過(guò)度勞累對(duì)大鼠動(dòng)脈血管壁細(xì)胞外基質(zhì)的影響

陳蘇衡，甘 露，莊 苗，張小曉，郭 鴻，黃蓉蓉，李玉蘭

1蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000 2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，蘭州 730000

近年來(lái)，全球各行業(yè)“過(guò)勞死”頻繁發(fā)生，引起社會(huì)的廣泛關(guān)注?！斑^(guò)勞死”是因?yàn)楣ぷ鲿r(shí)間過(guò)長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度過(guò)重、心理壓力太大引發(fā)的亞健康狀態(tài)，由于積重難返，可能誘發(fā)身體潛在的疾病突然惡化，救治不及時(shí)會(huì)危及生命[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年有約60萬(wàn)人死于過(guò)度勞累(overwork，OW)，居世界首位。過(guò)勞死已成為我國(guó)現(xiàn)階段非常嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題之一，亟待社會(huì)學(xué)和醫(yī)學(xué)層面的系統(tǒng)研究[2]。既往研究表明，OW狀態(tài)引起猝死的主要原因是心腦血管疾病，如腦出血、腦梗死、心肌梗死等[3]；OW狀態(tài)增加體內(nèi)兒茶酚胺和皮質(zhì)醇的分泌，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展、心血管疾病和腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)增加[4]，且長(zhǎng)時(shí)間工作與中風(fēng)具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系[5]。對(duì)青年猝死者進(jìn)行法醫(yī)學(xué)檢查時(shí)，在其腦血管、冠狀血管及主動(dòng)脈上升部均可發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變[6]，表現(xiàn)為血管壁結(jié)締組織紊亂、扭曲或結(jié)締組織成分置換的改變[7]，以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)結(jié)構(gòu)排列紊亂與ECM的沉積為著。ECM的異常沉積或成分改變會(huì)使血管壁發(fā)生重塑，血管重塑是對(duì)衰老和血管疾病相關(guān)的各種病理生理變化的適應(yīng)性反應(yīng)，血管重塑與心腦血管疾病的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)[8- 9]。本研究擬建立大鼠OW模型[10]，檢測(cè)OW對(duì)大鼠動(dòng)脈壁病理、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)相關(guān)基因、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissueinhibitor of metalloproteinase，TIMP)相關(guān)基因與Ⅰ型膠原纖維(collagen 1，Col- 1)基因、蛋白的影響，探討OW引起血管病變的可能性。

材料和方法

動(dòng)物與分組健康清潔級(jí)成年雄性Sprague-Dawley大鼠18只，體重180～220 g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字分組法分為3組：對(duì)照組、OW組、睡眠限制(sleep deficiency，SD)+OW組，每組6只。SD+OW組的設(shè)立用于觀察在OW的基礎(chǔ)上，相對(duì)較少的睡眠時(shí)間是否可以進(jìn)一步加重動(dòng)脈血管壁的變化，睡眠時(shí)間限制的方法使動(dòng)物模型更接近于人類的工作狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)室溫24 ℃、濕度45%～65%，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝食水。

主要試劑與材料Masson改良三色染色試劑盒、EVG染色試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶公司，二步法免疫組織化學(xué)法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司，兔抗Ⅰ型膠原蛋白多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)武漢三鷹生物有限公司，臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)為中國(guó)大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)，熒光定量PCR儀、超微量分光光度計(jì)均為美國(guó)賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)，超凈工作臺(tái)為中國(guó)蘇凈安泰公司生產(chǎn)，光鏡為日本奧林巴斯公司生產(chǎn)，透射電鏡為日本電子株式會(huì)社公司生產(chǎn)。

模型制作與處理采取強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test，F(xiàn)ST)建立過(guò)勞模型，F(xiàn)ST是指將大鼠放入水中，大鼠試圖通過(guò)游泳離開(kāi)水域，直至力竭的方法；本研究當(dāng)大鼠完全潛入水中(鼻尖低于水平面)超過(guò)10 s不能自行浮出水面的情況連續(xù)出現(xiàn)3次或撈出后大鼠翻正反射消失即為完成1次FST。對(duì)照組大鼠在鼠籠中自由活動(dòng)，隨意飲食，無(wú)特殊處理；OW組大鼠每日完成FST 2次，其余條件同對(duì)照組，連續(xù)15 d；SD+OW組大鼠每日完成FST 2次，在兩次游泳之間大鼠被放入水上平臺(tái)(水中平臺(tái)裝置為一35 cm×40 cm×60 cm的水槽，其內(nèi)有數(shù)個(gè)高約12 cm、直徑約4 cm的圓柱形平臺(tái)，水深約10 cm)，時(shí)長(zhǎng)為6 h，隨意飲食，連續(xù)15 d。連續(xù)15 d完成FST的大鼠即認(rèn)為造模成功。第16天，用戊巴比妥鈉(1%溶液，6 μl/g，腹腔注射)麻醉大鼠，心臟取血5 ml后迅速摘取5 cm腹主動(dòng)脈和1 cm頸總動(dòng)脈后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

血管壁病理形態(tài)學(xué)檢查取部分腹主動(dòng)脈，在磷酸鹽緩沖液中將血管外周結(jié)締組織剝離干凈，放入4%多聚甲醛固定7 d，乙醇梯度脫水，石蠟垂直定向包埋，每段血管間斷均勻切取6片。Masson染色：取6片切片嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)行Masson染色，光鏡下觀察膠原纖維染色，后用Image J病理圖像分析系統(tǒng)定量膠原纖維含量百分比[11]；EVG染色：在磷酸鹽緩沖液中剝離頸總動(dòng)脈外結(jié)締組織，放入4%多聚甲醛固定7 d，乙醇梯度脫水，石蠟垂直定向包埋，每段血管均勻切取6片進(jìn)行EVG彈性纖維染色，光鏡下觀察動(dòng)脈壁彈性纖維染色，用于判斷彈性纖維的完整性及結(jié)構(gòu)排列，后用Image J病理圖像分析系統(tǒng)定量彈性纖維含量百分比。

透射電鏡觀察腹主動(dòng)脈壁超微結(jié)構(gòu)取部分腹主動(dòng)脈，在PBS緩沖液中將血管外周結(jié)締組織剝離干凈，用2.5%戊二醛、1%鋨酸雙重固定，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片機(jī)切片(70 nm)，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后在透射電鏡下觀察血管壁超微結(jié)構(gòu)的改變、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)與ECM的連接及彈性纖維層的形態(tài)結(jié)構(gòu)和完整性。

免疫組織化學(xué)法定量分析腹主動(dòng)脈Col- 1蛋白表達(dá)取部分腹主動(dòng)脈石蠟垂直定向包埋后，石蠟切片機(jī)均勻切片，每片厚約4 μm；60 ℃烤片過(guò)夜；脫蠟水化；微波抗原修復(fù)；冷卻至室溫后每張切片滴加一抗50 μl(兔抗Ⅰ型膠原蛋白多克隆抗體，稀釋濃度1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜；然后按PV- 9000二步法檢測(cè)試劑盒滴加二抗，37 ℃溫育30 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，脫水與透明后封片，封片后光鏡下觀察。光鏡下可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色點(diǎn)狀或纖維狀染色，棕黃色面積大小可以代表蛋白表達(dá)含量的多少；每張切片選擇5個(gè)不同視野進(jìn)行拍照，用Image-Pro J圖像分析軟件測(cè)量陽(yáng)性染色積分光密度(integrated optical density，IOD)值以及陽(yáng)性染色面積，并計(jì)算平均IOD值(mean integral optical density，MOD)(MOD=IOD/目標(biāo)分布區(qū)域面積)以反映Col- 1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

腹主動(dòng)脈中MMP、TIMP、Col- 1基因表達(dá)水平測(cè)定取部分腹主動(dòng)脈，在PBS緩沖液中將血管外周結(jié)締組織剝離干凈，吸干血管壁表面水分備用，取勻漿管，加入1 ml的RNA提取液，置冰上預(yù)冷，取100 mg組織，加入到勻漿管中，勻漿儀充分研磨直至無(wú)可見(jiàn)組織塊，使用離心半徑為8 cm的離心機(jī)，12 000 r/min離心10 min取上清；將濃度過(guò)高的RNA進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋，使其終濃度為200 mg/L；配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系后與提取RNA輕輕混勻后離心，設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序(25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s)；后將每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配置3管，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增結(jié)果使用ΔΔCT法處理，表達(dá)倍數(shù)=2-ΔΔCT。最終計(jì)算得出的表達(dá)倍數(shù)反映血管壁中相關(guān)基因的表達(dá)水平。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用ANOVA單因素方差分析，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以M(P25，P75)表示，多組間比較采用Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)，用Bonferroni檢驗(yàn)校正顯著性水平進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

腹主動(dòng)脈膠原纖維結(jié)構(gòu)及含量變化對(duì)照組可見(jiàn)排列整齊的藍(lán)色膠原纖維，膠原纖維間可見(jiàn)粉色的血管平滑肌細(xì)胞；與對(duì)照組相比，OW組與SD+OW組膠原纖維排列結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，血管壁中層厚度增加(圖1)。Image J圖像軟件定量分析顯示， 對(duì)照組膠原纖維面積為(47.64±5.98)%，OW組為(45.27±8.65)%，SD+OW組為(43.83±4.75)%，3組中膜膠原纖維含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

OW：過(guò)度勞累；SD：睡眠限制

頸總動(dòng)脈彈性纖維結(jié)構(gòu)及含量變化血管壁染色后彈性纖維呈黑色，膠原纖維呈粉紅色，各彈性板層間可見(jiàn)散在的彈性纖維；與對(duì)照組相比，OW組與SD+OW組彈性纖維斷裂和紊亂，合并有血管壁中層厚度增加；SD+OW組彈性板層結(jié)構(gòu)紊亂，彈性纖維排列雜亂無(wú)序，VSMC細(xì)胞間散在的彈性纖維減少，且彈性板層變薄(圖2)；Image J圖像軟件定量分析顯示，對(duì)照組彈性纖維面積為(19.62±2.70)%，OW組為(13.23±1.65)%，SD+OW組為(13.25±1.57)%；與對(duì)照組相比，OW組與SD+OW組彈性纖維含量均顯著下降(P均<0.001)，OW組與SD+OW組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

←：彈性板層

透射電鏡下腹主動(dòng)脈的超微結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比，OW組、SD+OW組可見(jiàn)彈性纖維斷裂、腹主動(dòng)脈管壁厚度增加、VSMC紊亂、ECM排列結(jié)構(gòu)紊亂；在SD+OW組腹主動(dòng)脈觀察到蟲(chóng)蛀樣或海綿狀的碎裂纖維的外觀，在同一血管橫截面的不同區(qū)域，纖維破碎和混亂的嚴(yán)重程度不同。此外，觀察到平滑肌細(xì)胞與ECM纖維連接減少(圖3)。

←：彈性纖維；：斷裂的纖維及海綿狀的碎裂纖維

血管壁Col- 1的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，對(duì)照組Col- 1的mRNA表達(dá)量為1.00±0.03，OW組為0.85±0.02，SD+OW組為0.82±0.02；與對(duì)照組相比，OW組、SD+OW組Col- 1 mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P均<0.001)；OW組與SD+OW組Col- 1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比，OW組和SD+OW組黃染顆粒面積明顯減少(圖4)。定量分析顯示，對(duì)照組MOD值為0.33±0.04，OW組為0.30±0.02，SD+OW組為0.28±0.05；與對(duì)照組相比，OW組、SD+OW組Col- 1蛋白含量均顯著下降(P均<0.001)；OW組與SD+OW組Col- 1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Col- 1：Ⅰ型膠原蛋白；★：管腔側(cè)

MMP與TIMP的基因表達(dá)與對(duì)照組相比，OW組、SD+OW組MMP- 1(P均<0.001)、MMP- 2(P均<0.001)的mRNA表達(dá)均顯著增加，OW組與SD+OW組MMP- 1、MMP- 2的 mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；3組MMP- 9、TIMP- 1的mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(圖5)。

MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶；TIMP- 1：組織金屬蛋白酶抑制劑- 1

討 論

OW引起猝死的病理機(jī)制目前尚無(wú)研究定論。本研究采用FST建立過(guò)勞模型[10]，模擬人類長(zhǎng)期工作并間斷處于應(yīng)激反應(yīng)的狀態(tài)；同時(shí)結(jié)合水中平臺(tái)裝置限制大鼠的睡眠時(shí)間，使模型更加貼近人們?nèi)粘５纳顮顟B(tài)。目前中國(guó)公民人均預(yù)期壽命是77.3年，正常大鼠壽命2～3年，實(shí)驗(yàn)造模周期共15 d，造模時(shí)長(zhǎng)相當(dāng)于人類連續(xù)處于OW工作狀態(tài)1年左右。第16天造模結(jié)束，可見(jiàn)OW大鼠毛發(fā)失去光澤、毛發(fā)稀疏，同時(shí)伴有神情淡漠與精神狀態(tài)欠佳，認(rèn)為造模成功[10]。

本研究結(jié)果顯示，OW使大鼠頸總動(dòng)脈彈性纖維含量下降，血管壁的彈性板層變薄；腹主動(dòng)脈血管壁發(fā)生纖維斷裂，ECM失去正常的排列順序。OW使大鼠腹主動(dòng)脈Col- 1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)下降。OW使大鼠腹主動(dòng)脈MMP- 1、MMP- 2的mRNA表達(dá)增加。MMP的增加會(huì)引起Col- 1和彈性纖維的降解，破壞血管壁ECM的動(dòng)態(tài)平衡。研究表明在OW等因素作用下，動(dòng)脈血管ECM的完整性會(huì)遭到破壞，從而血管壁的穩(wěn)定性下降。

大中動(dòng)脈的血管壁分為3層：內(nèi)膜、中膜及外膜，主要組成成分有內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和ECM[12]。內(nèi)膜連接血管腔，中膜由內(nèi)、外彈性層與內(nèi)膜、外膜隔開(kāi)，主要由呈圓周排列的VSMC、膠原蛋白和彈性蛋白組成；中膜是血管壁的主要組成部分，是機(jī)械順應(yīng)性的主要決定因素，外膜由膠原體ECM、成纖維細(xì)胞、血管周神經(jīng)、淋巴管、血管和炎癥細(xì)胞組成[13]。中、大動(dòng)脈血管壁中含量最多的ECM為膠原纖維和彈性纖維，二者在血管壁的結(jié)構(gòu)支撐、機(jī)械性能與生化性能中發(fā)揮著不可或缺的作用。

ECM的合成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡中，MMP可降解ECM中所有的蛋白，正常生理?xiàng)l件下，MMP的生理活性很低，并在4個(gè)水平上受到調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)的調(diào)控、合成與分泌調(diào)節(jié)、酶原的激活及TIMP的調(diào)節(jié)；TIMP是多功能分子，不僅調(diào)控MMP活性，且具有細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣作用，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生及膠原合成，使ECM沉積并抑制其降解[14]。為了研究血管壁中ECM的變化，本研究檢測(cè)血管壁含量最多的Col- 1以及在調(diào)控ECM合成降解中發(fā)揮重要作用的MMP與TIMP；MMP- 1為膠原酶的一種，主要作用底物為Ⅰ～Ⅲ型膠原纖維、纖維連接蛋白及層粘連蛋白；MMP- 2和MMP- 9屬于明膠酶一類，主要作用底物為Ⅵ、Ⅴ、Ⅶ型膠原纖維和纖維連接蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白[15]。

細(xì)胞外基質(zhì)降解被認(rèn)為是導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)完整性和機(jī)械性能破壞最重要的機(jī)制，MMP是這一過(guò)程的關(guān)鍵因素。主動(dòng)脈壁MMP主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)側(cè)VSMC[16]。長(zhǎng)時(shí)間工作會(huì)使人體處于一個(gè)慢性應(yīng)激狀態(tài)，應(yīng)激會(huì)使體內(nèi)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎性因子增多，同時(shí)增加腎素-血管緊張素系統(tǒng)的活性[17]，白細(xì)胞介素- 2、白細(xì)胞介素- 6、腫瘤壞死因子-α等促炎癥因子和血管緊張素Ⅱ的增加會(huì)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生影響[18]；在氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎性因子的刺激作用下，內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌MMP增加[19]，從而加劇細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使ECM原有的排列結(jié)構(gòu)與機(jī)械性能遭到破壞；有文獻(xiàn)顯示炎性因子浸潤(rùn)血管壁可以促進(jìn)ECM中彈性纖維和膠原纖維的降解，從而促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生和發(fā)展[16]。正常血管壁中，在MMP含量升高時(shí)，會(huì)同時(shí)激活TIMP，TIMP生成增加后結(jié)合MMP，使MMP活性下降，從而減少ECM的降解，以調(diào)控ECM降解與合成，達(dá)成一種新的動(dòng)態(tài)平衡，即ECM重塑。伴隨這種ECM的重塑，血管壁細(xì)胞的生物學(xué)行為、血管壁形態(tài)和功能均會(huì)發(fā)生改變。

本研究同時(shí)探討了OW狀態(tài)下限制睡眠時(shí)間是否加重血管壁的損傷。結(jié)果顯示SD聯(lián)合OW與單純OW大鼠的檢測(cè)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明相對(duì)減少的睡眠時(shí)間并未加重OW造成的血管壁損傷。

本研究的局限性在于僅對(duì)腹主動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈進(jìn)行了檢測(cè)觀察，未進(jìn)一步觀察主要器官內(nèi)的動(dòng)脈變化；MMP與TIMP是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要系統(tǒng)，該研究?jī)H檢測(cè)mRNA水平的表達(dá)，未檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平及功能活性，不能全面評(píng)估動(dòng)脈血管壁ECM的變化。

綜上，OW可造成動(dòng)脈血管壁ECM中MMP- 1、MMP- 2的mRNA表達(dá)增加，Col- 1與彈性纖維的降解增多、含量減少，ECM合成與分解的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，加速血管壁ECM重塑，造成血管壁穩(wěn)定性下降，這可能是OW引起的血管病變的病理基礎(chǔ)。