牛冠狀病毒與大腸埃希氏桿菌混合感染的實驗室診斷

彭 龍，苗書魁，陸桂麗，汪 萍，夏 俊，米曉云，魏 婕，魏玉榮，沙依蘭·卡依扎，馬文戈*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所＆新疆畜牧科學(xué)院動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，烏魯木齊 830013）

犢牛腹瀉是牛場常見疾病，該病的高發(fā)病率與高死亡率是養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的重大阻礙[1，2]。 發(fā)病犢牛的臨床癥狀表現(xiàn)為體溫升高、食欲廢絕、精神不佳、糞便惡臭稀軟，常伴有不同程度脫水等[3，4]。造成犢牛腹瀉的原因較為復(fù)雜，通常為混合感染，防控難度增加。 常見的病原感染有冠狀病毒、輪狀病毒、病毒性腹瀉病毒、致病性大腸埃希氏桿菌等。其中冠狀病毒既可以感染呼吸道，也可以感染腸道，常導(dǎo)致犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道疾病，攜帶病毒的牛長期帶毒，病毒顆粒隨著糞便排出體外后仍具有感染性。由于新疆的天氣冬季較長適合病毒存活，所以牛群易發(fā)生大范圍的感染。 致病性大腸埃希氏桿菌是引起多種嚴(yán)重疾病的主要致病菌，該菌借助食物、水源等傳播途徑進(jìn)行傳播。 研究表明，與人類疾病相關(guān)的致病性大腸埃希氏桿菌在不少動物的糞便中被檢測到，嚴(yán)重威脅人類與動物的健康[5～8]?？κ驳貐^(qū)某牛場發(fā)生犢牛腹瀉，通過臨床檢查并做流行病學(xué)調(diào)查后，初步懷疑犢牛死亡的原因為病毒或細(xì)菌感染所致。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

采集病死犢牛的新鮮糞便共8 份，健康犢牛糞便2 份，4 ℃冰盒保存，盡快轉(zhuǎn)移到實驗室進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.1.2 試劑

RNA/DNA 提取純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），LB 固體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.1.3 儀器和設(shè)備

電泳儀（北京六一儀器廠）， 移液器（伊孚森生物技術(shù)），-70 ℃冰箱（VX480E， 海爾），RT-PCR 儀（Eppendorf 公司），超凈工作臺（BBS-SDC，山東博科儀器制造有限公司），低溫臺式高速離心機(jī)（4K15，德國Sigma 公司）， 電子秤 （LT102E， 白鰭豚生物科技有限公司）， 凝膠成像儀 （AB 75342 Uppsala，GE Healthcare Sweden）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離

將采集的新鮮糞便樣品在超凈工作臺中分別接種于LB 瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱（MAC）鑒定培養(yǎng)基以及SS 瓊脂培養(yǎng)基上，將恒溫箱調(diào)至37 ℃，有氧條件下培養(yǎng)10 h 左右，觀察培養(yǎng)基上菌落情況。 次日將LB瓊脂培養(yǎng)基上的不同顏色、大小、形狀的單菌落共30 個，挑取、接種至5 mL LB 液體培養(yǎng)基中后，置于37 ℃恒溫?fù)u床中12 h 左右培養(yǎng)。 將純化后的細(xì)菌通過使用細(xì)菌16SrDNA 的通用引物(上游引物：5’－AGAGAATGATCTCGGCTCAC－3’;下游引物：5’－GGAAACCTTGTTGCAACTT－3’），采用PCR 技術(shù)對目的基因(預(yù)期片段長度約1 500 bp）進(jìn)行擴(kuò)增。 PCR 擴(kuò)增體系50 μL:模板0.5 μL，上、下游引物各2 μL，2×Tag RT-PCR MasterMix25 μL，雙蒸水補充至50 μL。 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火時長15 s，72 ℃延伸1.5 min，共25 個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。 擴(kuò)增產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 藥物敏感性實驗

選取四環(huán)素、頭孢曲松、阿奇霉素、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、頭孢他啶、卡那霉素、鏈霉素、左氧氟沙星、洛美沙星、諾氟沙星和青霉素藥敏紙片對分離到的細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性實驗[9，10]。

1.2.3 病毒RT-PCR 檢測

1.2.3.1 樣品處理 將采集的糞便樣品與1×PBS 按照1:2 的比例混合，-20 °C 凍融3 次,6 000 r/min 離心8 min 后取上清，通過RNA/DNA 提取純化試劑盒提取病原RNA。

1.2.3.2 病毒RT-RT-PCR 檢測 BcoV -S 基因引物序列（上游引物:5'-GAATTCTTTCAGATACTTTTAAT GTCCTTA-3',下游引物5'-AAACTCAGCAGATTACCATTAGAACGATAT-3'）,擴(kuò)增長度1 309 bp。 牛輪狀病毒的引物序列（上游引物：5'-AGAATAATCGTTCTACTA -3',下游引物：5'-CGGTCACATATCGTAACTCT-3'），擴(kuò)增長度786 bp。牛病毒性腹瀉病毒的引物序列（上游引物：5'-GCTAGCCATCGATAGAG-3',下游引物：5'-TGGATGTGCCATCGTAAGC-3'），擴(kuò)增長度925 bp。 上述引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 反轉(zhuǎn)錄RT-PCR 的反應(yīng)體系如下：2X Buffer 12.5 μL，prime script Mix 1.5 μL 上游引物、下游引物各1.25 μL(引物濃度20 μ mol/L)，RNA 模板4 μL，雙蒸水4.5 μL，總反應(yīng)體系為25 μL。用無菌槍頭將上述溶液充分混勻，RT-PCR 反應(yīng)體系：50 ℃30 min，94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火時長15 s，72 ℃延伸1.5 min，共30 個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。 RT-PCR 的擴(kuò)增產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物序列測定與分析 按照DNA 膠回收試劑盒說明書膠回收目的基因, 回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體在16 ℃條件下連接16 h，轉(zhuǎn)化至Top-10 感受態(tài)細(xì)胞中,在無菌條件下涂板培養(yǎng)14 h 后，挑取形態(tài)大小合適的單菌落至5 mL 液體培養(yǎng)基，37 °C 搖床過夜培養(yǎng)，次日提取質(zhì)粒。 質(zhì)粒經(jīng)快速酶切，初步篩選出陽性質(zhì)粒，并將陽性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。 將測序結(jié)果在NCBI BLAST 搜索同源序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果

2.1.1 分離細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察及RT-PCR 鑒定結(jié)果

在采集到的8 份新鮮腹瀉糞便樣品中均分離出細(xì)菌，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)紅色和黃色表面光滑、濕潤的菌落；在LB 瓊脂培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)大小、形態(tài)不同的灰白色菌落；在SS 培養(yǎng)基上無菌落，將顏色、大小、形態(tài)不同的菌落。通過16SrDNA 擴(kuò)增目的基因條帶并測序發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希氏桿菌、腸球菌、酪酸梭菌、放線菌共6 種細(xì)菌。在分離的大腸埃希氏桿菌中，經(jīng)測序鑒定有8 株為致病性大腸埃希氏桿菌，均擴(kuò)增出約1 500 bp 大小的條帶（見圖1）。

圖1 大腸埃希氏桿菌RT-PCR 檢測結(jié)果

2.1.2 藥敏試驗結(jié)果

由表1 可見致病性大腸埃希氏桿菌對阿奇霉素、美羅培南、阿米卡星這三種藥物高度敏感，對其余十種抗生素耐藥，出現(xiàn)該種情況與該牛群長期使用抗生素有關(guān)。 阿奇霉素、美羅培南、阿米卡星這三種敏感藥物可作為繼發(fā)感染的首選治療藥物。

2.2 病原核酸檢測結(jié)果

BVDV 及BRV 的RT-PCR 檢測結(jié)果均為陰性(圖2，圖3)，未檢測到BVDV 是由于該牛場已免疫過BVDV 疫苗或樣品數(shù)量太少，而沒有檢測到BRV 可能與樣品數(shù)量太少有關(guān)。 BCoV 的RT-PCR 檢測結(jié)果為陽性，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析基因條帶與預(yù)期的大小一致，約為1 300 bp（圖4）。 將目的基因連接轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。 將測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與BCoV 的同源性均在96%以上，因此可確定該毒株為牛冠狀病毒。

圖2 BVDV RT-PCR 檢測結(jié)果

圖3 BRV RT-PCR 檢測結(jié)果

圖4 BCoV RT-PCR 檢測結(jié)果

3 討 論

本實驗采集了喀什地區(qū)某養(yǎng)殖場發(fā)生腹瀉的糞便樣本，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定，并對引起犢牛腹瀉的常見病毒進(jìn)行RT-PCR 檢測，結(jié)果顯示BCoV 為陽性。 BCoV 陽性率為75%，致病性大腸埃希氏桿菌陽性率為100%，同時感染BCoV 和致病性大腸埃希氏桿菌的犢牛陽性率為75%。 試驗結(jié)果表明，該牛場犢牛腹瀉由BCoV 和致病性大腸埃希氏桿菌引起。 在實地觀察發(fā)現(xiàn)該牛場的飼養(yǎng)管理方式存在不足，消毒不徹底，并且牛圈空間狹小不利于通風(fēng)，所以容易導(dǎo)致病原的滋生。 藥物敏感性實驗表明，該牛場的致病性大腸埃希氏桿菌存在多重耐藥情況。原因可能是該牛場抗菌藥長期使用所致[11～13]，或部分牛在引進(jìn)該牛場之前使用過大量抗生素。

將感染牛冠狀病毒的牛進(jìn)行隔離，同時加強(qiáng)并完善牛場的飼養(yǎng)管理，定期對牛圈及飼養(yǎng)環(huán)境消毒，保證牛在通風(fēng)、干燥、清潔衛(wèi)生的飼養(yǎng)環(huán)境中生長。另外，對哺乳母牛乳頭徹底消毒干凈，防止致病微生物傳給犢牛。犢牛出生后及早哺喂初乳，最好在產(chǎn)后1 h 之內(nèi)給犢牛喂初乳，奶溫在36 °C～38 °C。致病性大腸埃希氏桿菌是導(dǎo)致犢牛腹瀉的主要致病菌之一，犢牛出生后7 d，按規(guī)定注射大腸桿菌疫苗，也可適當(dāng)使用敏感抗生素進(jìn)行預(yù)防治療[14]。

4 結(jié) 論

本實驗通過細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定、藥物敏感性實驗和相關(guān)病毒RT-PCR 檢測，確診該牛場本次犢牛腹瀉的主要原因是牛冠狀病毒與致病性大腸埃希氏桿菌混合感染引起。 由于BCoV 目前國內(nèi)沒有疫苗，且無特效藥，牛感染BCoV 后，常會引起致病性大腸埃希氏桿菌的繼發(fā)感染，本實驗藥敏結(jié)果顯示，致病性大腸埃希氏桿菌對阿奇霉素、美羅培南、阿米卡星敏感，因此可以將其作為致病性大腸桿菌病的治療藥物。