綿羊胚胎移植供體胚胎群體化早期退化案例分析

劉伯河，楊杜錄，崔國賢，車隴杰，韓芙蓉

(1.甘肅省畜牧技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730030；2.寧縣大禹肉羊養(yǎng)殖有限公司)

應(yīng)用生物工程技術(shù)，在短期內(nèi)較快增加優(yōu)質(zhì)種羊數(shù)量，滿足廣大養(yǎng)殖者對良種的需求，是當(dāng)前促進(jìn)羊產(chǎn)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革迫切需要解決的問題。為構(gòu)建產(chǎn)學(xué)研相結(jié)合,育繁推一體化的現(xiàn)代種業(yè)體系，結(jié)合祁連山淺山區(qū)肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求與實(shí)際，打造“科技平臺(tái)+制種企業(yè)+合作社+牧區(qū)繁育戶”優(yōu)質(zhì)種羊聯(lián)合繁育培育模式。在工作推進(jìn)中，筆者遇到供體羊胚胎早期群體退化現(xiàn)象，現(xiàn)就案例進(jìn)行剖析，以拋磚引玉，趨利避害。

1 胚胎早期退化案例簡述

1.1 供體羊所在地自然概況

甘肅大禹農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司(以下簡稱“大禹”)位于隴東黃土高原慶陽市寧縣和盛鎮(zhèn)，年均降雨量500 mm，年均氣溫9℃，全年無霜期160 d，平均海拔1 170 m，主要種植農(nóng)作物為小麥、玉米、瓜菜和小雜糧，素有“隴東糧倉”之美稱。

1.2 胚胎移植所在地自然概況

肅南縣皇城鎮(zhèn)藍(lán)天牧業(yè)藏羊養(yǎng)殖合作社(以下簡稱“藍(lán)天合作社”)，位于祁連山冷龍嶺東端，屬溫帶濕潤山地草原氣候，平均海拔2 750 m，年日照時(shí)數(shù)2 211 h，年平均氣溫0.6～3.8℃，枯草期7個(gè)月以上，年降水量在361.6 mm之間，絕對無霜期45～60 d。草原面積2 897 km2，可利用草原面積2 115.27 km2，主要屬高山灌叢草場、草甸草場、草原草場。牛羊養(yǎng)殖是該地經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。

肅南縣樺樹林生態(tài)養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社(以下簡稱“樺樹合作社”)，位于康樂鄉(xiāng)樺樹彎村，屬濕潤高寒氣候，山巒重疊，溝壑縱橫，平均海拔2 300 m，年平均氣溫1～3℃，無霜期70～120 d，年日照2 683 h，年降雨量250～350 mm。山地植被較好，草原大體屬草甸草場、草原草場、半荒漠草場，草原面積1 766.67 km2，可利用草原1 466.67 km2，森林面積約300 km2。草食畜牧業(yè)是該地經(jīng)濟(jì)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。

1.3 時(shí)間地點(diǎn)與氣候

樺樹合作社于2018年9月14～17日進(jìn)行供體、受體羊同期發(fā)情處理，10月10～13日進(jìn)行沖胚與移植；天氣晴或多云，氣溫12～14℃/ -3～1℃，西北風(fēng) 3～4級/西北風(fēng)居多。藍(lán)天合作社于2018年10月8～25日進(jìn)行供體、受體羊同期發(fā)情處理，11月3～20日進(jìn)行沖胚與移植；天氣晴或多云居多，氣溫8～11℃/-8～-3℃，西北風(fēng)3～5級/西北風(fēng)居多，其中：10月13日小雨/雨夾雪，10月18日，多云/雨夾雪，雪后1～2 d最低溫度下降-3～-5℃。

1.4 材料與方法

1.4.1 供體羊品種 樺樹合作社供體羊品種為黑頭杜泊，藍(lán)天合作社供體羊品種為白頭杜泊、黑頭薩福克，由甘肅大禹農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司(以下簡稱“大禹”)提供。

1.4.2 供體羊運(yùn)輸與飼養(yǎng)管理 樺樹合作社胚胎移植的供體羊，大禹公司于2018年9月15日拉運(yùn)到目的地進(jìn)行舍飼，早、中、晚一日3次飼喂自行配制的日糧，經(jīng)過15 d過渡性飼養(yǎng)，胚移時(shí)羊群膘情與運(yùn)輸前基本一致。公母羊分群飼養(yǎng)管理，供體羊沖胚后經(jīng)短暫的休息趕回原圈舍，飼養(yǎng)管理同手術(shù)前。藍(lán)天合作社胚胎移植的供體羊，于2018年9月20日拉運(yùn)到目的地進(jìn)行舍飼，自由采食紫花苜蓿、燕麥草和大麥秸稈粉碎粗飼料，早、晚撒喂妊娠母羊?qū)Ｓ醚a(bǔ)充料，補(bǔ)飼量每只400 g/d，未給礦物質(zhì)舔塊。經(jīng)過15 d過渡性飼養(yǎng)，胚移開始時(shí)羊群平均掉膘10 kg左右，膘情明顯差異原飼養(yǎng)地。公母羊分群飼養(yǎng)管理，供體羊沖胚后經(jīng)短暫的休息趕回原圈舍，飼養(yǎng)管理同手術(shù)前。

1.4.3 供體羊同期發(fā)情處理與沖胚 根據(jù)胚胎移植計(jì)劃，每天同期發(fā)情供體羊6只。處理流程：供體母羊第0 d肌注PG，7 d陰道放置CIDR，第16 d 8:00,肌注FSH-5、20:00,肌注FSH-3，第17 d 8:00,肌注FSH-2.5、20:00,肌注FSH-2，第18 d8:00,肌注FSH-1.5、20:00,肌注FSH-1.5，第19 d 8:00,肌注FSH-1、供體羊撤栓，20:00,肌注FSH-1、肌注PG，第20 d配種前停食，第21 d采用腹腔鏡輸卵管常溫人工授精配種、肌注A3，第25 d沖胚前停食，第26 d手術(shù)輸卵管沖胚。

1.4.4 胚胎鏡檢 供體羊沖胚后，立刻在20～25℃檢胚室用體視顯微鏡檢查胚胎，并按形態(tài)鑒定方法分為可用胚胎、不可用胚胎，并做好詳細(xì)記錄，鏡檢員始終由一人操作。

1.5 方法

比較同一品種供體羊在不同生態(tài)環(huán)境和飼養(yǎng)條件下的沖胚數(shù)和可用胚胎數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每只供體羊沖胚總數(shù)、可用胚胎、不可用胚胎(退化胚、未受精卵和變性胚)。

2 結(jié)果

2.1 羊均沖胚數(shù)量

從表1統(tǒng)計(jì)顯示，在大禹公司不同品種平均沖胚數(shù)黑頭薩?？俗疃?0.89枚，依次黑頭杜泊8.46枚為白頭杜泊7.50枚，分別比對應(yīng)的藍(lán)天、樺樹合作社分別高3.98枚(P<0.01)、1.40枚(P>0.05)和2.26枚(P<0.05)，不同品種沖胚數(shù)量在遷徙地低于原飼養(yǎng)地。

表1 供體羊沖胚與鏡檢胚胎質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表

2.2 胚胎質(zhì)量

可用胚胎在大禹公司黑頭杜泊、白頭杜泊、黑頭薩?？苏急确謩e比對應(yīng)的樺樹、藍(lán)天合作社高-1.48(P>0.05)、28.43(P<0.01)、44.22(P<0.01)個(gè)百分點(diǎn)。詳見表1。

3 分析與討論

3.1 應(yīng)激反應(yīng)對早期胚胎質(zhì)量的影響分析

應(yīng)激是指機(jī)體在受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時(shí)所出現(xiàn)的非特異性全身反應(yīng)。一般分為反應(yīng)期、抵抗期、衰竭期，本試驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)激原物理性因素有溫度、氣壓、光線等。慢性應(yīng)激時(shí)，消化功能典型變化為食欲降低，嚴(yán)重時(shí)甚至可誘發(fā)神經(jīng)性厭食癥。但從試驗(yàn)供體羊到達(dá)目的地近1月、乃至半年多的采食、排便、運(yùn)動(dòng)、臥息、呼吸、死亡等觀察，與原飼養(yǎng)地相比無異常，說明該應(yīng)激原強(qiáng)度在其機(jī)體負(fù)荷限度內(nèi)，為良性應(yīng)激，不會(huì)對供體羊的生存、繁育造成影響。2019年4月，胚胎移植后供體羊再自然交配的產(chǎn)羔結(jié)果也證實(shí)該結(jié)論。

3.2 日糧營養(yǎng)與羊均沖胚及胚胎質(zhì)量

丁文廣研究認(rèn)為，誘導(dǎo)胚胎死亡的內(nèi)因有遺傳因素、母體激素、胎兒激素和子宮內(nèi)膜發(fā)生有利于胚胎發(fā)育的條件等，外因有營養(yǎng)、環(huán)境與人工授精操作等，營養(yǎng)引起的胚胎死亡的損失率，遠(yuǎn)比染色體異常引起的為高。在妊娠前或妊娠早期供應(yīng)低水平的營養(yǎng)對青年或成年母畜，均會(huì)在一定程度上影響受精率、胚胎發(fā)育甚至死亡。大量實(shí)驗(yàn)證明一些蛋白質(zhì)和基因在生殖進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，如卵母細(xì)胞成熟、受精、合子基因激活以及胚胎發(fā)育。劉濤等報(bào)道，卵子受精完成后即開始有絲分裂，4～8細(xì)胞期胚胎分裂增殖所需蛋白及mRNA主要由受精前卵細(xì)胞所儲(chǔ)存，能量代謝以利用丙酮酸為主；維生素E、維生素C和金屬硫蛋白(MT)具有抗氧化、清除自由基、抗凋亡和抗衰老等多方面的功能，對早期胚胎凋亡起到一定的抑制作用。母羊在發(fā)情前卵細(xì)胞形成和配種后精卵細(xì)胞有絲分裂階段，日糧中蛋白質(zhì)及VE、VC缺乏或滿足不了生理需要，即可加速早期胚胎的凋亡。李秋風(fēng)等研究認(rèn)為動(dòng)物繁殖性能對高蛋白質(zhì)飼糧具有耐受性，但對低蛋白質(zhì)飼糧較為敏感。宋潔等研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致氨基酸代謝失衡，內(nèi)源蛋白質(zhì)分解以補(bǔ)充攝入氨基酸的不足，用于合成更重要的體蛋白質(zhì)，而在營養(yǎng)分配上不占優(yōu)勢的繁殖性能將受限制。本試驗(yàn)藍(lán)天合作社供體母羊同期發(fā)情、沖胚階段，日糧蛋白質(zhì)、VE、VC供給量明顯少于原飼養(yǎng)，且難于滿足相應(yīng)階段對該營養(yǎng)物質(zhì)的需要量，雖然對供體羊平均沖胚數(shù)量無大的影響，但對胚胎質(zhì)量影響明顯。另外，由于羊群從低海拔長途運(yùn)輸?shù)礁吆羺^(qū)，適應(yīng)期不足一個(gè)月，還在應(yīng)激反應(yīng)期期，應(yīng)激時(shí)內(nèi)分泌最明顯的激素是糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺分泌增多，糖皮質(zhì)激素必須由蛋白質(zhì)分解和糖異生作用維持較高水平，因此，這期間也要求日糧必須有足夠量優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，相同供體羊品種、相同沖胚和胚胎鏡檢人員，供體羊在同期發(fā)情前期至沖胚期間，日糧營養(yǎng)的不全面、不均衡導(dǎo)致藍(lán)天合作社供體羊可用胚胎明顯少于樺樹合作社和大禹公司。

3.3 自然環(huán)境與羊均沖胚及胚胎質(zhì)量

胚胎移植供體羊由氣候相對濕潤、溫和、海拔1 200 m的環(huán)境，長途運(yùn)輸?shù)綒夂蛳鄬?、平均海? 300～2 750 m高寒牧區(qū)，雖有應(yīng)激反應(yīng)，但經(jīng)過10～15 d的過渡性適應(yīng)，采食、反芻、站立運(yùn)動(dòng)、臥息等行為表現(xiàn)未發(fā)現(xiàn)明顯異常。相同品種供體羊在樺樹合作社與大禹公司兩地的沖胚數(shù)量及胚胎質(zhì)量基本相同，說明在海拔2 300～2 750 m的高寒牧區(qū)和1 200 m的黃土高原區(qū)對供體羊的胚胎數(shù)量、質(zhì)量相對影響較小。而樺樹合作社和藍(lán)天合作社供體羊可用胚胎數(shù)量差別較大。藍(lán)天合作社比樺樹合作社海拔高400 m，但從供體羊的采食、呼吸和其他行為觀察，未有明顯不同；同期發(fā)情、沖胚時(shí)間，藍(lán)天合作社晚于樺樹合作社15 d，最低氣溫低-5～-8℃，但早晚氣溫最低時(shí)段，羊在舍內(nèi)活動(dòng)，室內(nèi)溫度0℃以上，此溫度不會(huì)對胚胎早期退化造成影響。黃莉等報(bào)道，治療藥物和環(huán)境因素對胚胎早期發(fā)育極為敏感，此時(shí)各種有害因素都可導(dǎo)致胚胎的損傷，甚至丟失。但哺乳動(dòng)物在生理耐受區(qū)間內(nèi)，溫度、海拔、濕度等外環(huán)境對牛羊早期胚胎發(fā)育的影響報(bào)道較少。自然環(huán)境對供體羊早期胚胎質(zhì)量有影響，但在其可承受正常生理區(qū)間，難以造成規(guī)?；脑缙谂咛ネ嘶F(xiàn)象。

表2 日糧營養(yǎng)、環(huán)境氣候與羊均沖胚及胚胎質(zhì)量

4 結(jié)論與建議

4.1 在精、卵細(xì)胞形成及受精卵發(fā)育早期，日糧應(yīng)保持均衡、全面

家畜早期胚胎的凋亡因素包括精、卵細(xì)胞衰老、營養(yǎng)缺乏、微生物感染和炎癥因子刺激等許多理化因素。但保持日糧均衡、全面，防止斷崖式的營養(yǎng)變化是預(yù)防胚胎早期退化的主要舉措，一般來說胚胎移植供體羊在手術(shù)前2個(gè)月應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。

4.2 延長供體羊的過渡期間的適應(yīng)期，降低應(yīng)激反應(yīng)

本次規(guī)?；咛ヒ浦舱诞?dāng)?shù)鼐d羊配種季節(jié)，但由于供體羊在相對低海拔的農(nóng)業(yè)種植區(qū)上升到高海拔的牧區(qū)，氣候有些寒冷，室外早晚已結(jié)冰，加之海拔、氣溫、飲水和飼草料變化較大，羊生理、身體尚未完全適應(yīng)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的條件下，進(jìn)行同期發(fā)情、人工授精、胚胎移植等，對供體羊的胚胎質(zhì)量會(huì)有一定影響。