水溶液；進樣量10 μL；流速為1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長260 nm[16]。

配 置 溶 液 濃 度 為 1.04 μg/mL、2.08 μg/mL、4.16 μg/mL、41.60 μg/mL和 416.00 μg/mL的一系列腺苷標準溶液，以峰面積作為縱坐標，濃度作為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.4 滴丸體外溶出度測定

蟲草多糖和腺苷為蛹蟲草有效成分中的代表性物質，故選用這兩種有效成分作為溶出度測定的評價指標。

稱取1.90g蛹蟲草滴丸，根據(jù)《中華人民共和國藥典（2020版）》溶出度與釋放度測定法（籃法）[14]129-130進行溶出操作。溶出條件：溶劑為900 mL蒸餾水，溫度為37 ℃，轉速為100 r/min。分別在5 min、15 min、30 min、60 min、120 min和 180 min取 樣5 mL，快速將樣液用0.45 μm的微孔濾膜過濾，吸取1.5 mL濾液，加入乙醇至3.5 mL，搖勻，根據(jù)1.4.2標準曲線計算溶出的多糖濃度；繼續(xù)吸取1mL濾液，根據(jù)1.4.3標準曲線測定溶出的腺苷含量。以180 min溶出的多糖和腺苷含量為完全溶出含量，繪制溶出曲線。

2 結果與分析

2.1 滴丸制備工藝選擇

（1）基質與冷凝液：預試驗發(fā)現(xiàn)以PEG6000為基質，液體石蠟為冷凝劑制備的滴丸下降速度適宜，滴丸成型好，無黏連，符合要求。

（2）浸膏與基質比例：實驗發(fā)現(xiàn)在相同滴制條件下，1∶1.5比例的料液黏度大，無法進行滴制；1∶2.0比例的料液滴制的滴丸有較好的圓整度，無拖尾，但滴丸有黏連，冷凝不均；1∶2.5比例制備的滴丸成型好，無黏連，色澤均勻，冷凝均勻。故選用蟲草浸膏與基質質量比為1∶2.5混合后制備滴丸。

（3）料液溫度：實驗發(fā)現(xiàn)在70 ℃時，料液黏度大，滴制不便；在90 ℃時，料液黏度小，但滴丸有黏連，不符要求。故選擇80 ℃作為合適的料液溫度。

（4）滴距與滴速：實驗發(fā)現(xiàn)滴距在6～8 cm，滴速為20～40滴/min條件下制備的滴丸成型度好，故本實驗選擇的滴距為6 cm，滴速為40滴/min。

2.2 滴丸質量評價

2.2.1 滴丸性狀與重量差異限度

（1）性狀：按照2.1所述工藝制備的蛹蟲草滴丸外觀圓整、大小與色澤均勻、無拖尾和氣泡、無黏連、無裂紋，符合要求。

（2）滴丸重量差異限度：求得平均丸重為0.025 5 g，僅有一丸與平均丸重差異17%，超出重量差異限度（15%），符合藥典規(guī)定。

2.2.2 硫酸-蒽酮法標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制得到如圖1所示的標準曲線回歸方程：y=0.002 4x+0.001 2，相關系數(shù)R2=0.999 7，方程擬合程度較好。

圖1 硫酸-蒽酮法標準曲線

2.2.3 腺苷標準曲線的繪制

以峰面積作為縱坐標，濃度作為橫坐標，得如圖2所示的線性回歸方程：y=29.829x+137.03，相關系數(shù)R2=0.999 6，方程擬合程度較好。

圖2 腺苷標準曲線

2.3 溶出度測定結果

從圖3和圖4可知，蟲草多糖在15 min溶出度達到了98.73%，腺苷在15 min溶出度達到98.87%，符合《中華人民共和國藥典（2020版）》滴丸劑30 min溶散時限要求[14]132-135。

圖3 蛹蟲草滴丸多糖溶出曲線

圖4 蛹蟲草滴丸腺苷溶出曲線

3 結論

本研究成功制備了蛹蟲草滴丸并進行了質量評價。選擇的制備工藝為：蛹蟲草浸膏與PEG6000質量比1∶2.5，料液溫度80 ℃，冷凝溫度5 ℃，冷凝液為液體石蠟，滴距6 cm，滴速40滴/min。制備的蛹蟲草滴丸圓整度好、大小與色澤均勻、無拖尾和氣泡、無黏連和無裂紋。滴丸重量差異限度、有效成分多糖和腺苷體外溶出時限均符合藥典規(guī)定。蛹蟲草滴丸的制備工藝簡單且滴丸有效成分溶出快，具有一定的應用前景，可為蛹蟲草滴丸的深入研究和開發(fā)利用提供實踐和理論基礎。