紫堇靈對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、干性以及凋亡的影響

李施霖，孔祥溢，方 儀

國(guó)家癌癥中心 國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院乳腺外科，北京 100021

隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展，雖然癌癥的治療手段越來(lái)越先進(jìn)，但癌癥尤其是乳腺癌的發(fā)病率卻始終居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅2020年，全球乳腺癌新發(fā)病例約226萬(wàn)，我國(guó)新發(fā)乳腺癌病例則超過(guò)40萬(wàn)，全球死亡病例68萬(wàn)，且發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]。乳腺癌嚴(yán)重危害女性身心健康，其中三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌中惡性程度最高的類(lèi)型，約占診斷出乳腺癌病例的15%～20%[2]。TNBC中雌激素受體、孕激素受體及人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體- 2均為陰性，缺乏治療靶點(diǎn)，且易發(fā)生化療耐藥，傳統(tǒng)化療藥物治療效果較差，因此尋找新型治療藥物十分必要。天然產(chǎn)物來(lái)源廣、毒性小、副作用少，是篩選新型化療藥物的理想來(lái)源。近年各領(lǐng)域均更傾向于應(yīng)用天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)藥物[3]。布氏紫堇為多年生草本植物，分布于中國(guó)北部和東部、蒙古的東南部、朝鮮半島的北部和俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)等[4]。干燥的整株布氏紫堇在中國(guó)傳統(tǒng)中藥中稱(chēng)之為苦地丁，苦地丁多用于抗炎、清熱解毒以及涼血消腫。而紫堇靈是提取自布氏紫堇干燥根帶全草的一種生物堿類(lèi)，也是布氏紫堇的主要活性成分之一[5]。有研究顯示，紫堇靈的抗炎作用是由c-Jun氨基末端激酶和p38磷酸化的抑制介導(dǎo)的，而不是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2磷酸化，這些磷酸化事件又受到核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化響應(yīng)元件通路的調(diào)控[6]。紫堇靈還可在關(guān)節(jié)炎大鼠模型中通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用[7]。從中醫(yī)學(xué)的角度來(lái)講，腫瘤與體內(nèi)毒邪有關(guān)，一般使用清熱解毒藥物加以治療，而腫瘤本身又可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，炎癥反應(yīng)又反過(guò)來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此，抑制炎癥反應(yīng)可以在一定程度上扼制腫瘤的發(fā)展。目前對(duì)紫堇靈抗腫瘤的研究較少，僅報(bào)道了紫堇靈對(duì)于黑色素瘤的抑制作用：經(jīng)紫堇靈處理的黑色素瘤細(xì)胞系活性氧增多，凋亡增加，細(xì)胞周期被阻滯于G2期，可被作為治療黑色素瘤的潛在藥物[6]。紫堇靈在TNBC中的抗癌作用報(bào)道更少。本研究通過(guò)CCK- 8法、Western blot等方法，探究紫堇靈對(duì)TNBC細(xì)胞增殖、干性、凋亡以及侵襲、轉(zhuǎn)移的作用，以明確紫堇靈對(duì)TNBC細(xì)胞的作用及機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的抗TNBC藥物提供候選對(duì)象并奠定研究基礎(chǔ)。

材料和方法

材料紫堇靈(1 mg，純度 98.17%)購(gòu)于上海陶素生化科技有限公司，以10 mmol/L的濃度溶解在二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，于-80 ℃儲(chǔ)存(圖1)。

圖1 紫堇靈化學(xué)結(jié)構(gòu)式

細(xì)胞培養(yǎng)MDA-MB- 436細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)，在含10% 胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，飽和濕度培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)。MCF- 10A細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)，在含5% 馬血清、1%青霉素-鏈霉素2 mmol/L谷氨酰胺、20 μg/L生長(zhǎng)因子、 100 μg/L霍亂霉素、0.01 g/L胰島素、500 μg/L氫化可的松的DMEM-F12培養(yǎng)基中，飽和濕度培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)。

CCK- 8檢測(cè)細(xì)胞活力以 4×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度將MDA-MB- 436 細(xì)胞接種在 96 孔板中。 24 h后，加入不同濃度的紫堇靈(0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μmol/L)培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)終止，每孔加入10 μl CCK- 8試劑和100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，孵育1 h。使用96孔熱循環(huán)儀測(cè)量 450 nm 處的光密度值。

細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)以4.0×103/孔的密度將MDA-MB- 436細(xì)胞接種于6孔板中，用不同濃度的紫堇靈(1、2、5 μmol/L)處理細(xì)胞，并將加入等體積的DMSO處理者作為對(duì)照組。10 d后，將細(xì)胞用甲醇固定并用結(jié)晶紫染色。洗去多余的染料后，在倒置顯微鏡下拍照，按一定標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)細(xì)胞形成的克隆數(shù)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡膜聯(lián)蛋白 V-熒光素異硫氰酸酯/碘化丙啶雙標(biāo)記用于確定紫堇靈對(duì)MDA-MB- 436細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。以每孔 5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度將MDA-MB- 436細(xì)胞接種于6孔板中，并以3、5 μmol/L的紫堇靈處理細(xì)胞24 h。然后用胰酶將細(xì)胞消化，離心，收集，用熒光素異硫氰酸酯偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞凋亡，并使用軟件(美國(guó)BD 生物科學(xué)細(xì)胞探索研究 6.1.3)分析數(shù)據(jù)。

蛋白質(zhì)印跡分析使用蛋白裂解液(購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司)從MDA-MB- 436細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。使用BSA測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。本研究采用的分離膠濃度為10%，上樣量為20 μg蛋白質(zhì)。采用70 V電壓，待蛋白樣品越過(guò)濃縮膠并且大約呈一條直線時(shí)，將電壓調(diào)升至100 V，直至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到 聚偏二氟乙烯膜。轉(zhuǎn)膜條件：4 ℃，轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5%脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯膜，并以抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(1∶1000)、抗剪切的-半胱氨酸蛋白酶 3(1∶800)、抗β-actin(1∶3000)、抗八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor- 4，Oct- 4)(1∶1000)，抗Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor- 4，KLF4)(1∶800)，抗人胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白2(SRY-related high-mobility-group-box protein- 2，SOX2)(1∶800)，抗重組人B細(xì)胞淋巴瘤因子2 XL(recombinant human B-cell leukemia/lymphoma XL，Bcl-XL)(1∶1000)，抗髓樣細(xì)胞白血病蛋白- 1(myeloid cell leukemia- 1，MCL- 1)(1∶1000)抗體4 ℃過(guò)夜孵育，然后加入二抗(1∶4000)在室溫下孵育1.5～2 h。使用普通曝光液和增強(qiáng)曝光液(均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司)對(duì)條帶進(jìn)行顯影。此外，β-actin用于量化蛋白質(zhì)的數(shù)量和完整性。使用ImageJ 1.8.0(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)量化條帶的灰度。

細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移按照1.2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度，將MDA-MB- 436細(xì)胞接種至由聚碳酸酯過(guò)濾器隔開(kāi)的24孔碳酸脂膜板的上室。在上室添加無(wú)血清培養(yǎng)基(其中實(shí)驗(yàn)組加入3 μmol/L紫堇靈，對(duì)照組加入等體積DMSO)，下室則添加含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基。24 h后，棄去上室細(xì)胞，并用 0.5% 結(jié)晶紫將細(xì)胞在4 ℃固定染色24 h，使用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析用紫堇靈(3 μmol/L)處理MDA-MB- 436細(xì)胞。使用Trizol收集樣本并將其郵寄至明碼(上海)生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 SPSS 26.0和 Prism 8.0.1中的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

半數(shù)抑制濃度根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制曲線并得出紫堇靈的半數(shù)抑制濃度為(4.209±0.898)μmol/L(圖2)。

圖2 紫堇靈在MDA-MB- 436細(xì)胞中24 h的半數(shù)抑制濃度

細(xì)胞增殖CCK- 8檢測(cè)顯示，紫堇靈可以抑制MDA-MB- 436細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)時(shí)間與濃度依賴(lài)性(圖3)。另外，相應(yīng)濃度的紫杉醇與紫堇靈對(duì)人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF- 10A具有相似的抑制效應(yīng)(圖4)。經(jīng)過(guò)紫堇靈處理后，TNBC細(xì)胞MDA-MB- 436中的干性相關(guān)蛋白的表達(dá)量下降，且藥物作用濃度越高，干性蛋白表達(dá)量下降越多(圖5)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫堇靈可以減少M(fèi)DA-MB- 436細(xì)胞克隆數(shù)量的形成，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，進(jìn)一步證實(shí)紫堇靈可對(duì)TNBC細(xì)胞的干性產(chǎn)生抑制(圖6)。

圖3 不同濃度紫堇靈處理的MDA-MB- 436細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖4 不同濃度紫堇靈與紫杉醇對(duì)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF- 10A生長(zhǎng)的影響

SOX2：抗人胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白2；Oct4：八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4；KLF4：Kruppel樣因子4；Mr：相對(duì)分子質(zhì)量；DMSO：二甲基亞砜；1：DMSO；2：3 μmol/L紫堇靈；3：5 μmol/L紫堇靈

圖6 不同濃度紫堇靈處理后MDA-MB- 436細(xì)胞克隆形成情況

細(xì)胞凋亡Western blot檢測(cè)顯示，經(jīng)過(guò)紫堇靈處理后，聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)和剪切的半胱氨酸天冬酶 3蛋白表達(dá)量增高，而B(niǎo)cl-XL和MCL- 1蛋白表達(dá)量減少(圖 7)。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，紫堇靈可以促進(jìn)TNBC細(xì)胞發(fā)生凋亡，且藥物作用濃度越高，凋亡越顯著(圖8)。

PARP：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；Bcl-XL：重組人B細(xì)胞淋巴瘤因子2 XL；MCL- 1：髓樣細(xì)胞白血病蛋白- 1；1：DMSO；2：3 μmol/L紫堇靈；3：5 μmol/L紫堇靈

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度紫堇靈處理MDA-MB- 436細(xì)胞時(shí)細(xì)胞凋亡情況

侵襲和轉(zhuǎn)移細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測(cè)結(jié)果顯示，紫堇靈對(duì)MDA-MB- 436細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力無(wú)影響(圖9)。

圖9 紫堇靈對(duì)MDA-MB- 436細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響

RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果經(jīng)過(guò)紫堇靈處理后的TNBC細(xì)胞與對(duì)照組相比，二者的差異表達(dá)基因的生物學(xué)過(guò)程主要富集在氧化磷酸化、電子轉(zhuǎn)移等方面。分子功能主要富集在NADH脫氫酶的活性，而細(xì)胞成分則富集在呼吸鏈中(圖10)。京都基因與基因組百科全書(shū)通路富集分析顯示，差異表達(dá)基因主要富集在氧化磷酸化通路中(圖11)。

圖10 基因本體論富集分析結(jié)果

圖11 京都基因與基因組百科全書(shū)通路富集分析

討 論

紫堇靈是苦地丁的有效活性成分，常用于抗炎、清熱解毒，既往研究顯示，其在大鼠模型中可有效抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[5]。但目前尚無(wú)紫堇靈在抗乳腺癌領(lǐng)域中的研究。本研究用不同濃度的紫堇靈處理TNBC細(xì)胞不同的時(shí)長(zhǎng)，觀察細(xì)胞表型(包括增殖、干性、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移)，結(jié)果顯示紫堇靈可以抑制TNBC細(xì)胞的增殖，具有時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。同時(shí)，還可以促進(jìn)TNBC細(xì)胞的凋亡，呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。此外，本研究以正常乳腺上皮作為對(duì)照，證明紫堇靈對(duì)正常乳腺上皮無(wú)抑制作用，且與目前臨床化療用藥紫杉醇相當(dāng)，表明紫堇靈對(duì)正常乳腺上皮細(xì)胞的毒副作用有限并可以被接受。

紫堇靈可以降低干性相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。SOX2在細(xì)胞發(fā)育的所有階段均發(fā)揮重要作用。有研究證明，SOX2的過(guò)表達(dá)和基因擴(kuò)增與多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，SOX2常用于在乳腺癌中定義分化程度較低的“干細(xì)胞表型”[8- 9]。Oct4可在多種腫瘤細(xì)胞中被檢測(cè)到，并且在腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)；研究顯示治療后殘留的乳腺癌細(xì)胞中Oct4的表達(dá)顯著增加[10- 11]，這些都表明Oct4與腫瘤細(xì)胞的干性有關(guān)。KLF4也已被證明可用作多種腫瘤細(xì)胞的干性標(biāo)記物。提示紫堇靈可抑制TNBC細(xì)胞的干性。

紫堇靈可以影響多種凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)：PARP、剪切的半胱氨酸天冬酶和MCL- 1等，并能通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。PARP是一種DNA修復(fù)酶，可以修復(fù)DNA。PARP是細(xì)胞凋亡核心成員半胱氨酸天冬酶的裂解底物，在DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮主要作用。PARP被剪切，表明細(xì)胞凋亡正在發(fā)生[12]。半胱氨酸天冬酶3是一種蛋白酶，其剪切體被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡發(fā)生的通用標(biāo)志物和細(xì)胞毒性淋巴T細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。大多數(shù)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的事件和生化過(guò)程都與半胱氨酸天冬酶3相關(guān)[13- 15]。Bcl-XL是Bcl- 2家族的一種抗凋亡蛋白，可與線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵分子結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡[16- 17]；有研究表明，Bcl-XL可以通過(guò)破壞誘導(dǎo)死亡的信號(hào)復(fù)合物的形成，從而使半胱氨酸蛋白酶- 8失活，進(jìn)而抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。另一方面，Bcl-XL還可以通過(guò)與Bcl- 2家族的促凋亡成員Bax相互作用抑制細(xì)胞凋亡[19]。此外，Bcl- 2家族的抗凋亡蛋白MCL- 1最初發(fā)現(xiàn)于分化的髓系細(xì)胞中[20]，在高度分化的上皮細(xì)胞(如乳腺、肺上皮細(xì)胞等)的頂端層更為常見(jiàn)。MCL- 1的表達(dá)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中降低，半胱氨酸天冬酶介導(dǎo)的切割可能與MCL- 1的下調(diào)有關(guān)。MCL- 1在惡性細(xì)胞的存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其活性降低影響細(xì)胞的活力。其中PARP和剪切的半胱氨酸天冬酶3為促凋亡蛋白，而B(niǎo)cl-XL和MCL- 1為抑制凋亡蛋白，表明紫堇靈可以促進(jìn)TNBC細(xì)胞MDA-MB- 436發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)藥物濃度依賴(lài)性。本研究顯示高濃度藥物治療組相比于低濃度組和對(duì)照組，促凋亡蛋白的表達(dá)量明顯高于低濃度組，而高濃度藥物治療組抗凋亡蛋白的表達(dá)則受到抑制。表明紫堇靈可以顯著增強(qiáng)MDA-MB- 436細(xì)胞的凋亡途徑，從而抑制TNBC細(xì)胞的生長(zhǎng)。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)相關(guān)分析，推測(cè)紫堇靈可能靶向氧化磷酸化途徑發(fā)揮抗癌活性。而且，其抗炎特性可能對(duì)腫瘤引起的炎癥反應(yīng)發(fā)揮抑制作用，從而更好地抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Weinburg等[21]研究顯示線粒體和活性氧與KRAS介導(dǎo)的腫瘤形成密切相關(guān)。另有研究顯示TNBC中的耐藥干細(xì)胞可以通過(guò)MYC和MLC1基因的擴(kuò)增，上調(diào)腫瘤細(xì)胞的氧化磷酸化水平[22]。另外，在體外和異種移植模型中已經(jīng)被證實(shí)，抑制氧化磷酸化水平可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，這為未來(lái)的抗腫瘤治療提供了潛在的選擇與方向[23]。由此，筆者大膽猜想紫堇靈可能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化磷酸化途徑發(fā)揮抗TNBC的作用。

考慮到時(shí)間、培養(yǎng)條件、設(shè)備以及經(jīng)費(fèi)等客觀條件的限制，本研究未對(duì)RNA-Seq測(cè)序得出的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

針對(duì)紫堇靈相關(guān)的進(jìn)一步研究，筆者認(rèn)為可從以下幾方面進(jìn)行：(1)本研究?jī)H在1個(gè)TNBC細(xì)胞系中進(jìn)行，若想得到深入的研究結(jié)論還應(yīng)在其他更多的TNBC細(xì)胞系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；(2)需要在多個(gè)其他TNBC細(xì)胞系中對(duì)紫堇靈進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估、藥理研究以及藥物毒性的評(píng)價(jià)。若體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想，為了探索紫堇靈的臨床藥用價(jià)值，需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，甚至是臨床藥物試驗(yàn)；(3)針對(duì)紫堇靈作用機(jī)制的探索，可以從氧化磷酸化通路出發(fā)，檢測(cè)藥物作用前后通路中相關(guān)酶活性的變化，通過(guò)酶活性的差異繼續(xù)探究具體的作用機(jī)制(例如紫堇靈可特定靶向作用于某種酶)；(4)紫堇靈與目前臨床用藥(如紫杉醇)聯(lián)合使用的療效以及紫堇靈是否可以對(duì)化療藥物發(fā)揮增敏的效果也是未來(lái)值得探索的方向。

綜上，紫堇靈作為苦地丁的有效成分，可抑制MDA-MB- 436細(xì)胞的增殖與干性，并促進(jìn)其發(fā)生凋亡。此外，這些抗癌作用可能都與紫堇靈對(duì)氧化磷酸化通路的調(diào)控相關(guān)。本研究為未來(lái)在臨床中使用紫堇靈治療TNBC提供了新的理論基礎(chǔ)，并為T(mén)NBC的治療提供了新的思路。