網(wǎng)絡藥理學分析三氯生對非酒精性脂肪性肝病的治療作用

左 超，孫東雷，趙田禾，王靜靜，張遵真

四川大學華西公共衛(wèi)生學院/四川大學華西第四醫(yī)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學系，成都 610041

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種波及全人群的慢性肝臟疾病，而全世界尚無藥物獲批用于NAFLD臨床治療[1]，尋求NAFLD發(fā)病機制中的關鍵靶點和有效干預藥物已成為當下研究的熱點與難點。肝臟脂肪酸合成增加與脂肪酸分解減少被認為是NAFLD發(fā)生發(fā)展的罪魁禍首[2]，其中脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)是肝臟從頭合成脂肪酸的關鍵限速酶，F(xiàn)ASN表達增加會引起肝細胞內(nèi)脂肪沉積導致肝臟脂肪變性[2]，因此，將FASN抑制劑用于改善NAFLD是藥物研發(fā)的新方向。三氯生(C4H7Cl3O2)是一種常見的廣譜抗菌劑，最初被發(fā)現(xiàn)可以通過抑制細菌FASN發(fā)揮抗菌作用[3]，近年研究顯示三氯生還可以抑制多種人源性細胞的FASN[4- 5]，不難推測三氯生可能通過抑制FASN減少肝細胞脂合成，可能具有治療NAFLD的潛力。但迄今為止并無將三氯生用于改善NAFLD的研究，三氯生是否能夠治療NAFLD的效果尚不清楚。此外，單一靶點藥物不足以改善NAFLD[1]，三氯生是否能夠作用于多靶點改善NAFLD同樣存疑。若能尋找到除FASN外三氯生改善NAFLD的其他靶點，可以為三氯生改善NALFD的研究提供更加全面的理論依據(jù)。網(wǎng)絡藥理學是近年發(fā)展的、基于計算機的預測技術，可快速、高效預測化合物作用于疾病的多個靶點，可為探究化合物的成藥潛力與分子機制提供線索。本研究采用網(wǎng)絡藥理學技術預測三氯生對NAFLD的作用靶點，分析靶點富集的信號通路，并進行初步的藥理學實驗，為未來深入研究三氯生治療NAFLD的作用與機制提供思路與依據(jù)。

材料和方法

數(shù)據(jù)庫三氯生的化學結構資料和結構信息SMILES式來自小分子化學物數(shù)據(jù)庫Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)?；衔镒饔冒悬c的預測與疾病靶點的獲取通常利用多個數(shù)據(jù)庫進行交集分析，避免單一數(shù)據(jù)庫預測結果的不準確性。因此，本研究使用PharmMapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)、HTDocking(https：//www.cbligand.org/AD/)、HitPick(http：//mips.helmholtz-muenchen.de/hitpick/cgi-bin/index.cgi?content=help.html)、SuperTarget(https：//bioinformatics.charite.de/supertarget/index.php?site=targets) 4個化合物作用靶點預測網(wǎng)站預測三氯生的作用靶點，利用TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)和Genecards(https：//www. genecards.org/) 3個經(jīng)典的疾病數(shù)據(jù)庫獲取NAFLD疾病靶點，通過蛋白質數(shù)據(jù)庫Uniprot(https：//www. uniprot.org/)對靶點名稱進行標準化處理，從蛋白質結構數(shù)據(jù)庫PDB(http：//www1.rcsb.org/)中獲取蛋白三維結構編碼(即PDB ID)。

藥品與試劑三氯生(純度≥97%)和羧甲基纖維素鈉購于大連美侖生物有限公司，三氯生混懸液每日現(xiàn)配現(xiàn)用。60%高脂飼料購于南通特洛菲飼料科技有限公司。10%中性甲醛組織固定液購于武漢賽維爾生物科技有限公司。蛋白質裂解液購于索萊寶生物科技有限公司。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)α抗體購于艾博抗生物有限公司。β-actin抗體購于博士德生物有限公司。

動物與飼養(yǎng)8周齡雄性C57BL/6J小鼠購于四川大學動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2018- 026。C57BL/6J雄鼠喂養(yǎng)于四川大學華西公共衛(wèi)生學院實驗動物中心，許可證：SYXK(川)2018- 011，晝夜交替時間10/14 h，溫度26 ℃，相對濕度60%。動物實驗方案已通過四川大學華西醫(yī)學中心倫理審查(編號：K2021027)。

三氯生作用靶點預測在Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取三氯生三維結構與SMILES式，導入PharmMapper、HTDocking、HitPick和SuperTarget，預測三氯生的作用靶點。

非酒精性脂肪性肝病靶點的獲取以NAFLD的ICD- 10代碼 “K76.001”、“Non-alcoholic fatty liver diseases”作為關鍵詞，限定種屬“Homo sapiens(人類)”，在TTD、OMIM、Genecards數(shù)據(jù)庫進行疾病靶點的檢索，篩選NAFLD疾病靶點。

三氯生與NAFLD共同靶點的蛋白質網(wǎng)絡構建使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將三氯生作用蛋白與NAFLD疾病靶點通過蛋白-基因名稱轉換后進行交集分析獲取共同靶點，使用R Project作韋恩圖。使用String平臺對共同靶點進行“蛋白-蛋白”相互作用分析，利用Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化，構建共同靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖，篩選出三氯生治療NAFLD潛在靶點進行分子對接驗證。

三氯生治療NAFLD潛在靶點的分子對接驗證使用UCSF Chimera與Auto Dock Tool兩種分子對接軟件進行分子對接驗證。將三氯生治療NAFLD潛在靶點的PDB ID輸入UCSF Chimera與Auto Dock Tool軟件，計算三氯生與各蛋白的結合能，篩選能與三氯生穩(wěn)定結合的靶點。

三氯生與NAFLD共同靶點的生物過程與通路分析對篩選出的三氯生與NAFLD共同靶點進行基因本體(gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，使用R Project進行可視化，探究靶點富集的生物過程和信號通路，結合分子對接結果篩選關鍵靶點。

動物實驗方案適應性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為空白對照組(n=10)、模型組(n=10)和三氯生組(n=10)，小鼠自由攝食和飲水?？瞻讓φ战M使用普通飼料，模型組與三氯生組使用高脂飼料，飼養(yǎng)12周。建立NAFLD模型后三氯生組每日灌胃400 mg/(kg·d)劑量的三氯生混懸液；模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，按0.01 ml/g的灌胃體積連續(xù)灌胃8周；空白對照組繼續(xù)飼喂普通飼料。給藥結束，禁食不禁水12 h，處死小鼠，收集小鼠肝臟。每只小鼠剪取肝臟相同部位，10%中性甲醛組織固定液中固定24 h后由武漢賽維爾生物科技有限公司進行HE染色與油紅O染色。稱取133 mg肝臟組織，加入1000 μl蛋白裂解液提取蛋白，并采用蛋白質免疫印跡法檢測小鼠肝組織中PPARα蛋白水平。

結 果

三氯生治療NAFLD潛在靶點的網(wǎng)絡構建與分析本文探究三氯生治療NAFLD靶點的網(wǎng)絡藥理學研究流程見圖1。通過網(wǎng)絡藥理學共獲得319個三氯生作用靶點和351個NAFLD疾病靶點，取交集后獲得34個共同靶點(表1)。將34個靶點導入String并使用Cytoscape3.7.1計算每個靶點的Degree值并進行可視化。Degree值表示靶點在整個網(wǎng)絡中與其他靶點的關聯(lián)強度，數(shù)值越大表明靶點在整個網(wǎng)絡具有更核心的地位，更具研究價值。結果顯示34個靶點的平均Degree值為10.38，其中ALB、AKT1、PPARG、IGF1、F2、MAPK8、FABP4、HMOX1、MPO、CASP3、ACE、APP、PPARA、STAT1、FASN、EGFR、SOD2、TTR、MMP2這19個基因的Degree值大于均值，節(jié)點更大、顏色更紅(圖2)，表明它們可能是三氯生治療NAFLD的潛在靶點，需要通過分子對接進一步驗證。

1個圓形代表1個節(jié)點，在蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡圖中，Degree值越大，節(jié)點越大、越紅

三氯生與潛在靶點的分子對接結果潛在靶點與三氯生結合越穩(wěn)定，成藥潛力越大，因此，本文采用分子對接技術分析三氯生與上述19個潛在靶點蛋白的結合能。結合能<0 kcal/mol表明三氯生可與受體蛋白自發(fā)結合，能量越低結合構象越穩(wěn)定。三氯生與19個潛在靶點蛋白均能自發(fā)穩(wěn)定結合，其中UCSF Chimera對接得分顯示，PPARA、ALB對應蛋白質與三氯生的結合能最低，Auto Dock Tool結果顯示MAPK8對應蛋白質的結合能最低(表2)，表明PPARA、ALB、MAPK8對應的靶點蛋白與三氯生結合構象最穩(wěn)定。

表2 三氯生與潛在靶點蛋白的分子對接得分

三氯生與NAFLD共同靶點的GO分析與KEGG通路分析為確定三氯生發(fā)揮作用的關鍵通路，對篩選出的34個三氯生和NAFLD的共同靶點分別進行KEGG通路和GO分析。KEGG通路分析顯示，34個共同靶點富集在PPAR信號通路、癌癥通路和丙型肝炎相關通路等10條信號通路(圖3)。其中，PPAR信號通路主要參與脂肪酸氧化分解代謝，是共同靶點高度富集的通路。GO分析表明，34個靶點的生物過程包含機體對營養(yǎng)素的敏感度、羧酸代謝、脂質轉運和細胞脂質分解等(圖4)；此外，這些靶點還與細胞和脂質及激素的結合、核受體的活性、抗氧化能力等生物功能相關。

圖3 三氯生與NAFLD共同靶點的KEGG分析

圖4 三氯生與NAFLD共同靶點的GO分析

三氯生對NAFLD小鼠肝臟組織學形態(tài)與脂肪沉積的影響HE染色結果顯示，空白對照組小鼠肝臟細胞正常，肝索清晰；模型組可見肝臟細胞出現(xiàn)大量氣球樣變，細胞邊界模糊，肝索消失，可見大量脂肪空泡；三氯生給藥8周后，三氯生組小鼠肝臟細胞氣球樣變與脂滴空泡逐漸減少(圖5)。油紅O染色結果可見，空白對照組小鼠肝細胞質與細胞核藍染；模型組小鼠肝細胞核藍染，胞質內(nèi)聚集大量紅染的脂滴，三氯生給藥后小鼠肝臟中紅色脂滴顆粒顯著變小、變少(圖5)。使用Image Pro Plus 6.0軟件計算油紅O染色脂滴面積與總面積的比值(即脂滴面積比)，結果顯示空白對照組小鼠肝臟脂滴面積比為0.01%，模型組小鼠肝臟脂滴面積比為59.99%，三氯生組小鼠肝臟的脂滴面積比為10.26%。與模型組相比，三氯生干預后小鼠肝臟的脂滴面積比下降了82.90%(F=96.952，P<0.001)。

圖5 小鼠肝臟HE染色與油紅O染色結果(×200)

三氯生對NAFLD小鼠肝臟組織中PPARα蛋白水平的影響與空白對照組相比，模型組小鼠PPARα蛋白水平增加了62.66%(F=44.233，P<0.001)；與模型組相比，三氯生給藥后小鼠肝臟PPARα蛋白水平增加了133.90%(F=26.460，P<0.001)(圖6)。

PPARα：過氧化物酶體增殖物激活受體α；Mr：相對分子質量

討 論

本研究初步預測到34個三氯生與NAFLD的共同靶點，通過蛋白質相互作用分析篩選出19個潛在靶點，并通過分子對接與KEGG分析的進一步篩選，發(fā)現(xiàn)PPARα是三氯生治療NAFLD的關鍵靶點。蛋白質相互作用篩選出的19個潛在靶點中，SOD2與MPO參與細胞氧化應激，MMP2、EGFR參與NAFLD進展形成肝纖維化[6]，PPARG、PPARA、AKT1、MAPK8、ACE、ALB等基因與糖脂代謝紊亂有關[5，7- 9]，F(xiàn)ASN促進肝臟脂肪酸合成[2]，表明三氯生可能是一個多靶點藥物。分子對接可根據(jù)三氯生與各靶點蛋白結合的穩(wěn)定程度判斷更易結合并發(fā)揮作用的靶點，結果提示PPARA、ALB以及MAPK8相應靶蛋白與三氯生結合穩(wěn)定。PPARA翻譯出PPARα，參與調(diào)控肝臟脂肪酸氧化分解[10]，是肝臟脂肪含量減少的重要途徑。白蛋白(albumin，ALB)可作為NAFLD肝纖維化早期預測的血清標志物，用于評估肝臟功能受損情況[11]，由于ALB變化不具有特異性[12]，難以作為NAFLD的治療靶點。MAPK8參與高脂飲食誘導的小鼠糖脂代謝紊亂，是治療肥胖的潛在靶點[13]，但MAPK8可否改善NAFLD仍待確證。KEGG通路分析結果高度集中于PPAR信號通路，提示三氯生最可能通過PPAR信號通路發(fā)揮治療NAFLD作用，ALB與MAPK8未參與該通路，表明PPARα可能是所有潛在靶點中最具希望的靶點。PPAR信號通路包含3種不同的類型，其中PPARα主要在肝臟組織表達，是肝臟脂肪酸氧化分解的關鍵調(diào)控分子[2]。有研究顯示PPARα可以激活下游酶體如肉毒堿棕櫚酰轉移酶- 1使脂肪酸進入線粒體氧化分解，減少肝臟脂肪酸含量[2]。高脂飼料飼喂C57BL/6雌鼠8周，子代雄鼠肝臟PPARα蛋白表達均降低，肝臟出現(xiàn)脂肪變性[5]；使用添加PPARα激活劑的高脂飼料飼養(yǎng)子代雄鼠，肝臟脂肪變性明顯改善[5]。這些結果充分表明激活PPARα可以增強脂肪酸氧化分解、降低肝臟脂肪含量，達到治療NAFLD的作用。研究顯示三氯生可以激活小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7中的PPARα[4]；動物實驗顯示三氯生能夠激活小鼠肝臟中的PPARα，增加細胞色素P4504A等參與脂肪酸代謝的酶的表達[14]，表明三氯生可能通過激活PPARα改善NAFLD。

肝臟脂肪酸合成是肝臟脂肪的主要來源，F(xiàn)ASN直接調(diào)控肝臟脂肪酸合成，因此，抑制FASN可以減少肝臟脂肪含量。重組腺病毒介導miRNA- 27a的過表達可以抑制肝臟中FASN mRNA的表達，從而抑制油酸鈉誘導的小鼠原代肝細胞三酰甘油的積累，降低雄性C57BL/6J小鼠肝臟中三酰甘油的含量[15]；此外，生物信息學分析提示FASN可能是NAFLD的治療靶點[16]，提示抑制FASN可以降低肝臟脂肪含量。筆者前期的體外實驗顯示三氯生可以抑制肝細胞FASN mRNA和蛋白水平，減少細胞內(nèi)脂肪含量[17]，表明三氯生可以通過抑制FASN改善NAFLD肝臟脂肪變性。但KEGG分析并未富集到FASN等與脂肪酸合成途徑相關的通路，但分子對接結果顯示三氯生可以與FASN穩(wěn)定結合，因此不能簡單否定三氯生對FASN的抑制作用。肝臟脂肪酸代謝主要包含脂肪酸的來源與排出兩個重要環(huán)節(jié)，其中FASN介導肝臟脂肪酸從頭合成，是肝臟脂肪重要來源；PPARα調(diào)控脂肪酸氧化，是肝臟脂肪減少的關鍵途徑；脂肪酸合成與氧化的紊亂則被認為是NAFLD的關鍵發(fā)病機制[2]。若能抑制脂肪酸攝取與合成、增強脂肪酸氧化代謝，理論上可以達到治療NAFLD的效果。然而，單獨激活PPARα增強脂肪酸氧化會導致脂肪酸過氧化物酶體β氧化和內(nèi)質網(wǎng)ω氧化代償性增加，產(chǎn)生活性氧加速疾病進展[2]；而肝臟從頭合成的脂肪酸是激活PPARα的重要配體，完全敲除肝臟FASN會導致小鼠肝內(nèi)脂肪酸生成障礙，使PPARα因缺乏配體無法被激活，脂肪酸因此無法被正常氧化分解，引起肝臟脂肪變性[18]，因此，同時抑制FASN和激活PPARα，可避免上述單靶點治療NAFLD的不足，是極具希望的聯(lián)合靶點治療方向。

肝細胞氣球樣變、肝臟脂肪變性是NAFLD基本病理改變[19]，本研究模型組小鼠肝臟HE染色顯示肝臟出現(xiàn)大量脂滴空泡伴氣球樣變，三氯生組小鼠肝臟脂滴空泡幾乎消失。油紅O可將肝臟脂滴染為橘色，以此可直接觀察肝臟脂肪沉積，本研究模型組可見大面積的大顆粒橘紅色脂滴，三氯生干預后脂滴面積減少、顆粒顯著減小，表明三氯生可以有效降低肝臟脂肪含量。這些結果提示三氯生可以有效改善NAFLD小鼠肝臟病變。進一步對PPARα的表達水平進行檢測，結果顯示高脂飲食增加NAFLD小鼠肝臟PPARα蛋白水平的表達，表明NAFLD小鼠肝臟脂肪酸分解加強，這是由脂肪過度沉積引起的代償反應[2]；在三氯生處理后，小鼠肝臟的PPARα蛋白水平與模型組相比增加，表明三氯生可以促進PPARα水平增加，可能通過激活PPARα改善NAFLD。

借助網(wǎng)絡藥理學，本研究預測到三氯生可能激活脂肪酸氧化的新的關鍵調(diào)控蛋白PPARα，并在動物實驗中首次揭示三氯生治療NAFLD的作用，驗證三氯生可以提高PPARα蛋白表達水平。這些結果提示三氯生可能具有“雙管齊下”減少肝臟脂肪含量的潛力，是既可減少脂肪酸合成還可能增加脂肪酸氧化分解的雙靶點藥物候選。事實上，雙靶點藥物是更具價值和希望的NAFLD治療藥物的開發(fā)方向，本研究為將三氯生開發(fā)成為NAFLD雙靶點藥物提供了重要依據(jù)。網(wǎng)絡藥理學挖掘的靶點僅為理論的作用靶點，必須進行嚴格的動物實驗與臨床檢驗[20]，因此，在臨床中闡明三氯生的治療效果是未來的必經(jīng)之路。